不同方法測定舒腦欣滴丸中藁本內(nèi)酯含量的比較*

山東第一醫(yī)科大學(xué)(山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院)，山東 泰安 271016

舒腦欣滴丸由川芎和當(dāng)歸兩味藥材提取加工制成，具有理氣活血、化瘀止痛的功效[1]。臨床上常用于治療血虛血淤引起的頭痛、頭暈、偏頭痛、視物昏花、健忘及失眠等癥狀，療效較為顯著[2]。而藁本內(nèi)酯是其主要活性成分之一，藥理研究表明，藁本內(nèi)酯具有保護(hù)腦神經(jīng)、改善微循環(huán)、舒張血管、抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖、抗癌、抗微生物、解熱、鎮(zhèn)痛消炎等藥理作用[3]。目前，藁本內(nèi)酯的含量測定方法多采用高效液相色譜法[4-6]，因藁本內(nèi)酯為揮發(fā)油成分，也有氣相色譜法測定。本次實(shí)驗(yàn)建立了舒腦欣滴丸藁本內(nèi)酯的液相測定方法和氣相測定方法，比較不同測定方法對(duì)舒腦欣滴丸中藁本內(nèi)酯含量測定結(jié)果的影響。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

GC-2014C氣相色譜儀(日本島津儀器有限公司)；HV-3靜音無油空壓機(jī)(濟(jì)南浩偉實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)；純水氫氣發(fā)生器(濟(jì)南浩偉實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)；Waters e2695型高效液相色譜儀(美國Waters公司)；2998 PDA Detector紫外檢測器；KQ-250DB型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；FR224CN型電子天平(奧豪斯儀器上海有限公司)。

1.2 試藥

舒腦欣滴丸(天津中新藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，批號(hào)：676018)；藁本內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)品(實(shí)驗(yàn)室自制)；微孔濾膜(孔徑0.45 μm)；甲醇(色譜純，天津市凱通化學(xué)試劑有限公司)；乙酸(分析純，天津市凱通化學(xué)試劑有限公司)；純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 GC法測定

2.1.1色譜條件 GC-2014C氣相色譜儀，色譜柱：KB-624毛細(xì)管柱(30 m×0.32 mm×1.80 mm)，檢測器：氫焰離子化檢測器(FID)，進(jìn)樣口溫度220℃，檢測器溫度320℃，色譜柱溫度220℃，載氣為氮?dú)?，進(jìn)樣量為1 μL。

2.1.2對(duì)照品溶液的制備 精密稱量藁本內(nèi)酯對(duì)照品5.6 mg于25 mL容量瓶中，加入甲醇定容至刻度，搖勻，制成濃度為200 μg·mL-1的藁本內(nèi)酯溶液，避光冷保存。

2.1.3供試品溶液的制備 取舒腦欣滴丸5粒，粉碎，精密稱重，置具塞錐形瓶中，精密加入70%的甲醇10 mL，稱量，超聲處理30 min，冷卻，再次稱定其重量，用甲醇補(bǔ)足失重，0.45 μm微膜濾過，精密量取其續(xù)濾液1 mL置于10 mL容量瓶中，加入70%甲醇稀釋至刻度，晃勻，即得。

2.1.4系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn) 分別取空白溶液、對(duì)照品溶液、供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，見圖1。從色譜圖中可以看出，對(duì)照品溶液中藁本內(nèi)酯的保留時(shí)間為8.6 min。供試品溶液主峰的保留時(shí)間與對(duì)照品溶液的主峰保留時(shí)間一致，與相鄰組分分離較好，無相互干擾。

1—藁本內(nèi)酯

2.1.5線性關(guān)系考察 精密量取藁本內(nèi)酯對(duì)照品母液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL置10 ml棕色容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，晃勻，得一系列不同濃度的藁本內(nèi)酯對(duì)照品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣3次，取平均值，以峰面積對(duì)濃度作線性回歸，得回歸方程為：Y=302.7X+392.4，r=0.9993，結(jié)果表明，藁本內(nèi)酯在10～50 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.6精密度和穩(wěn)定性考察 取對(duì)照品溶液按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件，進(jìn)樣量為1 μL，重復(fù)進(jìn)樣5次，記錄色譜圖，以藁本內(nèi)酯的峰面積計(jì)算藁本內(nèi)酯的RSD為1.74%，表明該方法的精密度良好。

取供試品溶液分別于0，2，4，6，8，10 h按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，以藁本內(nèi)酯的峰面積計(jì)算RSD為0.50%，表明供試品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.7重復(fù)性考察 取同一批號(hào)舒腦欣滴丸5份，按照“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液5份，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，計(jì)算藁本內(nèi)酯的峰面積RSD為1.86%，表明重復(fù)性良好。

2.1.8加樣回收率試驗(yàn) 精密量取“2.1.3”項(xiàng)下已知濃度的供試品溶液6份，各加入對(duì)照品適量，用甲醇溶液稀釋至刻度，晃勻，按上述色譜條件進(jìn)樣1 μL，每份進(jìn)樣3次，以藁本內(nèi)酯峰面積計(jì)算藁本內(nèi)酯的平均回收率為101.32%，RSD為1.29%。

2.1.9樣品含量測定 取3個(gè)不同批次的舒腦欣滴丸樣品，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并按照“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，計(jì)算舒腦欣滴丸中藁本內(nèi)酯平均含量為876.70 μg/丸。

2.2 HPLC法測定

2.2.1色譜條件 Waters e2695高效液相色譜儀，2998 PDA Detector紫外檢測器，Venusil MP C18色譜柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm)，流動(dòng)相為甲醇-0.2%冰醋酸水溶液(75∶25)，檢測波長為325 nm流速為1.0 mL/min，進(jìn)樣量10 μL，柱溫30℃。

2.2.2對(duì)照品溶液制備 取制備的藁本內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)品2.5 mg，置于25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻后即制成濃度為100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品貯備溶液，避光冷藏保存。

2.2.3供試品溶液制備 取“2.1.3”項(xiàng)下供試品溶液即得。

2.2.4系統(tǒng)適用性考察 分別取空白溶液、對(duì)照品溶液、供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣10 μL測定。色譜圖如圖2所示，從圖中可以看出藁本內(nèi)酯在9.9 min出峰，色譜峰峰型良好，且各組分之間互不干擾測定。

a.空白溶液；b.對(duì)照品溶液；c.供試品溶液。

2.2.5線性關(guān)系考察 精密量取對(duì)照品溶液適量，置10 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶液稀釋至刻度，制成5、10、20、40、50 μg·mL-1的5個(gè)不同濃度，取系列不同對(duì)照品溶液10 μL按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣，記錄色譜圖，以藁本內(nèi)酯的峰面積對(duì)其濃度進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為：Y=19525X+55814(r=0.9997)，表明藁本內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)品濃度在5～50 μg·mL-1范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

2.2.6精密度和穩(wěn)定性考察 取制備好的供試品溶液5份，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積，并計(jì)算RSD值，結(jié)果藁本內(nèi)酯RSD為1.04%，表明該方法精密度良好。

取“2.2.3”項(xiàng)下供試品溶液，分別于0、2、4、8、10 h進(jìn)樣測定，按上述色譜條件進(jìn)樣10 μL測定，并計(jì)算藁本內(nèi)酯的RSD為1.25%，表明樣品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.7重復(fù)性考察 取同一批次的舒腦欣滴丸藥品5份，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液5份，在“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件下進(jìn)樣10 μL，記錄下峰面積，并計(jì)算RSD值為1.53%，表明該法重復(fù)性良好。

2.2.8加樣回收率考察 取已知含量的供試品溶液3 mL，6份，置10 mL容量瓶中，分別加入對(duì)照品50 μg，用甲醇稀釋至刻度，晃勻，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算藁本內(nèi)酯含量，算出平均回收率為99.7%，RSD為0.6%。

2.2.9含量測定 按“2.2.3”項(xiàng)條件下制備供試品溶液3份，每份各進(jìn)樣3次，記錄色譜圖，求得舒腦欣滴丸中藁本內(nèi)酯的含量為887.16 μg/丸。

2.3 F檢驗(yàn)

照上述供試品溶液制備方法制備舒腦欣滴丸樣品溶液5份，各吸取1 μL按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件測定，各吸取10 μL按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，統(tǒng)計(jì)各方法測定項(xiàng)下藁本內(nèi)酯峰面積，計(jì)算含量，利用F檢驗(yàn)分析兩組數(shù)據(jù)之間的差異性，判斷其差異有無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

查閱可知F=S12/S22(S1>S2)，用實(shí)驗(yàn)測得的兩種含量數(shù)據(jù)方差代入F檢驗(yàn)公式中，計(jì)算方差比：F=2.99。F

3 討 論

本次實(shí)驗(yàn)建立了氣相色譜法測定舒腦欣滴丸中藁本內(nèi)酯含量，對(duì)氣相色譜條件進(jìn)行優(yōu)化，考察了檢測器溫度250℃、280℃、320℃，色譜柱溫度200℃、210℃、220℃，結(jié)果發(fā)現(xiàn)溫度對(duì)蒿本內(nèi)酯影響很大，提高檢測器溫度和色譜柱溫度，藁本內(nèi)酯峰與相鄰組分分離較好，達(dá)到基線分離，而且出峰時(shí)間適中，峰型良好；隨著溫度的升高，色譜峰會(huì)有所提前，節(jié)省了實(shí)驗(yàn)時(shí)間，故檢測器溫度是320℃，色譜柱溫度220℃。同時(shí)也建立了高效液相色譜法測定藁本內(nèi)酯含量，查閱文獻(xiàn)進(jìn)行了流動(dòng)相優(yōu)化，考察了0.1%、0.2%、1%冰醋酸溶液，同時(shí)也對(duì)流動(dòng)相的比例進(jìn)行了調(diào)整，適當(dāng)?shù)奶岣吡擞袡C(jī)相比例，使其出峰快速，節(jié)省實(shí)驗(yàn)時(shí)間，并且根據(jù)分離效果、峰形效果，最終選擇甲醇︰0.2%冰醋酸水溶液(75︰25)。

利用F檢驗(yàn)對(duì)兩種方法測定的含量結(jié)果進(jìn)行了檢驗(yàn)，其結(jié)果并無顯著性差異，表明兩種方法均可作為舒腦欣滴丸中藁本內(nèi)酯含量測定的方法，均能準(zhǔn)確地測定出其含量，但液相在實(shí)際操作過程中較之氣相分析時(shí)間稍長。