玉米酒精糟毒素的微生物降解研究

王德慧，聶志巖，王少海，張 怡，童應(yīng)凱，商志聰，申丹凝，田 晴，魏雅婷，張乃楠

(天津農(nóng)學(xué)院農(nóng)學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院生物技術(shù)系 天津300384)

0 引 言

近些年來，由于汽油加入部分酒精等原因，我國工業(yè)用燃料乙醇生產(chǎn)量大幅增加，玉米酒精糟是由玉米發(fā)酵生產(chǎn)酒精之后留下的副產(chǎn)物，大量實驗結(jié)果表明，玉米酒精糟所含蛋白質(zhì)高達 26%。喂羊能加速羊的增重，提高羊毛的產(chǎn)量；飼養(yǎng)牛還可以促進生長，提高飼料報酬；飼養(yǎng)奶?？商岣弋a(chǎn)奶量，提升乳脂率。因此，我國已經(jīng)逐漸開始使用玉米酒精糟作為飼養(yǎng)家畜的飼料。它通常被用來替換豆粕畜禽混合飼料，比例高達 30%，并且可以直接用于飼喂給動物，消耗大。然而，玉米中的霉菌毒素幾乎所有都在玉米酒糟內(nèi)積累，所以其中霉菌毒素含量很高。常規(guī)的解毒方法包括堿處理法、氧化處理方法、高溫方法、吸附劑方法，以及一種抗氧化劑的方法。然而，這些方法有一系列缺點，如破壞營養(yǎng)、不完全解毒、成本高，解毒的效果在實際使用中并不理想。因此，生物脫毒技術(shù)逐步成為研究的焦點，該技術(shù)主要利用微生物的代謝產(chǎn)物，例如酶類，分解破壞產(chǎn)生低毒或無毒的降解產(chǎn)物。微生物及生物酶脫毒因為具有解毒效率高、特異性強、對飼料以及環(huán)境無污染等優(yōu)點而備受研究者重視。目前，各種微生物，包括細菌、放線菌和酵母，已被發(fā)現(xiàn)具有降解毒素的能力。由于生物方法是在溫和的條件下進行處理，從而使毒素的毒性減小，具有對原料的感官性狀、適口性、營養(yǎng)物質(zhì)影響較小，而且解毒效率高、特異性較強、對飼料和環(huán)境沒有污染的特點和優(yōu)勢，近年來備受關(guān)注[1]。

黃曲霉毒素(AFT)是主要由黃曲霉寄生曲霉產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，在濕熱地區(qū)的食品和飼料中出現(xiàn)黃曲霉毒素的可能性非常高。黃曲霉毒素在土壤、動物、植物中廣泛存在，是一類致癌物質(zhì)，對人體健康極為有害。

伏馬菌素(FM)是串珠鐮刀菌在一定溫度和濕度條件下產(chǎn)生的一類霉菌毒素，多見于糧食和飼料中。需要特別指出的是，玉米作為主要的糧食，最容易感染伏馬菌素[2]。伏馬毒素可引起多種動物疾病，如馬白質(zhì)軟化病、豬肺水腫綜合征、實驗性大鼠腎癌和肝癌等，并且被認為與人類食管癌和神經(jīng)管缺陷的發(fā)生率有很大關(guān)系。

嘔吐毒素(DON)源于鐮刀菌屬，屬于單端孢霉烯族化合物，是最常見的玉米類型污染物。當(dāng)人類和動物攝取含嘔吐毒素的食物后，可引起一系列的急性中毒癥狀，如食欲不振、嘔吐、腹瀉、發(fā)燒、站立不穩(wěn)和反應(yīng)遲鈍，嚴重損害造血系統(tǒng)。不同動物對嘔吐毒素的敏感程度大不相同，豬是對嘔吐毒素最為敏感的動物，斷奶仔豬對其非常敏感[3]。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

酵母19-1：天津農(nóng)學(xué)院微生物實驗室保藏菌種。

斜面培養(yǎng)基：YEPD1%，酵母膏 2%，蛋白胨2%，葡萄糖，加入 2%瓊脂粉。pH 值=6.0(滅菌條件：121℃，20min)。

種子培養(yǎng)基：YEPD 1%，酵母膏 2%，蛋白胨2%，葡萄糖。pH值=6.0(滅菌條件：121℃，20min)。

發(fā)酵培養(yǎng)基：酒糟、麩皮、水、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、硫酸銨、葡萄糖(滅菌條件：105℃，40min)。

1.2 儀器與設(shè)備

恒溫振蕩培養(yǎng)箱、微孔板酶標(biāo)儀、高壓蒸汽滅菌鍋、鼓風(fēng)干燥箱、電子分析天平、超凈工作臺、漩渦振蕩儀、恒溫培養(yǎng)箱。

毒素測定試劑盒：嘔吐毒素(DON)試劑盒、伏馬菌素(FM)試劑盒、黃曲霉毒素(AFT)試劑盒均為山東綠都生物科技有限公司出品。

1.3 測定方法

從石蠟油封存的保存菌種中挑取一環(huán)菌種接入斜面培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng) 20h，再對其重復(fù)上述操作2次，然后接入種子培養(yǎng)基中，(取40mL培養(yǎng)基放入250mL廣口三角瓶)放入搖床，培養(yǎng)條件：30℃，200rpm/min，20h。

接種量為 5%，分別接入配方不同的發(fā)酵培養(yǎng)基中(配方如表1)，充分混勻后，放入恒溫培養(yǎng)箱中30℃培養(yǎng) 72h。發(fā)酵結(jié)束后，放入烘箱，75℃烘干10h以上直至質(zhì)量不再減少，研磨，放入自封袋中，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 正交試驗方法

以9g酒精糟和1g麩皮為底物，對硫酸銨、水、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、葡萄糖5種添加劑進行L16(54)的正交試驗，確定其最佳固態(tài)發(fā)酵配方，正交表設(shè)計如表1和表2所示。

由于部分成分加入量相對較少，將各因素配制成溶液，不僅極大減小了誤差，而且方便添加。

表2 正交試驗實施表Tab.2 Implementation table of orthogonal test

取10g硫酸銨加無菌水定容至100mL；取0.1g硫酸鎂加無菌水定容至100mL；取1.0g磷酸二氫鉀加無菌水定容至100mL。

將表2各處理號試劑分別加入刻度試管，置于以9g酒精糟和 1g麩皮為底物的固體培養(yǎng)基中，充分攪拌，高壓滅菌后，進行接種，攪拌均勻。接種完成后，將樣品放入30℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)72h，測定嘔吐毒素，伏馬毒素和黃曲霉毒素的具體含量。對正交試驗結(jié)果進行分析，選出最佳培養(yǎng)基配方。

1.5 測定方法

酶聯(lián)免疫標(biāo)記法(ELISA)：將所需試劑從冷藏環(huán)境中取出，待其完全升至室溫(20～25℃)后方可使用。按照試劑盒說明書進行具體操作，最后用酶標(biāo)儀立即測定450nm處的吸光值。

2 結(jié)果與分析

2.1 試驗結(jié)果

通過正交試驗，測定發(fā)酵后 3種毒素的剩余量，用極差分析方法選出最佳培養(yǎng)基配方，結(jié)果如表3所示。通過對正交試驗結(jié)果進行分析，得到以下結(jié)果：

①降解黃曲霉毒素總量的最優(yōu)組合為A1B3C1D3E1，即硫酸銨0%，水14mL，硫酸鎂0%，磷酸二氫鉀0.1%，葡萄糖0%，可降解61%的黃曲霉毒素。

②降解伏馬毒素的最優(yōu)組合為 A1B2C4D2E1，即硫酸銨 0%，水 12mL，硫酸鎂 0.015%，磷酸二氫鉀0.05%，葡萄糖0%，可降解77.8%的伏馬毒素。

③降解嘔吐毒素的最優(yōu)組合為 A1B4C2D1E3，即硫酸銨 0%，水 16mL，硫酸鎂 0.05%，磷酸二氫鉀0%，葡萄糖2%，可降解88%的嘔吐毒素。

④由于黃曲霉毒素總量在原酒糟中就沒有超標(biāo)，因此在尋找最優(yōu)搭配時可忽略此毒素。

⑤為從嘔吐毒素和伏馬菌素中選出一個最優(yōu)組合，將DON的組合帶入FM中去，發(fā)現(xiàn)效果不好，而將FM的組合帶入DON中去，發(fā)現(xiàn)效果較好。

2.2 最佳配方重復(fù)試驗結(jié)果驗證

最佳配方重復(fù)實驗做2組：依照上述的固體培養(yǎng)基制備方法，稱取 9g酒精糟和 1g麩皮，以此為底物，加入硫酸銨0%，水 12mL，硫酸鎂0.015%，磷酸二氫鉀 0.05%，葡萄糖 0%，滅菌后接入 5%酵母菌液，30℃培養(yǎng)72h。

按照上述測定方法，對 3種毒素進行測定，發(fā)現(xiàn)測定結(jié)果高于正交試驗降解率，因此，此配方為最佳配方。

表3 正交試驗結(jié)果分析Tab.3 Analysis results of orthogonal test

3 討論與結(jié)論

3.1 避免操作不當(dāng)產(chǎn)生誤差

操作時室溫嚴格控制在規(guī)定范圍內(nèi)，溫度和時間應(yīng)按說明書規(guī)定力求準(zhǔn)確，因此每人操作時一次不宜多于兩塊板；每一種液體試劑使用前必須搖勻，加樣時應(yīng)將所加物加在板孔底部，避免加在孔壁上部，不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡。

3.2 試驗因素的選擇

硫酸銨在培養(yǎng)中，能為酵母菌提供適量氮源；磷酸二氫鉀主要起的是緩沖 pH值的作用，同時在培養(yǎng)基中增加磷和鉀的成分；硫酸鎂中鎂元素是許多酶的活化劑，能促進碳水化合物的新陳代謝、核酸的合成、磷酸鹽的轉(zhuǎn)化等；葡萄糖是自然界分布最廣且最為重要的一種單糖，是一種多羥基醛，在生物學(xué)領(lǐng)域具有重要地位，是活細胞的能量來源和新陳代謝中間產(chǎn)物，即生物的主要供能物質(zhì)。

4 結(jié) 論

本實驗以酒糟和麩皮為發(fā)酵底物，測試酵母19-1對嘔吐毒素、伏馬菌素、黃曲霉毒素的降解效果，進行正交試驗結(jié)果確定最佳實驗結(jié)果，酵母 19-1降解玉米酒糟毒素的最優(yōu)搭配組合為 A1B2C4D2E1即：硫酸銨 0%，水 12mL，硫酸鎂 0.015%，磷酸二氫鉀0.05%，葡萄糖0%。