分段發(fā)酵模式對(duì)郫縣豆瓣甜瓣子發(fā)酵過程中微生物及產(chǎn)品品質(zhì)的影響

李雄波，鄧維琴，李 恒,2，范智義，李潔芝,2，陳 功,2,*

（1.四川省食品發(fā)酵工業(yè)研究設(shè)計(jì)院有限公司，四川 成都 611130；2.四川東坡中國(guó)泡菜產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院，四川 眉山 620030）

郫縣豆瓣是以蠶豆、辣椒、面粉和食鹽等為原料釀制而成的傳統(tǒng)調(diào)味品，其生產(chǎn)工藝包括3 個(gè)重要發(fā)酵階段：紅辣椒→辣椒胚發(fā)酵階段、蠶豆→甜瓣子發(fā)酵階段和辣椒胚-甜瓣子混合發(fā)酵階段[1]。其中，蠶豆→甜瓣子發(fā)酵階段又可分為制曲和甜瓣子發(fā)酵兩個(gè)重要工序，制曲是指蠶豆瓣經(jīng)漂燙處理后與面粉、曲精混合發(fā)酵制得豆瓣曲的過程[2]，甜瓣子發(fā)酵則是指豆瓣曲與一定比例鹽水混合后發(fā)酵得到成熟甜瓣子的過程[3]。甜瓣子作為郫縣豆瓣重要的物質(zhì)成分之一，傳統(tǒng)釀造工藝以自然發(fā)酵為主，該方式發(fā)酵周期一般在6 個(gè)月以上，有的甚至超過1 a。因此，部分企業(yè)為縮短發(fā)酵時(shí)間，采用高溫（30～40 ℃）發(fā)酵，但高溫條件下優(yōu)勢(shì)微生物迅速增殖，而其他微生物生長(zhǎng)弱勢(shì)，加之發(fā)酵時(shí)間較短，導(dǎo)致高溫發(fā)酵甜瓣子風(fēng)味不如自然發(fā)酵甜瓣子風(fēng)味醇厚[4]。

溫度是影響發(fā)酵進(jìn)程和產(chǎn)品品質(zhì)的重要因素。日本高鹽稀態(tài)發(fā)酵醬油普遍采用低溫發(fā)酵工藝，即先10～15 ℃發(fā)酵15～30 d，然后溫度上升至25～30 ℃繼續(xù)發(fā)酵3～12 個(gè)月[5]。張海珍[6]研究發(fā)現(xiàn)日式低溫型高鹽稀態(tài)發(fā)酵工藝所釀醬油產(chǎn)品品質(zhì)好，尤其是風(fēng)味化合物種類和含量較高，但發(fā)酵周期較長(zhǎng)。張靈[7]研究發(fā)現(xiàn)采用先低溫后高溫發(fā)酵的豆瓣醬，其營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和理化指標(biāo)均優(yōu)于先高溫后低溫發(fā)酵豆瓣醬，且先低溫后高溫發(fā)酵模式能有效縮短發(fā)酵時(shí)間。這主要是由于豆瓣醬在先低溫后高溫發(fā)酵過程中細(xì)菌菌群組成更豐富[8]。此外，食鹽含量也是影響發(fā)酵的重要因素之一。食鹽含量過高會(huì)抑制酶活性及酵母菌、乳酸菌等有益微生物的生長(zhǎng)，延長(zhǎng)發(fā)酵周期；食鹽含量過低則對(duì)雜菌抑制作用弱，導(dǎo)致腐敗菌滋生[9]。Su等[10]認(rèn)為NaCl對(duì)蛋白酶活性有很強(qiáng)的抑制作用，當(dāng)NaCl從5%提高到14%，蛋白酶活性下降73%。本項(xiàng)目組前期研究結(jié)果表明，甜瓣子中食鹽含量越低，發(fā)酵速度越快，但低鹽甜瓣子（食鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%和9%）存在總酸含量過高、產(chǎn)品品質(zhì)較差等弊端[3]。

本研究在借鑒日式低溫型醬油發(fā)酵工藝基礎(chǔ)上，結(jié)合項(xiàng)目組前期研究成果，合理調(diào)整甜瓣子發(fā)酵過程中溫度和食鹽含量，建立2 種“先低鹽后高鹽、先低溫后高溫”的分段發(fā)酵模式，并比較發(fā)酵特性，以期為企業(yè)改善甜瓣子品質(zhì)提供一定理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蠶豆、食鹽、面粉 市售；曲精（米曲霉3.042）濟(jì)寧玉園生物有限公司；平板計(jì)數(shù)瓊脂、孟加拉紅培養(yǎng)基（生化試劑） 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；氫氧化鈉、碳酸氫鈉、鄰苯二甲酸氫鉀、37%甲醛溶液、鹽酸（均為分析純） 成都市科隆化學(xué)品有限公司；組胺、腐胺、酪胺、尸胺、色胺、苯乙胺、精胺、亞精胺、乙腈、脯氨酸（均為色譜純）美國(guó)Sigma-Aldrich公司；丹磺酰氯（色譜純） 美國(guó)霍尼韋爾公司；正己烷、甲醇、丙酮（均為色譜純） 德國(guó)Merck公司；4-甲基-2-戊醇（色譜純） 阿法埃莎（中國(guó)）化學(xué)有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

GCMS-QP2010氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatographmass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用儀 日本島津公司；DB-WAX色譜柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm） 美國(guó)安捷倫公司；固相微萃取裝置（50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭） 美國(guó)Supelco公司；LC-2030高效液相色譜儀日本島津公司；DZKW-4恒溫水浴鍋 北京中興偉業(yè)儀器有限公司；PHSJ-4F型pH計(jì) 梅特勒型-托利多國(guó)際貿(mào)易（上海）有限公司；SW-CJ-2F超凈工作臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；LDZF-75L-H高壓蒸汽滅菌鍋上海申安醫(yī)療器械廠；SPX-150B-4生化培養(yǎng)箱 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.3 方法

1.3.1 制曲

參考陳廷廷等[2]方法進(jìn)行，并稍作調(diào)整。將蠶豆瓣放入沸水中漂燙3 min后立即撈出，用冷水冷卻到室溫，瀝干水分后與17%面粉和0.003%曲精混勻（均以干蠶豆瓣計(jì)），平鋪于簸箕內(nèi)，蓋上棉布，放入30 ℃曲房中制曲48 h，12 h翻曲一次，即得豆瓣曲。

1.3.2 甜瓣子發(fā)酵

每組稱取2.5 kg豆瓣曲和2.5 kg鹽水混勻制得醬醅，通過調(diào)節(jié)食鹽添加量控制醬醅中的食鹽含量，醬醅裝入玻璃缸中后轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)箱進(jìn)行發(fā)酵。分段發(fā)酵模式1：前期食鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%，12 ℃發(fā)酵12 d；中期食鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%，37 ℃發(fā)酵4 d；后期食鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%，37 ℃發(fā)酵14 d。分段發(fā)酵模式2：前期和中期食鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為9%，其余條件與模式1相同。對(duì)照組采用傳統(tǒng)高溫發(fā)酵工藝，即在食鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%條件下，37 ℃發(fā)酵30 d。定期對(duì)甜瓣子進(jìn)行攪動(dòng)養(yǎng)護(hù)，并取樣以供檢測(cè)分析使用。其中，模式1和模式2前期低溫低鹽發(fā)酵，主要是為了抑制各類微生物的生長(zhǎng)，保證蛋白酶等酶類充分水解底物，為后續(xù)微生物進(jìn)一步發(fā)酵奠定基礎(chǔ)；中期高溫低鹽發(fā)酵，促進(jìn)有益酵母菌和乳酸菌的生長(zhǎng)代謝[11]，使得氨基酸態(tài)氮及其他風(fēng)味物質(zhì)含量迅速提升；后期高溫高鹽發(fā)酵，高鹽條件抑制雜菌的生長(zhǎng)，高溫條件促進(jìn)甜瓣子后熟。

1.3.3 理化指標(biāo)的測(cè)定

總酸含量的測(cè)定：根據(jù)GB 5009.235—2016《食品中氨基酸態(tài)氮的測(cè)定》中酸度計(jì)法。

氨基酸態(tài)氮含量的測(cè)定：根據(jù)GB 5009.235—2016《食品中氨基酸態(tài)氮的測(cè)定》中酸度計(jì)法。

1.3.4 微生物總數(shù)的測(cè)定

細(xì)菌總數(shù)的測(cè)定：根據(jù)GB 4789.2—2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》中方法稍作調(diào)整，對(duì)甜瓣子中細(xì)菌總數(shù)計(jì)數(shù)用含有0.003%納他霉素的平板計(jì)數(shù)培養(yǎng)基傾注培養(yǎng)。

霉菌總數(shù)的測(cè)定：根據(jù)GB 4789.15—2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)》中平板計(jì)數(shù)法進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.3.5 揮發(fā)性成分的測(cè)定

參照鄧維琴等[12]描述的頂空固相微萃取-GC-MS聯(lián)用技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，并稍作調(diào)整，在樣品中加入2 μL 0.5 μg/mL的4-甲基-2-戊醇溶液作為內(nèi)標(biāo)物。揮發(fā)性化合物的鑒定由NIST11譜庫檢索結(jié)果與人工圖譜解析共同確定，化合物含量采用內(nèi)標(biāo)進(jìn)行半定量分析。

1.3.6 生物胺的測(cè)定

根據(jù)陳功等[13]建立的豆瓣醬中生物胺高效液相色譜法進(jìn)行測(cè)定。

1.3.7 感官評(píng)價(jià)

選取10 名（男5 名，女5 名）經(jīng)過一定甜瓣子感官評(píng)定訓(xùn)練的人員組成評(píng)價(jià)小組，評(píng)價(jià)人員從香氣、滋味、色澤、體態(tài)4 個(gè)方面對(duì)甜瓣子進(jìn)行感官評(píng)分，以平均分作為產(chǎn)品指標(biāo)的評(píng)分。感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 甜瓣子的感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Criteria for sensory evaluation of broad bean paste mash

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用Excel 2010進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用Origin 2010進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 甜瓣子發(fā)酵過程中微生物數(shù)量的變化

圖1 不同發(fā)酵模式下甜瓣子中霉菌總數(shù)（A）和細(xì)菌總數(shù)（B）的變化Fig.1 Changes in mold count (A) and total bacterial count (B) in broad bean paste mash in different fermentation modes

米曲霉被普遍認(rèn)為是豆醬、面醬、郫縣豆瓣以及韓國(guó)大醬等發(fā)酵食品中的優(yōu)勢(shì)微生物[4]。如圖1A所示，發(fā)酵起始時(shí)甜瓣子中霉菌總數(shù)在6.90（lg（CFU/g））左右。對(duì)照組中霉菌總數(shù)在整個(gè)發(fā)酵過程都呈逐漸下降的趨勢(shì)，發(fā)酵結(jié)束時(shí)霉菌總數(shù)為6.15（lg（CFU/g）），這與黃豆醬中霉菌變化規(guī)律一致[14]。分段發(fā)酵模式1和模式2中霉菌總數(shù)先穩(wěn)定在6.89～7.12（lg（CFU/g））之間，之后快速下降，這主要是由于發(fā)酵中期溫度升高，微生物代謝活躍，有機(jī)酸、CO2等代謝產(chǎn)物不斷積累，造成發(fā)酵體系中酸度增加，含氧量下降，使得霉菌開始快速消亡，這在其他醬類產(chǎn)品中也常有報(bào)道[14-15]。此外，后期食鹽含量提高，高鹽環(huán)境不利于霉菌的生長(zhǎng)[16]，進(jìn)一步加速了霉菌的消亡。模式1和模式2中霉菌開始快速消亡的時(shí)間分別在12 d和16 d，這種差異是由于模式2發(fā)酵前中期食鹽含量相對(duì)較高，其發(fā)酵速度不及模式1，有害代謝產(chǎn)物積累速度較慢所致。

傳統(tǒng)發(fā)酵食品的發(fā)酵速度和產(chǎn)品品質(zhì)與細(xì)菌的數(shù)量、菌群等密切相關(guān)[17]。如圖1B所示，起始發(fā)酵時(shí)甜瓣子中細(xì)菌總數(shù)較高，在7.27～7.36（lg（CFU/g））之間。對(duì)照組中細(xì)菌總數(shù)呈先下降后緩慢上升至趨于平穩(wěn)的變化趨勢(shì)，發(fā)酵結(jié)束時(shí)細(xì)菌總數(shù)為7.10（lg（CFU/g）），和本項(xiàng)目組前期研究結(jié)果一致[3]，其主要原因是發(fā)酵過程中不耐受高溫高鹽條件的細(xì)菌逐漸消亡，而耐受性較強(qiáng)的細(xì)菌逐漸成為優(yōu)勢(shì)菌群。2 種分段發(fā)酵模式中細(xì)菌總數(shù)變化情況相似，發(fā)酵前中期（0～16 d）細(xì)菌總數(shù)在7.25～7.36（lg（CFU/g））之間小范圍波動(dòng)，發(fā)酵后期（16～30 d）細(xì)菌總數(shù)逐漸下降，發(fā)酵結(jié)束時(shí)分別為7.08（lg（CFU/g））和6.98（lg（CFU/g））。模式1和模式2前期發(fā)酵體系處于低溫環(huán)境，微生物生長(zhǎng)代謝活動(dòng)較弱，細(xì)菌數(shù)量波動(dòng)較??；發(fā)酵中期溫度升高，有利于乳酸菌和酵母菌等微生物的代謝[11]，但乳酸菌和酵母菌的代謝產(chǎn)物又抑制了部分菌株的生長(zhǎng)[18-19]，因此細(xì)菌數(shù)量整體趨于穩(wěn)定；發(fā)酵后期，由于食鹽含量升高，不耐鹽的菌株生長(zhǎng)被抑制，因此細(xì)菌總數(shù)呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。

2.2 甜瓣子發(fā)酵過程中理化指標(biāo)的變化

總酸是衡量甜瓣子品質(zhì)的重要理化及衛(wèi)生指標(biāo)，郫縣豆瓣醬中限量為2.0%[20]。同時(shí)，甜瓣子中總酸主要由各種有機(jī)酸組成，是重要的滋味物質(zhì)和多種風(fēng)味物質(zhì)的前體物質(zhì)。如圖2A所示，對(duì)照組中總酸含量在發(fā)酵前期（0～12 d）快速上升，中后期（12～30 d）則逐漸趨于穩(wěn)定，發(fā)酵結(jié)束時(shí)總酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.87%，與劉永琪[21]研究豆瓣醬中總酸變化情況一致。分段發(fā)酵模式1和模式2中，總酸含量在發(fā)酵前期（0～12 d）變化趨勢(shì)與對(duì)照組一致，但兩者總酸含量始終略低于對(duì)照組，這是由發(fā)酵溫度和食鹽含量的差異導(dǎo)致。3 種發(fā)酵模式前期，甜瓣子中總酸含量均快速上升，這是由于發(fā)酵初期體系中蛋白酶、淀粉酶等各類酶系含量豐富，使得淀粉、蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)快速水解形成單糖、氨基酸等小分子物質(zhì)，而乳酸菌、酵母菌等微生物能快速利用這些小分子物質(zhì)產(chǎn)生有機(jī)酸等酸性物質(zhì)[22-23]。發(fā)酵中后期（12～30 d），模式1和模式2中總酸含量變化情況與對(duì)照組顯著不同，兩者總酸含量先快速上升后逐漸趨于平穩(wěn)，發(fā)酵結(jié)束時(shí)總酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.96%和0.92%。有研究表明，低鹽甜瓣子（食鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%和9%）發(fā)酵過程中總酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)遠(yuǎn)超過限量值2.0%，產(chǎn)品有明顯酸味，品質(zhì)較差[3]。本研究模式1和模式2中總酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于限量值2.0%，符合產(chǎn)品品質(zhì)要求，且模式1和模式2中總酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)明顯高于對(duì)照組，這可為甜瓣子中酯類化合物形成提供物質(zhì)基礎(chǔ)，使其風(fēng)味更加濃郁。

圖2 不同發(fā)酵模式下甜瓣子中總酸（A）和氨基酸態(tài)氮（B）質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化Fig.2 Changes in total acid (A) and amino acid nitrogen (B) contents of broad bean paste mash in different fermentation modes

甜瓣子中氨基酸態(tài)氮主要來自蛋白酶分解原料中蛋白質(zhì)形成，其是重要的風(fēng)味物質(zhì)，與甜瓣子的色、香、味等密切相關(guān)，是衡量甜瓣子品質(zhì)和發(fā)酵程度的最主要指標(biāo)。如圖2B所示，對(duì)照組甜瓣子中氨基酸態(tài)氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)在發(fā)酵前期（0～12 d）快速增加，由0.17%增加至0.65%，之后隨著發(fā)酵的進(jìn)行氨基酸態(tài)氮含量幾乎穩(wěn)定，與劉永琪[21]研究結(jié)果一致。這主要是由于制曲階段以米曲霉為代表的微生物大量繁殖產(chǎn)生蛋白酶[24]，因此發(fā)酵初期蛋白酶活性相對(duì)較高，分解蛋白質(zhì)產(chǎn)氨基酸能力較強(qiáng)，但是隨著發(fā)酵的進(jìn)行，高溫高鹽條件使得蛋白酶逐漸失活，因此氨基酸態(tài)氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)未能進(jìn)一步增加。模式1和模式2中氨基酸態(tài)氮含量變化情況在發(fā)酵前期（0～12 d）與對(duì)照組幾乎一致，雖然模式1和模式2中鹽含量相對(duì)更低，但發(fā)酵溫度也更低，低溫不是酶作用的最適溫度[25]，因此3 種發(fā)酵模式初期蛋白酶水解反應(yīng)速率差異不大。然而，模式1和模式2中氨基酸態(tài)氮含量在發(fā)酵中期（12～16 d）快速上升，這是由于低溫條件可以長(zhǎng)時(shí)間保留酶的活性[26]，當(dāng)發(fā)酵中期溫度升高時(shí)，酶促反應(yīng)速率顯著提高。發(fā)酵后期（16～30 d），模式1和模式2中氨基酸態(tài)氮含量呈緩慢下降或保持穩(wěn)定的趨勢(shì)，這主要是由于蛋白酶失活和美拉德反應(yīng)消耗氨基酸所導(dǎo)致[21]。發(fā)酵結(jié)束時(shí)，模式1、模式2和對(duì)照組中氨基酸態(tài)氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.76%、0.83%、0.66%，其中模式1和模式2中氨基酸態(tài)氮含量高于對(duì)照組，在一定程度上更有利于甜瓣子風(fēng)味及色澤的形成。

2.3 生物胺含量分析

生物胺是一類具有生物活性的脂肪族、芳香族或雜環(huán)結(jié)構(gòu)的含氮低分子質(zhì)量有機(jī)化合物[26]，在人體生長(zhǎng)發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用[27]，但過量攝入可能會(huì)引發(fā)中毒等健康問題[28]。根據(jù)實(shí)際情況，部分學(xué)者建議食品中生物胺總量應(yīng)不超過1 000 mg/kg[28]。本項(xiàng)目組前期研究發(fā)現(xiàn)，低鹽甜瓣子發(fā)酵過程中生物胺含量超過限量，這主要是由于甜瓣子發(fā)酵過程中微生物菌群高度復(fù)雜多樣，潛在產(chǎn)胺微生物眾多，加之低鹽條件對(duì)微生物抑制作用較弱，因此容易導(dǎo)致生物胺污染。

圖3 不同發(fā)酵模式甜瓣子中生物胺含量Fig.3 Contents of biogenic amines in broad bean paste mash in different fermentation modes

圖3 為發(fā)酵結(jié)束時(shí)甜瓣子中生物胺含量情況，模式1、模式2和對(duì)照組甜瓣子中生物胺總量分別為122.93、126.50、176.12 mg/kg，三者均未超過1 000 mg/kg。Chun等[16]研究發(fā)現(xiàn)，韓國(guó)大醬中食鹽含量越低，生物胺含量越高。模式1和模式2發(fā)酵前期和中期均處于低鹽環(huán)境，但生物胺總量卻低于對(duì)照組，說明分段發(fā)酵可以保障產(chǎn)品中生物胺含量在安全范圍內(nèi)。有研究表明，發(fā)酵溫度越接近微生物生長(zhǎng)代謝的最適溫度，越有利于微生物代謝形成生物胺[29]。分段發(fā)酵過程中，甜瓣子長(zhǎng)時(shí)間處于低溫環(huán)境，不利于微生物分泌生物胺，而對(duì)照組整個(gè)發(fā)酵過程都處于37 ℃環(huán)境中，從而導(dǎo)致微生物代謝形成生物胺較旺盛。對(duì)照組甜瓣子中8 種生物胺均被檢出，其中主要的生物胺為腐胺、尸胺、組胺、酪胺及亞精胺，含量分別為33.89、18.44、37.37、36.80、20.45 mg/kg。曾雪晴等[30]研究郫縣豆瓣醬中生物胺時(shí)發(fā)現(xiàn)，郫縣豆瓣醬中生物胺總量范圍在86.85～611.83 mg/kg之間，腐胺、尸胺、組胺及酪胺是豆瓣中主要的生物胺，與對(duì)照組中結(jié)果較為相似。模式1和模式2甜瓣子中生物胺含量及組成相似，模式1發(fā)酵甜瓣子中腐胺、尸胺和酪胺為主要的生物胺，含量分別為36.79、13.35、46.06 mg/kg，色胺未檢出；模式2發(fā)酵甜瓣子中腐胺和酪胺為主要的生物胺，含量分別為32.12、70.24 mg/kg，色胺和組胺未檢出。此外，對(duì)照組甜瓣子中組胺含量較高（37.37 mg/kg），與部分學(xué)者建議食品中組胺限量50～100 mg/kg[28]較為接近，可能存在一定風(fēng)險(xiǎn)；而分段發(fā)酵模式1和模式2甜瓣子中組胺含量較低或未檢出?？傊?，與對(duì)照組相比，分段發(fā)酵（模式1、模式2）甜瓣子中生物胺總含量更低，種類更少。

2.4 揮發(fā)性成分分析

甜瓣子中揮發(fā)性成分包括酯類、醇類、醛酮類、酚類、酸類和雜環(huán)類等化合物[31]。通過GC-MS分析3 種模式發(fā)酵甜瓣子中揮發(fā)性成分，總離子流圖見圖4，揮發(fā)性成分種類及含量見表2，GC-MS分析結(jié)果見表3。

圖 4不同發(fā)酵模式甜瓣子中揮發(fā)性成分GC-MS總離子流圖Fig.4 GC-MS total ion current chromatogram of volatile components in broad bean paste mash in different fermentation modes

由圖4可知，3 種發(fā)酵模式甜瓣子中揮發(fā)性成分離子出峰時(shí)間較類似，但強(qiáng)度存在較大差異，表明有共同揮發(fā)性成分，但含量差異較大。由表2、3可知，3 種發(fā)酵模式甜瓣子中檢測(cè)鑒定出39 種揮發(fā)性成分，其中共有成分14 種，包括3-甲基-1-丁醇、2-乙基-1-己醇、芳樟醇、苯乙醇、3-烯丙基-6-甲氧基苯酚、壬醛、苯甲醛、丙酮、乙酸、3-甲基丁酸、2,2,4-三甲基-1,3-戊二醇二異丁酸酯、十六烷酸甲酯、十四烷和二十一烷。結(jié)合劉平[32]和李治華[33]等研究結(jié)果表明，芳樟醇、苯乙醇、壬醛和苯甲醛等是郫縣豆瓣的特征風(fēng)味物質(zhì)之一。

表2 不同發(fā)酵模式甜瓣子中揮發(fā)性成分種類及含量Table 2 Types and contents of volatile components in broad bean paste mash in different fermentation modes

表3 不同發(fā)酵模式甜瓣子中揮發(fā)性成分GC-MS分析結(jié)果Table 3 GC-MS analysis of volatile compounds of broad bean paste mash in different fermentation modes

對(duì)照組中共鑒定出20 種揮發(fā)性成分，總含量為19.61 ng/g，其中含量較高的化合物主要有3-甲基-1-丁醇、2-乙基-1-己醇、苯乙醇、丙酮、乙酸、2,2,4-三甲基-1,3-戊二醇二異丁酸酯、亞油酸乙酯。董丹等[34]從發(fā)酵2 個(gè)月甜瓣子中檢測(cè)出85 種揮發(fā)性成分，其中亞油酸乙酯、苯乙醇、乙酸、異戊酸等含量較高，與本研究存在一定異同，可能是發(fā)酵時(shí)間不同導(dǎo)致。模式1中共鑒定出26 種揮發(fā)性成分，總含量為31.85 ng/g，模式2中共鑒定出30 種揮發(fā)性成分，總含量為24.60 ng/g，兩者主要差異是模式1中酯類化合物種類和含量更豐富，而模式2中醇類化合物含量更高。3 種發(fā)酵模式甜瓣子中揮發(fā)性成分主要以醇類、醛酮類、酸類和酯類為主；而酚類和烷烴類含量較低，且三者之間差異較小。模式2中醇類化合物含量最高，而模式1中最低，但模式1中苯乙醇含量較高（1.09 ng/g），苯乙醇被認(rèn)為是醬類產(chǎn)品中主要香氣成分之一[32]，其能賦予產(chǎn)品花香和蜂蜜氣味等香氣[31]。醛酮類化合物屬于不穩(wěn)定的羰基類化合物，能賦予產(chǎn)品一定的花果香[35]，使甜瓣子整體風(fēng)味更醇厚。模式1和模式2中醛酮類化合物種類豐富，含量較高，而對(duì)照組中醛酮類化合物種類和含量都不及模式1和模式2。酸類化合物給甜瓣子帶來不愉快的味道，一般只起調(diào)和作用[34]，模式1和模式2中酸類化合物含量較高，可能給甜瓣子風(fēng)味帶來不利影響。酯類化合物是甜瓣子中主要的呈香成分，其能賦予甜瓣子特殊的甜香和果香[35]，同時(shí)能很好地掩蓋甜瓣子中有機(jī)酸帶來的不愉快氣味[36]。模式1、模式2和對(duì)照組中分別鑒定出酯類化合物7、5、3 種，含量分別為10.34、2.71、2.71 ng/g，模式1中酯類化合物含量是模式2和對(duì)照組的3.8 倍。甜瓣子中酯類主要通過高級(jí)脂肪酸和醇酯化反應(yīng)形成[34]，這也可能是導(dǎo)致模式1中醇類化合物含量較低的原因。模式1甜瓣子中揮發(fā)性成分總含量最高，尤其是酯類化合物，而模式2中揮發(fā)性成分總含量次之，但化合物種類最多。Chun等[16]研究發(fā)現(xiàn)，低鹽大醬中揮發(fā)性成分含量高、種類多，與微生物生長(zhǎng)密切相關(guān)。分段發(fā)酵（模式1、模式2）過程中，環(huán)境因素不斷變化，為微生物多樣性提供更多可能，復(fù)雜的菌群結(jié)構(gòu)有利于多種代謝產(chǎn)物的形成，這些代謝產(chǎn)物再經(jīng)過后期發(fā)酵過程中的各種化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生了較多種類的風(fēng)味物質(zhì)。

2.5 感官評(píng)定

表4 不同發(fā)酵模式甜瓣子的感官評(píng)分Table 4 Sensory evaluation scores of broad bean paste mash in different fermentation modes

感官評(píng)定是對(duì)產(chǎn)品品質(zhì)最直觀地反映，因此對(duì)不同模式發(fā)酵的甜瓣子產(chǎn)品進(jìn)行感官評(píng)定，結(jié)果如表4所示。可以看出，3 種發(fā)酵模式下，甜瓣子樣品在色澤、香氣、滋味和組織形態(tài)方面存在一些異同。模式1甜瓣子樣品感官評(píng)定得分最高（80.61±0.87），其醬酯香較濃郁，味鮮醇厚；模式2甜瓣子樣品得分次之（75.7±0.82），其體態(tài)和滋味與模式1差異較小，但香氣不及模式1甜瓣子濃郁；對(duì)照組甜瓣子樣品得分最低（62.46±1.11），其醬酯香和鮮味都不及分段發(fā)酵（模式1、模式2）甜瓣子，且略帶霉味，表明對(duì)照組甜瓣子還未完全發(fā)酵成熟，延長(zhǎng)發(fā)酵時(shí)間，其感官品質(zhì)能有所提升。此外，郫縣豆瓣要求瓣粒酥脆，但分段發(fā)酵（模式1、模式2）的甜瓣子產(chǎn)品質(zhì)地偏軟，在組織形態(tài)方面存在一定不足。整體而言，分段發(fā)酵的甜瓣子感官品質(zhì)優(yōu)于對(duì)照組，尤其分段發(fā)酵模式1發(fā)酵的甜瓣子產(chǎn)品。

3 結(jié) 論

以傳統(tǒng)高溫發(fā)酵為對(duì)照，研究了2 種分段發(fā)酵模式（模式1、模式2）對(duì)甜瓣子發(fā)酵過程中微生物及產(chǎn)品品質(zhì)的影響。結(jié)果表明，不同發(fā)酵模式條件下，發(fā)酵過程中微生物數(shù)量變化情況存在顯著差異，進(jìn)而導(dǎo)致不同模式發(fā)酵的甜瓣子產(chǎn)品品質(zhì)指標(biāo)差異。發(fā)酵結(jié)束時(shí)，模式1、模式2和對(duì)照組甜瓣子中總酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.96%、0.92%、0.87%，氨基酸態(tài)氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.76%、0.83%、0.66%，三者總酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)均低于限量值2.0%，產(chǎn)品品質(zhì)符合要求，而分段發(fā)酵（模式1、模式2）甜瓣子中氨基酸態(tài)氮含量更高，則有助于提升產(chǎn)品品質(zhì)。此外，分段發(fā)酵（模式1、模式2）甜瓣子中揮發(fā)性成分種類更多，含量更高，尤其是模式1發(fā)酵甜瓣子中揮發(fā)性成分含量最高。感官評(píng)價(jià)結(jié)果顯示，模式1發(fā)酵甜瓣子醬香濃郁，味鮮醇厚，整體感官品質(zhì)最佳，模式2發(fā)酵甜瓣子次之，對(duì)照組則最差。3 種模式發(fā)酵的甜瓣子中生物胺含量均遠(yuǎn)低于建議限量1 000 mg/kg，且分段發(fā)酵甜瓣子生物胺污染的風(fēng)險(xiǎn)更低。分段發(fā)酵模式1和模式2條件下甜瓣子均能正常發(fā)酵，產(chǎn)品符合有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，與對(duì)照組相比，分段發(fā)酵能進(jìn)一步改善產(chǎn)品品質(zhì)，且模式1優(yōu)于模式2。因此，本研究推薦的一種理想的分段發(fā)酵模式為：前期食鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%，12 ℃發(fā)酵12 d；中期食鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%，37 ℃發(fā)酵4 d；后期食鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%，37 ℃發(fā)酵14 d。