恩諾沙星及其代謝物在方正銀鯽組織中的代謝及消除規(guī)律

羅晶晶，鄒榮婕，宋 懌，黃 會，韓典峰，李佳蔚，任傳博，薛敬林，劉慧慧

（1. 山東省海洋資源與環(huán)境研究院，山東省海洋生態(tài)修復(fù)重點實驗室，山東煙臺 264006；2. 煙臺市福山區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，山東煙臺 265500；3. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品質(zhì)量安全控制重點實驗室，北京 100141）

恩諾沙星（Enrofloxacin）屬于第3代喹諾酮類藥物（quinolone）——氟喹諾酮類（ftuoroquinolones）之一，又名乙基環(huán)丙沙星，具有低毒和高效等特點[1-5]，1996年10月獲美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準，成為畜禽和水產(chǎn)專用抗菌藥物。因其具有抗菌譜廣、滲透性強、無交叉耐藥等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于細菌性疾病和支原體感染的治療[1，6]。在水生動物中，恩諾沙星主要用于治療魚類細菌性敗血癥、爛鰓病、赤皮病、腸炎病、白頭白嘴病、打印病和弧菌病等細菌性疾病及甲魚潰瘍病等[2，7-8]。據(jù)統(tǒng)計，恩諾沙星用量在2013年獸用抗菌藥物中排名第四[9]。2015年9月，我國規(guī)定禁止在食品動物中使用洛美沙星、培氟沙星、諾氟沙星和氧氟沙星4種原料藥后，恩諾沙星在養(yǎng)殖生產(chǎn)中更受青睞[10]。與此同時，恩諾沙星在動物中的殘留情況也備受關(guān)注。目前，恩諾沙星體內(nèi)代謝和消除研究的水產(chǎn)動物種類有鲆鰨類[11-13]、鰻鱺（Anguilla）[14-16]、烏鱧（Ophicephalus argus）[17]、黑鮶（Gymnocorymbus ternetzi）[18]、 羅 非 魚（Eriocheir sinensis）[19]、 泥鰍（Oriental weather fish）[20]、異育銀鯽（Carassius auratus gibelio）[21-23]、 蝦（Litopenaeus vanname）[24]和蟹（Eriocheir sinensi）[25]，給藥方式有投喂藥餌和肌注兩種。以上研究多采用《恩諾沙星水產(chǎn)養(yǎng)殖使用規(guī)范》[26]推薦劑量開展研究，但由于恩諾沙星藥物使用頻率高，致病菌藥物敏感性降低[22]，實際生產(chǎn)中存在大劑量用藥現(xiàn)象。

本研究采用魚類養(yǎng)殖中常用的口灌方式，對方正銀鯽（Carassius auratus gibelio）以60 mg/kg.b.w劑量灌服恩諾沙星，分析方正銀鯽各組織中恩諾沙星及其代謝物的代謝及消除規(guī)律，以期為鯽實際養(yǎng)殖生產(chǎn)中恩諾沙星給藥及藥物代謝周期提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗用魚

試驗用方正銀鯽取自山東省濟寧市泉林鎮(zhèn)水庫，體質(zhì)量（250±10）g，體表完整無外傷，健康狀況良好；置于半徑2 m、水深0.8 m的水泥池中養(yǎng)殖。養(yǎng)殖用水為山泉水，水溫范圍為12～15 ℃。試驗期間，通過投放冰水和加熱棒對水溫進行輔助調(diào)節(jié)。每天按魚體質(zhì)量的3%投喂飼料。經(jīng)檢測，試驗用魚、養(yǎng)殖用水及飼料中均不含氟喹諾酮類藥物。

1.2 試劑及藥品

鹽酸恩諾沙星：購自浙江國邦藥業(yè)有限 公 司（ 批 號 獸 藥 字（2013）110132337，純度98.0%）；恩諾沙星標準品：購自德國Dr.Eherestorfer公司（純度99.0%）；環(huán)丙沙星標準品：購自德國Dr.Eherestorfer公司（純度94.0%）；氘代恩諾沙星標準品：購自TRC公司（純度97.9%）；氘代環(huán)丙沙星標準品：購自TRC公司（純度98.0%）；肝素鈉注射液：購自天津生物化學(xué)制藥有限公司（1.25萬單位）；無水硫酸鈉：購自阿拉丁公司（農(nóng)殘級）；乙腈、甲醇和正己烷均為色譜純，甲酸為優(yōu)級純，試驗用水為超純水。

1.3 主要儀器

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：TSQ Endura，美國Thermo公司；超純水儀：Milli-Q Gradient，法國Millipore公司；高速離心機：TGL-10C，上海安亭科學(xué)儀器廠；超聲波清洗器：KQ-600E，昆山市超聲儀器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：R-100，瑞士BUCHI公司。

1.4 藥液配制

稱取9 g鹽酸恩諾沙星，加入800 mL水充分溶解后，再加入適量淀粉和少許紅色食用色素，用水定容配制成1 L恩諾沙星混懸液，混懸液中恩諾沙星含量為9 mg/mL，紅色食用色素作為回吐指示劑。

1.5 試驗設(shè)計

給藥劑量為60 mg/kg.b.w。用2 mL注射器連接軟導(dǎo)管伸入方正銀鯽胃部給藥，給藥后靜置3～5 s放入水中，無回吐者用于試驗。每個時間點灌喂6尾方正銀鯽，分別于給藥后15、30 min，1、3、6、9、12、24、48、72 和 96 h，5、7、9、11、14、17、20、25、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、100和120 d等31個取樣點取樣，取其肌肉、皮膚、肝臟、腎臟和鰓5種組織樣品，充分勻漿后，分別置于封口袋中，于-18 ℃保存待檢。

血漿樣品采集：注射器事先用1%肝素鈉處理，于尾靜脈抽取血液，每尾魚不少于3 mL，收集于5 mL離心管內(nèi)，經(jīng)6 000 r/min離心后取上層血漿，-18 ℃保存。

1.6 檢測方法及色譜、質(zhì)譜條件

1.6.1 檢測方法 參照農(nóng)業(yè)農(nóng)村部1077號公告《水產(chǎn)品中17種磺胺類及15種喹諾酮類藥物殘留量的測定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》，稱?。?.0±0.1）g試樣，加入50 μL氘代恩諾沙星和氘代環(huán)丙沙星混合溶液（10 μg/mL），混勻后靜置10 min；加入10 g無水硫酸鈉，用20 mL酸化乙腈（含1%甲酸）提??；將提取液收集于50 mL梨形瓶中，重復(fù)提取1次；合并2次提取液，于40 ℃水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干；用1 mL甲醇溶液（體積分數(shù)為20%）復(fù)溶，正己烷去脂；過0.22 μm濾膜，供高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。

1.6.2 色譜、質(zhì)譜條件 色譜柱為Hypersil GLOD（100.0 mm×2.1mm）；柱溫為35 ℃；進樣量10 μL。流動相A相為甲醇，B相為水（含0.1%甲酸），流速為0.25 mL/min。梯度洗脫程序見表1。質(zhì)譜條件：離子化模式采用H-ESI，正離子模式；正離子電壓3 500 V，負離子電壓 2 500 V，離子傳輸桿溫度325 ℃，霧化溫度300 ℃，鞘氣（Sheath Gas）40 Arb，輔助氣（Aux Gas）10 Arb，質(zhì)譜掃描方式為SRM，掃描母離子、子離子和碰撞能量見表2。

表1 流動相梯度洗脫程序

表2 選擇反應(yīng)監(jiān)測母離子、子離子和碰撞能量

1.7 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2010數(shù)據(jù)處理；采用Origin 8.0繪制曲線；采用DAS 2.0進行藥動學(xué)參數(shù)計算。

2 結(jié)果與分析

2.1 標準曲線、相關(guān)系數(shù)、方法檢測限及回收率

本試驗條件下，恩諾沙星、環(huán)丙沙星檢出限為2.0 μg/kg，平均回收率為84%～103%；恩諾沙星、環(huán)丙沙星在0.10～1 000.00 ng/mL范圍內(nèi)，線性良好，線性方程分別為Y= -0.011 +0.001 8x（r= 0.999 2）和Y=-0.002 7+0.001 2x（r= 0.999 8）。

2.2 恩諾沙星及其代謝產(chǎn)物在鯽體內(nèi)的代謝及消除情況

2.2.1 恩諾沙星 如圖1所示，口灌給藥后，血藥濃度最早達到峰值，達峰時間（tmax）為9 h，其次是肌肉（tmax為18 h），肝臟、鰓（tmax為24 h），腎臟和皮膚（tmax為48 h）；達峰濃度以腎臟最高，cmax為30.490 mg/kg；其次是肝臟、肌肉、血漿、鰓、皮膚，cmax依次為21.372、18.715、16.636、15.157、11.663 mg/kg。達峰值后的恩諾沙星含量迅速下降，各組織中恩諾沙星代謝趨勢相似，藥時曲線如圖1所示。血漿中恩諾沙星消除最快，給藥后30 d無檢出，鰓、肌肉和皮膚中恩諾沙星分別于50、60和100 d后無檢出，肝臟和腎臟消除最慢，100 d時仍有檢出，殘留量接近限量值 100 μg/kg。

2.2.2 環(huán)丙沙星 給藥后15 min，方正銀鯽各組織均檢出環(huán)丙沙星，其代謝和消除趨勢與恩諾沙星大致相同，達峰時間較恩諾沙星延后（圖2）。血漿中環(huán)丙沙星最早產(chǎn)生達峰值，達峰時間tmax為18 h，其次是肌肉（tmax為1 d），肝臟、鰓（tmax為2 d），腎臟、皮膚（tmax為3 d）；達峰濃度以腎臟最高，cmax為547.26 μg/kg，其他依次為血漿、肝臟、鰓、皮膚和肌肉，cmax分別為214.04、202.60、65.26、62.23 和 50.081 μg/kg。

2.3 藥物代謝動力學(xué)參數(shù)

恩諾沙星在鯽各組織中的藥物代謝動力學(xué)參數(shù)見表3。

3 討論

藥動學(xué)中用房室模型模擬人體，把接受或消除藥物速率相似的部位，歸入一個房室[27]。房室模型的劃分由藥物的動態(tài)分布特征所決定。本研究數(shù)據(jù)經(jīng)DAS2.0擬合得出?？诠嘟o藥后，恩諾沙星在鯽體內(nèi)各器官狀態(tài)均符合二室模型。給藥后，藥物立即分布到分布速率常數(shù)α相對較大的血漿和肌肉組織中，α分別為0.181和0.174，之后再緩慢分布到分布速率常數(shù)α較小的肝臟、鰓、腎和皮膚中，α范圍為0.058～0.026。恩諾沙星在異育銀鯽血漿中的藥時數(shù)據(jù)符合二室模型[21]；肌注給藥時，恩諾沙星在眼斑擬石首魚（Sciaenops ocellatus）[28]血漿內(nèi)的藥時數(shù)據(jù)也可擬合為二室模型。

3.1 恩諾沙星在鯽體內(nèi)的吸收、分布及消除

cmax、tmax是反映藥物吸收快慢程度的重要藥物代謝動力學(xué)參數(shù)[23，28]。本研究中血漿tmax為9 h，表明口灌給藥后，恩諾沙星從胃部吸收進入血液后，9 h時達到峰值，cmax為16.636 mg/kg。各研究組織中血漿tmax最小，說明血漿對恩諾沙星的吸收速度最快。同樣口灌給藥后，恩諾沙星在雜交鱘[7]血漿、肌肉和肝臟中的tmax分別為2.01、1.51和 0.99 h， 鯉（Cyprinus carpio）[29]、 牙 鲆（Paralichthys olivaceus）[30]血漿tmax分別為4 h、0.5 h，且26 ℃和20 ℃條件下鯉血漿tmax分別為0.75 h和4 h，說明口灌給藥后，恩諾沙星進入魚血漿或肌肉等組織中的速度受魚的種類、水溫等因素影響。腎臟cmax最高，為30.490 mg/kg，肝臟次之，為21.372 mg/kg，鰓和皮膚較低分別為15.157 mg/kg和11.663 mg/kg。腎臟、肝臟中藥物濃度高，說明恩諾沙星在方正銀鯽腎臟和肝臟中組織結(jié)合率高。

圖1 口灌給藥后恩諾沙星在方正銀鯽各組織中的含量變化趨勢

圖2 口灌給藥后環(huán)丙沙星在方正銀鯽各組織中的含量變化趨勢

藥時曲線下面積（AUC）、表觀分布容積（V1/F）是反映藥物在體內(nèi)分布的主要藥動學(xué)參數(shù)。V1/F指藥物在體內(nèi)分布達到動態(tài)平衡時體內(nèi)藥量和血藥濃度的比值，其大小可反映藥物在體內(nèi)分布的廣泛程度以及組織結(jié)合程度，通常以0.8和1.0 L/kg為臨界值：大于0.8 L/kg則認為藥物在體內(nèi)廣泛分布或組織蛋白對藥物結(jié)合力強；大于1.0 L/kg則說明該組織中藥物濃度高于血漿中濃度[7，31-32]。恩諾沙星在方正銀鯽肝臟、腎臟、皮膚、肌肉、鰓中的V1/F分別為1.335、0.898、0.633、1.582和1.496 L/kg。除皮膚外，恩諾沙星在肝臟、腎臟、肌肉和鰓中分布廣泛，藥物達到動態(tài)平衡時，肝臟、肌肉和鰓中藥物濃度高于血藥濃度。

AUC表明藥物在體內(nèi)的暴露量，是衡量藥物在體內(nèi)被利用程度的一個重要參數(shù)[31]。一般認為AUC值越大，藥物穿入組織越多，分布越廣[32]。恩諾沙星在方正銀鯽各組織AUC值以腎臟最高4 455.889 mg·h/L，肝臟次之 3 672.847 mg·h/L，血漿最低433.414 mg·h/L。將紅笛鯛（Lutjanus sanguineus）[33]以5 mg/kg的劑量口灌恩諾沙星后，其肌肉、肝臟和腎臟中AUC值以腎臟最高為58.692 mg·h/L；對雜交鱘[7]單次口灌恩諾沙星10 mg/kg后，肌肉、血漿和肝臟中AUC值以肝臟最高為462.21 mg·h/L。假設(shè)組織中AUC值與給藥量成正比，以60 mg/kg.b.w的給藥量，紅笛鯛腎臟和雜交鱘肝臟中AUC分別為704.30和2 773.26 mg·h/L，低于本研究方正銀鯽腎臟和肝臟AUC值?？梢娍诠嘟o藥后，恩諾沙星在方正銀鯽腎臟和肝臟中分布更廣。

表3 口灌給藥后恩諾沙星在方正銀鯽體內(nèi)各組織中的藥代動力學(xué)參數(shù)

3.2 恩諾沙星代謝產(chǎn)物環(huán)丙沙星在方正銀鯽體內(nèi)的代謝情況

目前多數(shù)研究認為，恩諾沙星進入水生動物機體后，98%的恩諾沙星以原藥形式存在，脫乙基后產(chǎn)生的環(huán)丙沙星是其在水生動物體內(nèi)的主要代謝產(chǎn)物，但含量不足 2%[16，19，22-23，34-35]，或未檢測到[36]。牙鲆[30]口灌恩諾沙星后，對血漿、肝臟、腎臟、肌肉和鰓進行檢測，僅在血漿、肝臟和腎臟中檢出環(huán)丙沙星。本研究中，給藥后15 min，各組織中均檢出環(huán)丙沙星，且血漿、肌肉、肝臟、腎臟、皮膚和鰓中環(huán)丙沙星與恩諾沙星總含量比值分別為2.27%、0.36%、1.09%、3.17%、0.82%和0.80%?？梢?，恩諾沙星在方正銀鯽體內(nèi)主要以原藥恩諾沙星形式存在，同時有小部分脫乙基后代謝成環(huán)丙沙星，各組織中環(huán)丙沙星平均含量為1.60%，與多數(shù)對水生動物的報道[37]一致。

3.3 代謝周期

本試驗對恩諾沙星在方正銀鯽肌肉、血液、鰓和肝臟、腎臟、皮膚中的消除規(guī)律做了研究，為制定恩諾沙星在方正銀鯽中的休藥期提供數(shù)據(jù)支持。t1/2β反映藥物在體內(nèi)的消除速度。恩諾沙星在方正銀鯽各組織的t1/2β值以皮膚最高，為338.20 h；血漿最低，為93.303 h。恩諾沙星在牙鲆[30]肌肉中的t1/2β為67.759 h，在紅笛鯛[33]血漿、肌肉、肝臟和腎臟的t1/2β分別為 9.18、83.32、94.47和21.81 h，在凡納濱對蝦[24]肌肉、肝臟中t1/2β分別為30.30 h和34.80 h，在歐洲鰻鱺[15]血漿、肌肉、肝臟和腎臟中的t1/2β分別為908.07、901.24、59.32和761.81 h。相比而言，本研究恩諾沙星在方正銀鯽體內(nèi)消除速度較牙鲆、紅笛鯛和凡納濱對蝦慢，而較歐洲鰻鱺快。按5個t1/2后體內(nèi)藥物基本消除干凈計算，藥物消除量達97%[38]。本試驗條件下，恩諾沙星在方正銀鯽皮膚和血漿中的消除半衰期分別為1 691 h 和466.5 h，即給藥70.5 d 和19.4 d后，藥物基本消除干凈。根據(jù)農(nóng)業(yè)部235號公告-2002《動物性食品中獸藥最高殘留限量》規(guī)定，恩諾沙星和環(huán)丙沙星在組織中的最高殘留總量不得超過0.1 mg/kg。本試驗條件下，可食性組織中皮膚中恩諾沙星和環(huán)丙沙星殘留總量降低到0.1 mg/kg以下的時間最長，為1 200度日，與理論值基本符合。恩諾沙星在方正銀鯽可食組織中的殘留量經(jīng)1 200度日后可降至檢測限以下。

4 結(jié)論

本研究探討了恩諾沙星在方正銀鯽體內(nèi)的代謝及消除特征，對恩諾沙星在方正銀鯽肌肉、血漿、肝臟、腎臟、鰓和皮膚中不同時間點的含量進行跟蹤分析。恩諾沙星在方正銀鯽各組織中的最高濃度由大到小依次為腎臟、肝臟、肌肉、血漿、鰓和皮膚。各組織中恩諾沙星在皮膚中的消除半衰期最長。本試驗條件下，恩諾沙星以60 mg/kg.b.w劑量單次口灌給藥后，可食性組織中，皮膚中的恩諾沙星和環(huán)丙沙星殘留總量降低到0.1 mg/kg以下的時間最長，為1 200度日。總體來說，方正銀鯽對恩諾沙星的消除較緩慢。本研究為今后恩諾沙星在方正銀鯽養(yǎng)殖中的合理使用及休藥期制定提供了數(shù)據(jù)支持。