脲酶抑制劑與硝化抑制劑對(duì)稻田土壤硝化、反硝化功能菌的影響

張文學(xué)，王少先，夏文建，孫 剛，劉增兵，李祖章，劉光榮

（江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料與資源環(huán)境研究所/農(nóng)業(yè)部雙季稻營(yíng)養(yǎng)與農(nóng)業(yè)環(huán)境觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站/國(guó)家紅壤改良工程技術(shù)研究中心，南昌 330200）

尿素是一種高濃度的酰胺態(tài)氮肥，因其較高的含氮量被作為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上最常用的氮肥，但是尿素施入農(nóng)田后會(huì)導(dǎo)致氮素?fù)p失是一直被關(guān)注的。硝化-反硝化作用是稻田氮素?fù)p失的重要途徑[1]，而且硝化、反硝化一般是緊密相連、相繼發(fā)生的，又被稱(chēng)為成對(duì)硝化和反硝化過(guò)程[2]，這兩個(gè)反應(yīng)過(guò)程被證明均由土壤微生物所驅(qū)動(dòng)[3]。

硝化作用可分為兩步：氨氧化過(guò)程 (NH3→NO2-)與亞硝酸鹽氧化過(guò)程 (NO2-→NO3-)，氨氧化過(guò)程被認(rèn)為是硝化作用的限速步驟[3-7]。氨氧化過(guò)程又可以分兩步為NH3→NH2OH→NO2-，且分別由氨單加氧酶(ammonia monooxygenase，AMO) 與羥胺氧化還原酶(hydroxylamine oxidoreductase，HAO) 催化完成[8]。氨單加氧酶是一種胞內(nèi)酶，由基因amoA、amoB和amoC編碼的三個(gè)亞基組成，由于amoA基因的序列具有一定的保守性，且所編碼的蛋白亞基含有該酶的活性位點(diǎn)，因此常被作為氨單加氧酶的功能標(biāo)記基因[4-5]。氨氧化細(xì)菌 (ammonia oxidizing bacteria，AOB)、氨氧化古菌 (ammonia-oxidizing archaea，AOA) 作為氨氧化的主要完成者，均含有編碼氨單加氧酶的基因amoA、amoB和amoC[9]，且amoA基因被作為研究AOB與AOA的標(biāo)記基因。反硝化作用(NO3-→NO2-→NO→N2O→N2) 一般發(fā)生在嫌氣或低氧的環(huán)境，硝酸鹽在硝酸鹽還原酶 (Nar)、亞硝酸鹽還原酶 (Nir)、NO還原酶 (Nor) 和N2O還原酶 (Nos) 的催化作用下依次還原為NO2-、NO、N2O、N2，對(duì)編碼以上四種酶的功能基因主要有narG、nirK/nirS、norB、nosZ[3,10]，由于亞硝酸鹽還原酶 (Nir) 催化的反應(yīng)是反硝化過(guò)程中關(guān)鍵的限速步驟，因此，關(guān)于編碼該酶的功能基因nirK和nirS的研究也較多，主要用作反硝化微生物群落的分子標(biāo)記物[11]，而且，研究發(fā)現(xiàn)nirK基因?qū)Νh(huán)境因子的響應(yīng)較nirS基因更靈敏[12-13]。

由于脲酶抑制劑可以通過(guò)抑制脲酶活性以達(dá)到延緩尿素水解為銨態(tài)氮的目的，硝化抑制劑可以抑制銨態(tài)氮的硝化作用，從而減少NO3-的形成、淋失以及隨后的反硝化損失[14-15]，二者常被用在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上提高氮肥利用率[16-17]。有報(bào)道指出，參與硝化、反硝化菌的群落結(jié)構(gòu)以及豐度對(duì)土壤養(yǎng)分、pH、溫度等理化性狀的變化有著靈敏的響應(yīng)[3,18-19]。但關(guān)于兩種抑制劑及其配施對(duì)稻田硝化與反硝化菌群結(jié)構(gòu)、豐度的影響報(bào)道較少。本文以南方紅壤稻田為研究對(duì)象，在添加脲酶抑制劑NBPT與硝化抑制劑DMPP之后，研究了分蘗期與孕穗期土壤中銨態(tài)氮、硝態(tài)氮含量、amoA與nirK基因豐度以及AOB、AOA與反硝化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的變化，旨在進(jìn)一步揭示抑制劑的作用機(jī)理及其對(duì)土壤環(huán)境的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地點(diǎn)

試驗(yàn)于2012年4—7月在江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料與資源環(huán)境研究所南昌試驗(yàn)基地 (28°21′12″N，115°54′25″E) 進(jìn)行。該區(qū)屬于亞熱帶濕潤(rùn)氣候，海拔高度20 m，平均氣溫17.8℃，≥ 10℃的積溫為5432℃，無(wú)霜期長(zhǎng)達(dá)240～307 d，年降水量1662 mm，降水季節(jié)分配不均，全年降水50%以上集中在4—6月。供試土壤為第四紀(jì)紅粘土發(fā)育的潮砂泥田，土壤質(zhì)地為壤土。播種前土壤有機(jī)質(zhì)含量20.12 g/kg，全氮含量2.06 g/kg、硝態(tài)氮含量1.8 mg/kg、銨態(tài)氮含量16.2 mg/kg、有效磷2.6 mg/kg、速效鉀94.55 mg/kg、pH 4.97、土壤容重為1.19 g/cm3。

1.2 供試材料與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

水稻供試品種為株兩優(yōu)30，脲酶抑制劑為NBPT (N-丁基硫代磷酰三胺)，硝化抑制劑為DMPP(3,4-二甲基吡唑磷酸鹽)。供試肥料品種：氮肥為尿素 (含N 46%)、磷肥為鈣鎂磷肥 (含P2O512%)、鉀肥為氯化鉀 (含K2O 60%)。

試驗(yàn)共設(shè)5個(gè)處理：1) 不施氮肥 (CK)；2) 尿素(U)；3) 尿素 + 脲酶抑制劑 (U + UI)；4) 尿素 + 硝化抑制劑 (U + NI)；5) 尿素 + 脲酶抑制劑 + 硝化抑制劑 (U + UI + NI)。設(shè)3次重復(fù)，各小區(qū)隨機(jī)區(qū)組排列，每個(gè)小區(qū)面積30 m2(5 m × 6 m)，各小區(qū)以50 cm的分隔行隔開(kāi)，且保持小區(qū)間的田埂高出地面40 cm，并用塑料薄膜包裹田埂以防止相互串水串肥，實(shí)現(xiàn)各小區(qū)獨(dú)立排灌的管理目的。試驗(yàn)氮 (N)、磷(P2O5)、鉀 (K2O) 用量分別為 135 kg/hm2、75 kg/hm2和150 kg/hm2。抑制劑與尿素混勻施入，抑制劑用量為尿素的1%。氮肥和磷肥作基肥于移栽前一次性施入；鉀肥分3次施入，40%作基肥，30%作分蘗肥，30%作孕穗肥。試驗(yàn)于2012年3月10日播種，4月23日移栽，7月20日收獲，水稻種植密度以及各項(xiàng)栽培管理措施同當(dāng)?shù)剞r(nóng)民習(xí)慣。

樣品采集：在水稻分蘗期、孕穗期分別采集各小區(qū)耕層土壤，一部分保存于4℃冰箱用于測(cè)定土壤銨態(tài)氮、硝態(tài)氮含量，另一部分保存于-20℃用于土壤DNA提取，分析AOB、AOA以及反硝化細(xì)菌的基因豐度與群落結(jié)構(gòu)。

1.3 樣品測(cè)定與數(shù)據(jù)分析

1.3.1 土壤中銨態(tài)氮與硝態(tài)氮含量的測(cè)定 土壤中的銨態(tài)氮與硝態(tài)氮含量用1 mol/L的KCl溶液浸提，采用全自動(dòng)間斷化學(xué)分析儀 (Smartchem TM200 discrete chemistry analyzer) Smartchem 200測(cè)定。

1.3.2 土壤微生物總DNA的提取 將土壤樣品按照土壤DNA提取試劑盒 (Fast DNA SPIN Kit for soil MP-bio，USA) 的說(shuō)明進(jìn)行操作，并用0.7% (w/v) 的瓊脂糖檢驗(yàn)DNA，提取成功的樣品保存于-20℃冰箱待用。

1.3.3 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (PCR) 對(duì)提取成功的DNA模板進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (polymerase chain reaction，PCR)，運(yùn)用特異性引物對(duì)土壤中特定微生物的DNA片段進(jìn)行擴(kuò)增。AOB與AOA的amoA基因所用的擴(kuò)增引物分別為amoA-1F/amoA-2R[20]與Crenamo A23f/Crenamo A616r[21-22]，反硝化細(xì)菌的nirK基因所用的引物為F1aCu/R3Cu[23]，具體引物序列以及PCR反應(yīng)程序見(jiàn)表1。PCR反應(yīng)體系共25 μL：12.5 μL 的 2 × EasyTaq PCR SuperMix (TransGen 生物技術(shù)公司，中國(guó)北京)，0.5 μL的上、下引物和1 μL稀釋10倍的DNA模板，10.5 μL的滅菌雙蒸水，終體積為25 μL。在MyCycler熱循環(huán)儀 (Bio-Rad公司)進(jìn)行PCR反應(yīng)，所有PCR產(chǎn)物采用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)PCR擴(kuò)增反應(yīng)的效果。

1.3.4 熒光定量PCR AOB、AOA的amoA基因和nirK基因的定量PCR利用熒光定量PCR儀Bio-Rad iQ5 (Bio-Rad，USA) 分析，運(yùn)行程序按定量試劑盒說(shuō)明書(shū)執(zhí)行。PCR體系包括：5 μL SYBR Green I PCR Mix (TaKaRa，Dalian，China)，0.2 μL 的引物，0.8 μL DNA 模板，終體積為10 μL。AOB、AOA的amoA基因和nirK基因定量PCR所用引物見(jiàn)表1。含有目標(biāo)基因片段的質(zhì)粒從108—102進(jìn)行10倍濃度梯度連續(xù)稀釋制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過(guò)溶解曲線確定定量PCR的擴(kuò)增特異性；每個(gè)樣品重復(fù)3次。反應(yīng)結(jié)束后，運(yùn)行程序會(huì)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線以及樣品的Ct值(每個(gè)樣品管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)) 定量計(jì)算出樣品的起始拷貝數(shù)。

表1 PCR引物序列及反應(yīng)程序Table 1 Primers and conditions used for the conventional PCR

1.3.5 變性梯度凝膠電泳 (DGGE) 聚丙烯酰胺濃度為8% (w/v)，AOB、AOA與nirK型反硝化細(xì)菌的DGGE變性濃度分別為50%～70%、30%～50%與45%～65%。在1倍TAE緩沖液中，75 V電壓、60℃條件下電泳16 h，電泳后用1 μL的SyBR green I (Invitrogen) (稀釋10000倍) 核酸染料染色30 min，然后用Bio-Rad成像系統(tǒng) (Bio-Rad，USA)拍照。DGGE圖譜采用Quantity One軟件分析樣品的電泳條帶特征，聚類(lèi)分析采用UPGMA運(yùn)算法則。

1.3.6 序列比較與系統(tǒng)發(fā)育分析 將DGGE圖譜中的優(yōu)勢(shì)菌群切膠回收純化，并用表1中相應(yīng)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化后測(cè)序[生工生物工程 (上海) 股份有限公司]，測(cè)序得到的序列信息輸入NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov) 通過(guò)Blast與Gene Bank中的已知序列比對(duì)，確定序列的微生物種類(lèi)，并運(yùn)用MEGA6.0軟件的鄰接法 (Neighbor joining method) 進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2007整理后，采用SAS9.1軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；PCR-DGGE成像用quantity one軟件分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤銨態(tài)氮與硝態(tài)氮含量

稻田土壤中的銨態(tài)氮含量明顯高于硝態(tài)氮的含量(圖1)。在水稻分蘗期，與處理U相比，處理U +UI和U + UI + NI的銨態(tài)氮含量顯著降低，而處理U +NI與處理U相比無(wú)顯著差異，這可能由于NBPT減緩了尿素水解，顯著降低了此時(shí)土壤的銨態(tài)氮含量，而單獨(dú)添加DMPP則無(wú)此效應(yīng)。在孕穗期，所有處理的土壤銨態(tài)氮含量較分蘗期的均急劇下降，可能是由于分蘗期到孕穗期水稻快速生長(zhǎng)對(duì)氮肥的大量吸收所致；施氮肥的四個(gè)處理相比，添加NBPT的處理U + UI與U + UI + NI的銨態(tài)氮含量明顯高于處理U與U + NI的，這可能由于NBPT此時(shí)已分解，失去了對(duì)脲酶活性的抑制作用，尿素進(jìn)一步水解，增加了銨態(tài)氮的含量，可為水稻的后期生長(zhǎng)提供充足的氮源。

與土壤銨態(tài)氮含量相比，硝態(tài)氮含量極低，且同一時(shí)期內(nèi)處理間的差異均不顯著 (P＞ 0.05)，這說(shuō)明添加NBPT雖然顯著降低了分蘗期土壤中銨態(tài)氮的含量，但是對(duì)于硝態(tài)氮含量沒(méi)有顯著影響，這可能由于淹水條件下硝化作用極弱，導(dǎo)致銨態(tài)氮的含量對(duì)硝化作用無(wú)明顯影響，同理，硝化抑制劑DMPP對(duì)硝化反應(yīng)的影響也很微弱。

2.2 土壤硝化、反硝化菌豐度

處理間AOB的amoA基因拷貝數(shù)存在顯著差異(圖2)。在分蘗期，AOB的amoA基因拷貝數(shù)范圍在2.0 × 106～3.4 × 106copies/g，施氮處理中 AOB 的amoA基因拷貝數(shù)顯著高于不施氮處理；處理U +NI與U + UI + NI的amoA基因拷貝數(shù)顯著低于處理U和U + UI。這說(shuō)明施用氮肥顯著增加了分蘗期稻田土壤中AOB的豐度，然而添加硝化抑制劑DMPP能夠有效抑制AOB的生長(zhǎng)。在孕穗期，所有施氮處理相比CK均增加了土壤amoA基因拷貝數(shù)，而施用氮肥4個(gè)處理間無(wú)顯著差異，說(shuō)明施用氮肥對(duì)孕穗期的AOB生長(zhǎng)依然有促進(jìn)作用，但DMPP對(duì)AOB的抑制作用已消失，可能此時(shí)DMPP的時(shí)效性已過(guò)。

圖3顯示，AOA的amoA拷貝數(shù)范圍在17.3 ×106～20.5 × 106copies/g之間，是氨氧化細(xì)菌amoA基因拷貝數(shù)的6.1～10.2倍，說(shuō)明在紅壤稻田AOA在數(shù)量上居于主導(dǎo)地位；AOA的amoA基因拷貝數(shù)在分蘗期明顯高于孕穗期的，說(shuō)明生育期對(duì)AOA的豐度有明顯影響，而所有處理間始終無(wú)顯著差異，說(shuō)明AOA的豐度對(duì)施用氮肥、NBPT以及DMPP均無(wú)明顯響應(yīng)。

圖1 土壤銨態(tài)氮與硝態(tài)氮含量Fig.1 Contents of NH4+-N and NO3--N in soils

圖2 土壤氨氧化細(xì)菌 (AOB)amoA基因拷貝數(shù)Fig.2 Ammonia-oxidizing bacterial (AOB)amoAgene copy numbers in soils

圖3 土壤氨氧化古菌 (AOA)amoA基因拷貝數(shù)Fig.3 Ammonia-oxidizing archaeal(AOA)amoAgene copy numbers in soils

圖4 土壤反硝化細(xì)菌nirK基因拷貝數(shù)Fig.4 Denitri fi ernirKgene copy numbers in soils

由圖4可知，nirK基因拷貝數(shù)在21.0 × 107～36.3 × 107copies/g之間，在分蘗期與孕穗期，施氮肥處理的nirK基因拷貝數(shù)均顯著高于不施氮肥的，而處理U、U + UI、U + NI與U + UI + NI在分蘗期或孕穗期均無(wú)顯著差異，說(shuō)明施用氮肥可以顯著提高nirK型反硝化細(xì)菌的豐度，而脲酶抑制劑NBPT或硝化抑制劑DMPP對(duì)此無(wú)明顯影響。分蘗期的nirK基因拷貝數(shù)均顯著高于孕穗期的，可能主要原因是孕穗期土壤中氮肥的消耗導(dǎo)致反硝化細(xì)菌的響應(yīng)，另外，不同生育期土壤生態(tài)環(huán)境的變化對(duì)此也存在有一定程度的影響。從三種菌群豐度來(lái)看，古菌amoA/細(xì)菌amoA拷貝數(shù)比值大于6.1，而nirK/(細(xì)菌amoA+ 古菌amoA) 拷貝數(shù)比值大于11.1，這可能由于稻田特定的生態(tài)環(huán)境所決定。

2.3 土壤銨態(tài)氮、硝態(tài)氮含量與硝化、反硝化菌豐度的相關(guān)性

由表2可知，AOB的豐度與分蘗期銨態(tài)氮、硝態(tài)氮以及孕穗期的銨態(tài)氮含量呈極顯著正相關(guān) (P＜0.01)，說(shuō)明AOB對(duì)氮肥的施入有靈敏的響應(yīng)，而且對(duì)氨氧化作用有重要的貢獻(xiàn)；另外，因?yàn)镹BPT對(duì)土壤NH4+-N含量有明顯的調(diào)節(jié)作用，因此推測(cè)NBPT對(duì)AOB的豐度也有著間接的影響。AOB的豐度與孕穗期的硝態(tài)氮含量相關(guān)性不顯著，可能由于此時(shí)硝態(tài)氮含量過(guò)低所致。

AOA豐度與兩個(gè)時(shí)期的土壤銨態(tài)氮、硝態(tài)氮含量的相關(guān)性均不顯著 (P＞ 0.5)，表明AOA比較穩(wěn)定，對(duì)氮肥的施入沒(méi)有明顯響應(yīng)。

反硝化細(xì)菌與分蘗期銨態(tài)氮、硝態(tài)氮以及孕穗期的銨態(tài)氮含量呈極顯著正相關(guān) (P＜ 0.01)，這與AOB的規(guī)律相似。以上結(jié)果說(shuō)明，AOB與反硝化細(xì)菌對(duì)氮肥的施入反應(yīng)靈敏，而AOA則比較穩(wěn)定。

2.4 硝化、反硝化菌的群落結(jié)構(gòu)特征

運(yùn)用變性梯度凝膠電泳 (DGGE) 的方法研究AOB的群落結(jié)構(gòu)。首先利用引物amoA-1F/amoA-2R對(duì)AOB的amoA基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物再通過(guò)DGGE分析，得到相應(yīng)的DGGE圖譜 (圖5)。與不施氮肥相比，施用氮肥對(duì)分蘗期與孕穗期AOB的群落結(jié)構(gòu)均有明顯影響，主要表現(xiàn)為優(yōu)勢(shì)條帶明顯增多。在分蘗期，CK處理的主要條帶包括B3和B4，施用氮肥的4個(gè)處理還明顯增強(qiáng)了B1和B2條帶的信號(hào)強(qiáng)度；然而，單施氮肥處理與添加了抑制劑的處理 (U與U + NI、U + UI、U + UI + NI)之間AOB的圖譜差異不大，且條帶B2和B3信號(hào)強(qiáng)度均較高，表明B2與B3是施氮肥稻田土壤中AOB的優(yōu)勢(shì)菌群。此外，我們發(fā)現(xiàn)不同生育期對(duì)AOB群落結(jié)構(gòu)的影響在處理CK的差異比較明顯，分蘗期處理CK的優(yōu)勢(shì)條帶為B3，而在孕穗期優(yōu)勢(shì)條帶轉(zhuǎn)變?yōu)锽2，表明隨著時(shí)間的推移，土壤AOB優(yōu)勢(shì)菌群是動(dòng)態(tài)變化的，這可能與氣候條件變化或者土壤養(yǎng)分的消耗有關(guān)。優(yōu)勢(shì)菌群B3在孕穗期時(shí)，所有處理的信號(hào)均明顯變?nèi)?，這可能由于條帶B3所代表的AOB對(duì)氮肥的響應(yīng)更靈敏，隨氮肥的減少，B3豐度明顯下降。經(jīng)聚類(lèi)分析 (UPGMA) 的結(jié)果表明，所有處理分為兩大類(lèi)，分蘗期的CK處理和孕穗期的CK單獨(dú)一簇，其余處理聚為一簇，兩個(gè)時(shí)期所有施用氮肥處理的AOB群落結(jié)構(gòu)的相似度大于68%，表明施用氮肥顯著影響了AOB的群落結(jié)構(gòu)，而脲酶抑制劑NBPT和硝化抑制劑DMPP對(duì)AOB群落結(jié)構(gòu)的影響較小。

表2 土壤銨態(tài)氮、硝態(tài)氮含量與硝化、反硝化菌豐度的相關(guān)性Table 2 Relations between contents of NH4+-N and NO3--N with abundances of AOB, AOA and denitrifying bacteria in soils

圖5 氨氧化細(xì)菌amoA基因的DGGE圖譜及其聚類(lèi)分析Fig.5 DGGE profile and clustering analysis of DGGE patterns of ammonia-oxidizing bacterialamoAgene

對(duì)AOB的DGGE凝膠上的4個(gè)條帶進(jìn)行切膠純化測(cè)序，所得序列經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)的BLAST比對(duì)分析后發(fā)現(xiàn)，所有序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中來(lái)源于土壤的氨氧化細(xì)菌amoA基因的相似性大于96%。將檢測(cè)到的4個(gè)基因序列及其相似序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù) (圖6)可知，B1與B3聚為一簇，二者同源性較高，B2與B4各自為一簇；與B1和B3同源性較高的序列有來(lái)源于砂壤土的亞硝化單胞菌目 (Nitrosomonadales)以及來(lái)源于紅壤、酸性土壤、湖泊的氨氧化細(xì)菌amoA基因；與B2同源性較高的序列有來(lái)源于土壤的亞硝化螺菌屬 (Nitrosospirasp.) 以及來(lái)源于稻田氨氧化細(xì)菌的amoA基因；與B4同源性較高的序列有來(lái)源于土壤的亞硝化螺菌屬以及亞硝化葉菌屬(Nitrosolobus multiformis)。

圖6 amoA基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.6 Phylogenetic tree of ammonia-oxidizing bacterialamoAsequences from DGGE bands using neighbor-joining analysis

圖7 氨氧化古菌amoA基因的DGGE圖譜及其聚類(lèi)分析Fig.7 DGGE profile and clustering analysis of ammonia-oxidizing archaealamoAgene

利用引物crenamoA 23fd和crenamoA 616rd對(duì)AOA的amoA基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，隨后進(jìn)行DGGE分析，相應(yīng)的DGGE圖譜見(jiàn)圖7。所有處理均包括6條主要的條帶 (A1—A6)，說(shuō)明這6條帶是稻田土壤中AOA的優(yōu)勢(shì)菌群。相比AOB的群落結(jié)構(gòu)變化，各處理對(duì)AOA的群落沒(méi)有明顯影響；兩個(gè)時(shí)期間也無(wú)顯著變化，說(shuō)明該稻田土壤中AOA對(duì)不同施肥處理以及環(huán)境變化不敏感，在水稻不同生育期間較為穩(wěn)定。聚類(lèi)分析 (UPGMA) 的結(jié)果表明，兩個(gè)時(shí)期所有處理的氨氧化古菌群落結(jié)構(gòu)的相似度大于77%，說(shuō)明施用氮肥、脲酶抑制劑NBPT以及硝化抑制劑DMPP對(duì)AOA的群落結(jié)構(gòu)均無(wú)明顯影響。

對(duì)AOA的DGGE凝膠上的6個(gè)條帶進(jìn)行切膠純化測(cè)序，所得序列經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)的BLAST比對(duì)分析后發(fā)現(xiàn)，與數(shù)據(jù)庫(kù)中AOA的amoA基因相似度高于92%，將目的序列及其相似的序列建立系統(tǒng)發(fā)育樹(shù) (圖8)，所有條帶被分為兩大類(lèi)：條帶A2、A5與A3、A6聚為一簇，A1、A4聚為一簇，說(shuō)明A2、A5、A3、A6序列同源性較高，A1與A4的序列同源性較高；與A2、A5同源性較高的序列主要來(lái)自于酸性土壤，與A3、A6同源性較高的序列主要來(lái)源于紅壤以及稻田AOA的amoA基因；而與A1、A4聚為一簇的主要來(lái)自于玉米地及沉積物AOA的amoA基因等。

利用引物F1aCu/R3Cu對(duì)反硝化細(xì)菌的nirK基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并進(jìn)行DGGE分析 (圖9)，所有處理在分蘗期的條帶數(shù)明顯多于孕穗期的，其中條帶K1、K2、K3、K5與K7信號(hào)強(qiáng)度最為強(qiáng)烈，說(shuō)明包含這5類(lèi)nirK基因的細(xì)菌是該稻田土壤中nirK型反硝化菌的優(yōu)勢(shì)菌群；施用氮肥以及不同抑制劑對(duì)分蘗期的反硝化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)沒(méi)有明顯影響。在孕穗期，所有處理的各條帶均明顯變?nèi)?，尤其是不施肥處理下，可?jiàn)條帶更為稀疏，說(shuō)明此時(shí)nirK型反硝化細(xì)菌的豐度明顯下降，這可能與此時(shí)氮肥已大量消耗有關(guān)，因?yàn)榉聪趸?xì)菌對(duì)氮肥有靈敏的響應(yīng)[12]。聚類(lèi)分析 (UPGMA) 的結(jié)果表明，兩個(gè)時(shí)期所有處理的反硝化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)被分為三大類(lèi)：孕穗期的CK處理單獨(dú)一簇，其余處理的聚為一簇，分蘗期的所有處理聚為一簇，說(shuō)明不同生育期對(duì)nirK型反硝化菌群落結(jié)構(gòu)有著明顯的影響。以上結(jié)果說(shuō)明，水稻生育期以及施用氮肥對(duì)nirK型反硝化菌群落結(jié)構(gòu)有明顯影響，而兩種抑制劑則無(wú)此效應(yīng)，這說(shuō)明兩種抑制劑的作用具有專(zhuān)一性，對(duì)反硝化細(xì)菌無(wú)明顯影響。

對(duì)反硝化細(xì)菌nirK基因DGGE凝膠上的7個(gè)條帶進(jìn)行切膠測(cè)序分析，所得序列經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)的BLAST比對(duì)分析，建立系統(tǒng)發(fā)育樹(shù) (圖10)，系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)明顯的分為兩簇，大多數(shù)條帶 (K1、K2、K3、K4、K5和K6) 分布在第一簇中，這一簇的nirK基因序列主要來(lái)源于農(nóng)田、高山草甸、稻田等，而K7單獨(dú)分布在另一簇，與其它nirK基因遺傳距離較遠(yuǎn)。

3 討論

脲酶抑制劑可以提高氮素利用率[16,24]，本研究表明，添加NBPT (或NBPT與DMPP配施) 延緩了尿素水解，顯著提高了水稻孕穗期土壤中的銨態(tài)氮含量，為水稻后期生長(zhǎng)提供充足氮肥，這可能是其增產(chǎn)增效的主要原因，而單獨(dú)添加DMPP則無(wú)此效應(yīng)，說(shuō)明稻田不適宜單獨(dú)添加硝化抑制劑。

圖8 氨氧化古菌amoA基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.8 Phylogenetic tree of ammonia-oxidizing archaealamoAsequences from DGGE bands using neighbor-joining analysis

圖9 反硝化細(xì)菌nirK基因的DGGE圖譜及其聚類(lèi)分析Fig.9 DGGE profile and clustering analysis of denitrifying bacterialnirKgene

有研究表明，土壤養(yǎng)分、pH以及施肥制度等環(huán)境因素對(duì)AOB、AOA的生長(zhǎng)繁殖有不同程度的影響[25-28]。農(nóng)田施入氮肥可明顯促進(jìn)AOB的生長(zhǎng)[29]，增加其豐度[30-31]，而對(duì)AOA則無(wú)明顯影響[32-33]。不同的硝化抑制劑對(duì)AOB以及AOA的影響不同，有的可顯著抑制AOB的生長(zhǎng)[34-37]，對(duì)AOA沒(méi)有明顯影響[38]；有的則效果相反[39-40]，這可能由于不同抑制劑的作用機(jī)理不盡相同所致，因?yàn)橐种苿┛赏ㄟ^(guò)抑制硝化菌的生長(zhǎng)、呼吸[16,41-42]或活性[16]等多種方式來(lái)發(fā)揮作用。本研究表明，施用氮肥顯著增加了分蘗期與孕穗期稻田土壤中AOB的豐度，然而添加硝化抑制劑DMPP在分蘗期能夠有效抑制AOB的生長(zhǎng)，到孕穗期對(duì)AOB的抑制作用消失，可能此時(shí)DMPP已降解所致。DMPP對(duì)AOA的生長(zhǎng)則始終無(wú)明顯的影響，這可能與本試驗(yàn)地的稻田土壤性質(zhì)以及生態(tài)環(huán)境有關(guān)，或者由于AOA有較強(qiáng)的穩(wěn)定性而導(dǎo)致。由此可知，DMPP在稻田減弱硝化反應(yīng)的主要途徑是通過(guò)抑制AOB的生長(zhǎng)而實(shí)現(xiàn)。添加NBPT對(duì)AOA、AOB的豐度無(wú)明顯影響，證明NBPT僅與土壤中的脲酶結(jié)合起作用，抑制其活性，對(duì)土壤微生物無(wú)明顯的直接影響。

圖10 反硝化細(xì)菌nirK基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.10 Phylogenetic tree of denitrifying bacterialnirKgene based on DGGE band sequences using neighbor-joining analysis

土壤理化性質(zhì)如土壤養(yǎng)分、含水量、pH、有機(jī)質(zhì)等因素同樣影響著反硝化細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)和種群豐度[13,43]。有研究表明，施用氮肥可以明顯提高反硝化細(xì)菌nirK、nirS基因的豐度[12,44-47]。本研究結(jié)果證明，施用氮肥可顯著提高nirK型反硝化細(xì)菌的豐度，隨著氮肥消耗，到孕穗期，所有處理下反硝化細(xì)菌的豐度明顯下降，而添加抑制劑NBPT與DMPP的則沒(méi)有表現(xiàn)出明顯的變化，這說(shuō)明氮肥可直接引起反硝化細(xì)菌的響應(yīng)，不同生育期則可能通過(guò)土壤理化性質(zhì)或土壤微生態(tài)的變化間接地影響反硝化細(xì)菌的豐度，而抑制劑則無(wú)此效應(yīng)，進(jìn)一步說(shuō)明NBPT與DMPP對(duì)土壤環(huán)境的安全性。有報(bào)道指出，DMPP可通過(guò)降低底物濃度而間接影響nirK型反硝化菌的豐度[48]，本研究沒(méi)有監(jiān)測(cè)到此種關(guān)聯(lián)，可能由于所試稻田長(zhǎng)期淹水，反硝化反應(yīng)底物濃度極低所致。

有報(bào)道指出，在水稻田等pH較低的土壤中，AOA的數(shù)量遠(yuǎn)超過(guò)AOB的[49-50]，且在氨氧化過(guò)程中發(fā)揮主導(dǎo)作用[38]，同時(shí)，反硝化細(xì)菌nirK基因的拷貝數(shù)又遠(yuǎn)超過(guò)amoA(AOA + AOB) 基因的拷貝數(shù)[11]。本研究的結(jié)果也表明，古菌amoA/細(xì)菌amoA拷貝數(shù)比值大于6.1，而nirK/(細(xì)菌amoA+ 古菌amoA) 拷貝數(shù)比值大于11.1，與以上結(jié)論一致。

從三種菌群豐度與銨態(tài)氮、硝態(tài)氮含量的相關(guān)性分析來(lái)看，AOB與nirK反硝化細(xì)菌的豐度與分蘗期時(shí)期土壤中銨態(tài)氮、硝態(tài)氮含量以及孕穗期銨態(tài)氮含量呈極顯著正相關(guān)，證明了二者對(duì)氮肥的敏感性，而AOA則沒(méi)有此相關(guān)性，說(shuō)明AOA的穩(wěn)定性，與Chen等報(bào)道一致[32]。由于NBPT對(duì)銨態(tài)氮含量有明顯的調(diào)節(jié)作用，由此推測(cè)，NBPT對(duì)AOB以及反硝化菌也有間接的影響。

施用化肥對(duì)土壤硝化、反硝化菌群落結(jié)構(gòu)及其組成有著明顯的影響[19]。本研究中DGGE指紋圖譜表明，施用氮肥明顯增加了圖譜中AOB的條帶數(shù)，隨著氮肥的消耗，反應(yīng)靈敏的優(yōu)勢(shì)菌群到了孕穗期信號(hào)強(qiáng)度明顯減弱；施用氮肥對(duì)反硝化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響，主要體現(xiàn)在氮肥大量消耗后的孕穗期，此時(shí)，不施氮肥處理的DGGE圖譜中優(yōu)勢(shì)菌群條帶僅剩3條依稀可辨，遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于施氮肥處理的；AOA在兩個(gè)時(shí)期對(duì)氮肥均沒(méi)有明顯的響應(yīng)。另外，抑制劑的施用在DGGE圖譜中也沒(méi)有表現(xiàn)出明顯影響，可能由于DGGE圖譜只是定性地反應(yīng)群落組成，而抑制劑只對(duì)菌群豐度有影響，對(duì)其組成沒(méi)有影響所致。

4 結(jié)論

1) NBPT顯著提高了分蘗期土壤銨態(tài)氮含量，顯著降低了孕穗期的銨態(tài)氮含量，AOB與nirK反硝化細(xì)菌的豐度與土壤中銨態(tài)氮、硝態(tài)氮含量有極顯著正相關(guān)關(guān)系，AOA則與兩種形態(tài)的氮相關(guān)性不顯著，說(shuō)明AOA比較穩(wěn)定，AOB與反硝化細(xì)菌對(duì)氮肥有靈敏的響應(yīng)，尤其是無(wú)機(jī)氮離子，而NBPT可調(diào)節(jié)銨態(tài)氮含量，因此，NBPT對(duì)AOB與nirK反硝化細(xì)菌的豐度可能有著間接的影響。

2) 硝化抑制劑DMPP對(duì)AOB有明顯的抑制作用，但僅表現(xiàn)在分蘗期，孕穗期抑制作用基本消失，而對(duì)AOA以及反硝化細(xì)菌則始終沒(méi)有明顯影響，DMPP在稻田抑制硝化作用的途徑是通過(guò)抑制AOB的生長(zhǎng)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

3) DGGE圖譜直觀地反映了三種菌群對(duì)氮肥的響應(yīng)，AOB與反硝化細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)在施用氮肥下條帶數(shù)明顯增加，而AOA則無(wú)明顯響應(yīng)，再次證明AOB與反硝化細(xì)菌對(duì)氮肥的敏感性以及AOA的穩(wěn)定性。

4) 脲酶抑制劑NBPT對(duì)三類(lèi)微生物的群落結(jié)構(gòu)以及豐度沒(méi)有明顯的直接影響，硝化抑制劑DMPP僅在分蘗期對(duì)AOB的生長(zhǎng)有抑制作用，這說(shuō)明NBPT與DMPP對(duì)土壤生態(tài)的安全性。