傳染性造血器官壞死病毒RT-LAMP檢測方法的建立

韓姝伊，何亞鵬，時(shí) 曉，杜迎春

（1. 河北師范大學(xué)，河北石家莊 050024；2. 北京市水生野生動植物救護(hù)中心，北京 102100）

傳染性造血器官壞死病（infectious haematopoietic necrosis，IHN）是極易對冷水魚養(yǎng)殖造成嚴(yán)重危害的魚類急性全身性傳染病，是世界動物衛(wèi)生組織（OIE）規(guī)定的須通報(bào)動物疫病，是我國的二類動物疫病、一類魚類口岸檢疫疫病[1-2]。目前，該病呈全球分布，在我國以及法國、意大利、德國、英國、日本、韓國、俄羅斯等國家均有暴發(fā)。在我國，IHN 1985年在東北地區(qū)首次報(bào)道發(fā)現(xiàn)，目前在北京、河北、遼寧、吉林、山東、甘肅、青海、四川、新疆、云南等地均有分布，并呈蔓延趨勢[1，3]。IHN病原為彈狀病毒科諾拉彈狀病毒屬的傳染性造血器官壞死病 毒（infectious haematopoietic necrosis virus，IHNV），其形態(tài)為子彈狀，有囊膜包被[2，4]。根據(jù)基因差異，IHNV可分為U、M、L、E和JRt 5個(gè)基因型，其中JRt基因型主要分布于我國以及日本和韓國等亞洲國家[5-7]。IHNV主要危害鮭鱒魚類的魚苗及幼魚，導(dǎo)致魚苗死亡率極高，可達(dá)100%[5-6]。我國近幾年冷水魚養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展迅速，因而需警惕IHNV威脅，及時(shí)做好防控，防止其對冷水魚養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)造成嚴(yán)重危害。

IHN可通過臨床和病理診斷進(jìn)行初步判斷，對其確診則需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)室檢測。目前檢測IHNV的方法主要有病毒分離培養(yǎng)、抗體中和試驗(yàn)、免疫組化法、ELISA以及RT-PCR等[7-9]。這些方法一般費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且對試驗(yàn)平臺要求很高，需要一些專業(yè)設(shè)備。逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（reverse transcription loop-mediated isothermal amplification，RT-LAMP）具有操作簡便、快速、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，不需很專業(yè)的儀器設(shè)備，僅在水浴鍋中即可完成擴(kuò)增，特別適用于基層及現(xiàn)場快速診斷[10]。本研究針對IHNV糖蛋白基因的特定區(qū)域設(shè)計(jì)3對特異性引物，并在反轉(zhuǎn)錄酶和BstDNA聚合酶作用下，對靶序列進(jìn)行等溫核酸擴(kuò)增反應(yīng)，建立了簡單、快速、靈敏度高、特異性好的IHNV檢測方法，從而豐富了實(shí)驗(yàn)室和現(xiàn)場檢測IHNV的手段。

1 材料與方法

1.1 毒株

IHNV BJSY株（GenBank登 錄 號MH374162）：由本實(shí)驗(yàn)室分離保存；鯉春病毒血癥病毒（spring viraemia of carpvirus，SVCV）、牙鲆彈狀病毒（hirame rhabdovirus virus，HRV）滅活病毒：購自美國菌種保藏中心；病毒性出血性敗血癥病毒（viral haemorrhagic septicaemia virus，VHSV）滅活病毒：購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心。

1.2 RT-LAMP 引物設(shè)計(jì)與合成

對GenBank 收錄的多條IHNVG基因序列進(jìn)行比對，選取IHNV特異性保守區(qū)段，利用在線軟件 Primer Explorer V5（http://primerexplorer.jp/e/），針對G基因保守區(qū)設(shè)計(jì)3對RT-LAMP專用引物，序列見表1，引物由華大基因公司合成。將引物均稀釋為20 pmol/μL，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 G基因RT-LAMP 引物序列

1.3 病毒RNA 提取

取200 μL 病毒液于無RNA 酶的離心管中，用Star Spin病毒RNA提取試劑盒（北京康潤誠業(yè)生物科技有限公司）提取病毒RNA，分裝，使用A one 超微量全光譜分光光度計(jì)（北京同立創(chuàng)輝儀器有限公司），測定提取到的病毒樣品RNA 濃度，用DEPC 處理水稀釋RNA樣品為50 μg/mL，置

-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 RT-LAMP 檢測方法建立及優(yōu)化

建立25 μL的RT-LAMP 擴(kuò)增反應(yīng)體系，體系包含對應(yīng)于G基因的6 條引物：F3-G與B3-G各0.5 μL，F(xiàn)IP-G與BIP-G各2 μL，LF-G與LB-G各1 μL，dNTP（10 nmol/L）2.5 μL，10×ThermoPol反 應(yīng) 緩 沖 液 [20 mmol/L Tris-HCl、10 mmol/L KCl、10 mmol/L (NH4)2SO4、2 mmol/L MgSO4、0.1% Triton X-100]2.5 μL，以及 8 UBst2.0 DNA聚合酶（NEB公司），10 U AMV 反轉(zhuǎn)錄酶（諾唯贊生物科技有限公司），1 μL IHNV的RNA樣品（50 μg/mL），用無RNA 酶水補(bǔ)齊至 25 μL，混勻。同樣的體系設(shè)立5個(gè)樣品，分別編號1～5。將5個(gè)樣品分別在61、62、63、64、65 ℃恒溫水浴鍋內(nèi)反應(yīng)40 min，隨后都轉(zhuǎn)移至80 ℃水浴2 min用以滅活BstDNA 聚合酶。反應(yīng)結(jié)束后，將擴(kuò)增產(chǎn)物各加入1 μL 50 倍稀釋的SYBR Green I，輕輕震蕩，直接觀察反應(yīng)液顏色變化，判斷結(jié)果。取4 μL產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖進(jìn)行凝膠電泳，觀察結(jié)果，確定最佳反應(yīng)溫度。

1.5 RT-LAMP 特異性試驗(yàn)

分別取IHNV、SVCV、HRV 和VHSV基因組RNA（50 μg/mL）各1 μL為模板，構(gòu)建RT-LAMP體系，利用建立的RT-LAMP 檢測方法進(jìn)行特異性對比試驗(yàn)，同時(shí)以去離子水為模板，相同體系和條件反應(yīng)作為陰性對照。將擴(kuò)增結(jié)束后產(chǎn)物加入1 μL 50倍稀釋的SYBR Green I，輕輕震蕩，直接觀察反應(yīng)液顏色變化，并利用1.5%瓊脂糖凝膠電泳，對比檢測結(jié)果。

1.6 RT-LAMP 靈敏性試驗(yàn)

將提取的IHNV RNA（50 μg/mL）作10 倍梯度稀釋（5.0×100～5.0×10-5μg/mL），每個(gè)稀釋度各取1 μL構(gòu)建RT-LAMP體系，采用優(yōu)化過的條件進(jìn)行靈敏性試驗(yàn)。將擴(kuò)增產(chǎn)物加入1 μL 50 倍稀釋的SYBR Green I，輕輕震蕩，直接觀察反應(yīng)液顏色變化，并利用1.5%瓊脂糖凝膠電泳，對比檢測結(jié)果，得出該方法能檢測IHNV核酸的最低濃度。

1.7 重復(fù)性試驗(yàn)

利用建立的RT-LAMP 檢測方法，在不同時(shí)間，對同一陽性IHNV的RNA樣品進(jìn)行檢測，同時(shí)設(shè)立陰性對照，以驗(yàn)證本方法的穩(wěn)定性。

1.8 RT-LAMP臨床檢測

從河北省多個(gè)養(yǎng)殖場采集疑似患IHN的虹鱒魚幼魚（體質(zhì)量15 g左右），挑選10條，采集肝組織，分別用Star Spin病毒RNA提取試劑盒提取RNA，編號分別為1～10。各取1～10號RNA樣品1 μL，利用本試驗(yàn)建立的IHNV RTLAMP 進(jìn)行檢測，并利用1.5%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證檢測結(jié)果；同時(shí)對1～10號RNA樣品，利用之前已經(jīng)建立的IHNV RT-PCR方法進(jìn)行檢測[11]。先用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，然后以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，上游引物為5'-CACCGTACTTTGCTGCTAC-3'，下游引物為5'-TCAAGGGGGGAGTCCTCGA-3'，目的片段為786 bp，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR 程序?yàn)椋?4 ℃ 預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 25 s，25 個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸5 min，然后將擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳。觀察結(jié)果，對比分析該方法在臨床檢測上的適用性。

2 結(jié)果與分析

2.1 RT-LAMP 反應(yīng)溫度優(yōu)化

將5組 25 μL 反應(yīng)體系分別在 61、63、65、67、69 ℃恒溫水浴鍋內(nèi)反應(yīng)40 min，隨后轉(zhuǎn)移至80 ℃水浴2 min；各加入1 μL 50 倍稀釋的SYBR Green I，混勻，觀察顏色變化。結(jié)果顯示：當(dāng)擴(kuò)增溫度為61、63、69 ℃時(shí)，擴(kuò)增產(chǎn)物加入SYBR Green I 后仍為SYBR Green I的原始顏色紅棕色（圖1-A），電泳沒有出現(xiàn)階梯狀電泳條帶（圖1-B）；在65、67 ℃時(shí)，擴(kuò)增產(chǎn)物加入SYBR Green I后變?yōu)闊晒饩G色（圖1-A），電泳出現(xiàn)階梯狀電泳條帶（圖1-B）。該顯色結(jié)果與凝膠電泳結(jié)果相符，3次重復(fù)試驗(yàn)的結(jié)果也一致，表明該方法在溫度為65、67 ℃時(shí)可以有效擴(kuò)增，67 ℃時(shí)顏色變化更顯著，條帶更亮，所以本試驗(yàn)將67 ℃作為該方法的最佳擴(kuò)增溫度。

圖1 RT-LAMP反應(yīng)條件優(yōu)化結(jié)果

2.2 RT-LAMP 特異性試驗(yàn)

IHNV、SVCV、HRV和VHSV基因組結(jié)構(gòu)相似，同屬水生動物彈狀病毒，感染魚類后的臨床癥狀也基本相似不易區(qū)分；采用RT-LAMP方法進(jìn)行檢測，也容易受相似核酸模板和一些污染物干擾，導(dǎo)致出現(xiàn)假陽性擴(kuò)增。因此，本試驗(yàn)利用SVCV、HRV、VHSV和ddH2O作對照，檢測該RT-LAMP方法的特異性。結(jié)果顯示：以IHNV RNA為模板進(jìn)行RT-LAMP 擴(kuò)增后，產(chǎn)物加入SYBR Green I，混勻后變?yōu)闊晒饩G色（圖2-A），凝膠結(jié)果呈特異性階梯狀條帶（圖2-B）；以SVCV、HRV、VHSV和ddH2O為模板，按相同體系和條件進(jìn)行RT-LAMP 檢測，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)物呈紅棕色（圖2-A），凝膠電泳無特異性階梯狀條帶出現(xiàn)，結(jié)果為陰性（圖2-B）；進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)結(jié)果一致。上述結(jié)果說明，本試驗(yàn)建立的RT-LAMP 檢測方法具有良好的特異性。

圖2 RT-LAMP 特異性檢測結(jié)果

2.3 RT-LAMP靈敏性試驗(yàn)

分 別 以 5.0×10-3、5.0×10-4、5.0×10-5、5.0×10-6、5.0×10-7、5.0×10-8μg 的 IHNV RNA 為模板，利用建立的RT-LAMP 檢測方法，分析該檢測方法的靈敏性。觀察擴(kuò)增產(chǎn)物加入SYBR Green I后的顏色變化，取4 μL經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，觀察驗(yàn)證可視化檢測結(jié)果。結(jié)果顯示：當(dāng)病毒RNA為 5.0×10-3～5.0×10-7μg 時(shí)進(jìn)行 RT-LAMP 反應(yīng)，產(chǎn)物在加入SYBR Green I 后變成熒光綠色（圖3-A），電泳特異性階梯狀條帶（圖3-B）；當(dāng)病毒RNA為5.0 ×10-8μg時(shí)，產(chǎn)物加入SYBR Green I后顏色不變，仍為紅棕色（圖3-A），電泳也無特異性階梯狀條帶（圖3-B）；進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，結(jié)果一致。上述結(jié)果說明，本試驗(yàn)建立的RTLAMP 檢測方法具有較高的靈敏度，最低可檢測5.0×10-7μg 的 IHNV RNA。

圖3 RT-LAMP 靈敏性檢測結(jié)果

2.4 重復(fù)性試驗(yàn)

經(jīng)過3次重復(fù)性試驗(yàn)，IHNV的RNA樣品均能檢出陽性，而陰性對照無擴(kuò)增，結(jié)果一致，證明本試驗(yàn)所建立的RT-LAMP檢測方法具有良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。

2.5 RT-LAMP 臨床應(yīng)用檢測

將提取的10個(gè)臨床樣品RNA，利用本試驗(yàn)建立的IHNV RT-LAMP 方法進(jìn)行檢測，同時(shí)利用之前已建立的RT-PCR方法進(jìn)行對比檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)1號、4號和5號樣品呈現(xiàn)熒光綠色，樣品中檢出IHNV，其余7個(gè)樣品呈紅棕色，未檢出IHNV（圖4-A）；瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，1號、4號和5樣品出現(xiàn)電泳特異性階梯狀條帶，為IHNV陽性，其余7個(gè)樣品為陰性（圖4-B）。該試驗(yàn)結(jié)果與之前建立的RT-PCR方法檢測結(jié)果一致，1號、4號和5樣品出現(xiàn)786 bp的目的條帶，為陽性（圖4-C），證明RT-LAMP可應(yīng)用臨床檢測。

圖4 臨床樣品檢測結(jié)果

3 討論

IHNV是水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中最嚴(yán)重的病毒性病原之一，感染的魚類主要為冷水魚，如虹鱒、河鱒、太平洋鯡、大西洋鮭、各類大麻哈魚和管吻刺魚等[12-13]。最早報(bào)道的IHNV基因型為U、M、L，主要分布在北美；歐洲流行的毒株主要為基因E型，亞洲的日本、韓國、中國（包括臺灣）流行的毒株主要為JRt型[14-15]。IHNV對魚苗致死率極高，一旦引發(fā)疫情，難以控制。如果IHNV在我國冷水魚養(yǎng)殖地區(qū)長期流行，勢必會蔓延發(fā)展，造成嚴(yán)重危害。為保障相關(guān)經(jīng)濟(jì)魚類養(yǎng)殖和珍稀魚類保護(hù)工作，需要警惕IHN暴發(fā)，采用先進(jìn)方法快速確定病原，及時(shí)做好防控。

近年來，環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP）操作簡單、結(jié)果相對可靠，逐步被廣泛應(yīng)用于病原體檢測。國內(nèi)外已建立了多種病毒的LAMP檢測方法[11，15]。本試驗(yàn)建立的IHNV RT-LAMP檢測方法，可以一步完成反轉(zhuǎn)錄和環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增，降低了中間過程造成的污染風(fēng)險(xiǎn)。該方法針對該病毒G基因保守片段設(shè)計(jì)了3對引物，特異性好，避免了相似彈狀病毒的干擾，又能準(zhǔn)確檢出病毒。該方法利用熒光染料直接染色，通過染料顏色的變化或者凝膠電泳方法就可直接觀察結(jié)果，易于判斷。

濁度分析儀也可以通過檢測LAMP的焦磷酸鹽沉淀來判定LAMP檢測結(jié)果，但在實(shí)際中發(fā)現(xiàn)，該方法的檢測靈敏度較差，不如熒光染料法和電泳法。LAMP方法簡單快捷，具有很多優(yōu)點(diǎn)，適用于基層及現(xiàn)場快速診斷，但由于LAMP方法擴(kuò)增非常高效，容易在空氣中形成核酸片段的氣溶膠污染，在封閉環(huán)境下，長期檢測同類樣品時(shí)容易出現(xiàn)假陽性，因此需要特別注意，防止管內(nèi)的核酸片段擴(kuò)散到封閉環(huán)境的空氣中。如果需要封閉環(huán)境，長期檢測同類樣品，可以在反應(yīng)前將稀釋的SYBR Green I小心加到裝有樣品的PCR管蓋上，待反應(yīng)結(jié)束后，不開蓋，直接離心，使SYBR Green I落入管底，漩渦震蕩混勻后即可觀察顏色變化，這樣可防止開蓋引起的氣溶膠污染，避免假陽性出現(xiàn)。

4 結(jié)論

本研究建立的IHNV RT-LAMP檢測方法，具有操作簡便、快速、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，不需很專業(yè)的儀器設(shè)備，僅在水浴鍋中即可完成擴(kuò)增，適用于基層及現(xiàn)場快速診斷。該方法的建立豐富了實(shí)驗(yàn)室和現(xiàn)場檢測IHNV的手段，對IHN的快速診斷及防控具有重要意義。