產(chǎn)前診斷檢測技術(shù)的新進(jìn)展

楊冬艷　龐麗紅

【摘要】 產(chǎn)前診斷是指對胎兒進(jìn)行先天性缺陷和遺傳性疾病的診斷，是防控出生缺陷及提高人口素質(zhì)的主要手段。產(chǎn)前診斷實驗室檢測方法多樣，從20世紀(jì)60年代的染色體核型分析發(fā)展到現(xiàn)在的基因測序技術(shù)，各種產(chǎn)前診斷實驗室檢測技術(shù)各有優(yōu)缺點?，F(xiàn)就產(chǎn)前診斷實驗室檢測技術(shù)的進(jìn)展及各產(chǎn)前診斷實驗室檢測技術(shù)的特點展開綜述。

【關(guān)鍵詞】 產(chǎn)前診斷; 染色體核型分析; 基因測序

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2019.13.084 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 1674-6805（2019）13-0-04

近年來隨著高齡妊娠人數(shù)和環(huán)境污染的增加，出生缺陷的發(fā)生率在逐年上升。產(chǎn)前診斷可以有效地預(yù)防出生缺陷的發(fā)生，所以產(chǎn)前診斷越來越受到社會各界的重視。產(chǎn)前診斷技術(shù)是為了盡量控制出生缺陷，而通過各種方法檢測胎兒出生前患某種遺傳性疾病或先天畸形與否。產(chǎn)前診斷實驗室檢測技術(shù)主要包括：（1）染色體核型分析;（2）分子細(xì)胞遺傳學(xué)分析技術(shù)：熒光原位雜交（FISH）、微陣列芯片雜交技術(shù)等;（3）PCR;（4）多重連接依賴式探針擴(kuò)增;（5）基因測序技術(shù)：一代測序、二代測序、三代測序、正在研究的四代測序技術(shù)等。各種產(chǎn)前診斷實驗室檢測技術(shù)各有優(yōu)缺點，下面筆者逐一展開敘述。

1 染色體核型分析

自20世紀(jì)60年代開始染色體核型分析技術(shù)已作為臨床上進(jìn)行產(chǎn)前診斷染色體異常的金標(biāo)準(zhǔn)，常染色體核型分析技術(shù)在產(chǎn)前診斷中有G、Q、R、C、N等顯帶技術(shù)，可根據(jù)不同的需求來選擇。G帶帶型比較穩(wěn)定，是最常使用的人類染色體核型分析檢測顯帶技術(shù)。目前鑒別G顯帶核型標(biāo)準(zhǔn)仍然是由人類細(xì)胞遺傳命名國際體系規(guī)定的，檢測的染色體是通過與其比對來判定改變與否。臨床上常見的遺傳病及染色體突變通過G顯帶核型分析技術(shù)來檢測準(zhǔn)確可靠，該技術(shù)應(yīng)用廣泛。為降低出生缺陷、提高出生人口素質(zhì)，目前我國采用對所有孕婦進(jìn)行早、中孕期的篩查，對篩查高危者再進(jìn)行染色體核型分析產(chǎn)前診斷來進(jìn)一步確診[1-3]。所以G顯帶核型分析技術(shù)對提高出生人口素質(zhì)有重要的意義。G顯帶核型分析可檢測>5 Mb的染色體片段結(jié)構(gòu)異常，且具有準(zhǔn)確性高，經(jīng)濟(jì)實惠等優(yōu)點。但染色體核型分析無法檢測微小變異及缺失。

2 分子細(xì)胞遺傳學(xué)分析技術(shù)（包括FISH技術(shù)和微陣列芯片雜交技術(shù)）

FISH技術(shù)是遵循堿基互補(bǔ)的原則，用標(biāo)記后的DNA作探針，然后與載玻片上待測的DNA互補(bǔ)鏈進(jìn)行雜交，然后檢測雜交位點熒光判讀染色體突變。FISH可直接檢測沒有經(jīng)過細(xì)胞培養(yǎng)的標(biāo)本是其最大的優(yōu)點，最短可在1 h后直接給出診斷。FISH可避免污染，可分析間期細(xì)胞，因此其培養(yǎng)失敗率低及培養(yǎng)時間短，檢測時間亦縮短。FISH檢測已知染色體異常較染色體核型分析準(zhǔn)確。FISH 技術(shù)應(yīng)用于產(chǎn)前診斷不僅可以加快產(chǎn)前診斷的速度，而且準(zhǔn)確性高[4-5]，還可以延長胎兒羊水染色體檢查在產(chǎn)前診斷中的時間窗。但FISH 因探針數(shù)目有限，只能對少數(shù)已知染色體異常進(jìn)行診斷。

微陣列芯片雜交技術(shù)是在全基因組范圍內(nèi)檢測染色體的微缺失和微重復(fù)，且分辨率高的一種檢測技術(shù)。它由單核苷酸多態(tài)微陣列（SNParray）和比較基因組雜交微陣列（aCGH）組成。SNParray是在基因組水平上通過微陣列檢出單個核苷酸的變異的，aCGH 是通過微陣列檢出與疾病相關(guān)的染色體異常。微陣列芯片雜交技術(shù)與前述2個檢測技術(shù)相比具有通量高、分辨率高和自動化檢測高的優(yōu)勢，可以一次性同時檢測許多與出生缺陷和先天性疾病相關(guān)的基因組異常，近年來已經(jīng)廣泛應(yīng)用于存在胎兒結(jié)構(gòu)異常的侵入性產(chǎn)前診斷[6-7]。有學(xué)者證明了微陣列芯片雜交技術(shù)在檢測胎兒染色體重組方面的效率，它顯著提高了結(jié)構(gòu)性缺陷胎兒的檢出率[8]。但微陣列芯片雜交技術(shù)只能檢測染色體數(shù)目重復(fù)或缺失，不能檢測染色體的結(jié)構(gòu)異常，價格較昂貴。它的適應(yīng)證是胎兒結(jié)構(gòu)異常，且最好先行染色體核型分析檢查。

3 PCR技術(shù)

PCR技術(shù)是針對人類染色體上具有多態(tài)性的短串聯(lián)重復(fù)序列而擴(kuò)增的，檢測出常見的染色體數(shù)目異常的時間可短至幾小時內(nèi)，其特點是快速、準(zhǔn)確、成本低、敏感性高、特異性高等優(yōu)點，但其即使結(jié)果正常也不能排除染色體畸形，且不能檢測染色體嵌合體及易位型，這些限制了其在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用。但基因一代測序卻離不開PCR技術(shù)的輔助作用。

4 多重連接依賴式探針擴(kuò)增技術(shù)

多重連接依賴式探針擴(kuò)增（MLPA）技術(shù)是基于 PCR 的一種檢測技術(shù)，可同時檢測多達(dá)50個DNA序列拷貝數(shù)的變化。是對DNA序列進(jìn)行定性及半定量分析的方法，主要用于大缺失、重復(fù)的檢測，但無法同時針對整個外顯子的DNA序列進(jìn)行檢測。故臨床上對明確致病基因的遺傳病可用MLPA技術(shù)進(jìn)行產(chǎn)前診斷[9-10]。

5 基因測序技術(shù)

基因測序技術(shù)是核酸DNA分子一級結(jié)構(gòu)的測定。應(yīng)用廣泛、發(fā)展迅速，已經(jīng)從第一代發(fā)展到第四代。第一代測序技術(shù)測序準(zhǔn)確性高，但通量較低，成本相對較高;第二代測序技術(shù)測序通量大大提高，是目前臨床上常用的基因測序方法;第三代測尚待完善;第四代測序技術(shù)還在實驗階段。

5.1 第一代測序（包括化學(xué)裂解法、Sanger測序）

化學(xué)裂解法是基于PCR的DNA測序法進(jìn)行的，其原理是：先處理有標(biāo)記的DNA片段，然后特異性切割，并且產(chǎn)生降解產(chǎn)物，再經(jīng)過電泳和放射自顯影之后可讀出相應(yīng)片段DNA的核苷酸序列。此方法為最早的基因測序方法，但其操作復(fù)雜，且讀取片段短，目前很少應(yīng)用。

Sanger測序的原理是利用DNA聚合酶以待測單鏈DNA為模板，以dNTP為底物設(shè)立四種相互獨立的測序反應(yīng)體系，給每個反應(yīng)體系中加入不同ddNTP作為鏈延伸終止劑。雖然Sanger法的弊端有：離不開PCR擴(kuò)增，只能分析單個DNA片段，通量小;自動化程度低，檢測速度慢;成本相對較高[11]。但Sanger測序準(zhǔn)確性高，目前仍是基因分型的金標(biāo)準(zhǔn)。目前Sanger測序廣泛應(yīng)用于全基因組測序及全外顯子測序的假陽性驗證方面。對已明確致病基因的遺傳性單基因疾病也可使用Sanger測序進(jìn)行產(chǎn)前診斷[12-13]。

5.2 第二代測序

第二代測序也叫高通量測序，其技術(shù)平臺包括三個，分別是：ABI公司的Solid測序平臺、羅氏公司454測序平臺、lllumina公司的Solexa測序平臺。三個測序平臺都有各自的優(yōu)點，Solid測序平臺測序較準(zhǔn)確，最大準(zhǔn)確度可達(dá)99.94%;454測序平臺的測序讀長較長，可達(dá)400 bp;Solexa測序平臺性價比較高，運(yùn)行成本低。第二代測序技術(shù)由于其通量大、可定量、成本低、邊合成邊測序的優(yōu)點，其研究及應(yīng)用越來越廣泛。二代測序技術(shù)已廣泛應(yīng)用于無創(chuàng)產(chǎn)前診斷（NIPT）及有創(chuàng)產(chǎn)前診斷領(lǐng)域[14-16]。在器官移植配型、腫瘤分子診斷和靶向治療及在藥物個體化治療等方面的應(yīng)用也成為熱點[17]。二代測序技術(shù)應(yīng)用于全外顯子組測序、全基因組測序、基因組重測序、從頭測序、全轉(zhuǎn)錄組測序、小分子RNA測序等方面。其中應(yīng)用最多的是全外顯子測序，下面筆者著重敘述全外顯子測序技術(shù)。

于2009年在二代測序基礎(chǔ)上開發(fā)了全外顯子測序（WES）。WES是一種有選擇性地捕獲和排列所有帶注釋的蛋白質(zhì)編碼基因編碼區(qū)域的技術(shù)。人類外顯子組序列僅占人類整個基因組序列的1%，卻有85%左右的人類致病突變包含在里面。WES的優(yōu)點：WES覆蓋范圍廣;測序成本低;處理時間減少。然而WES也有局限性;某些蛋白質(zhì)編碼區(qū)域可能不被覆蓋;WES沒有涵蓋潛在的功能性非編碼元素;WES檢測結(jié)構(gòu)變化的能力有限。盡管如此，WES仍然是許多研究人員選擇的工具，到目前為止通過WES已成功發(fā)現(xiàn)了數(shù)百種遺傳病的致病基因[18-21]。全外顯子測序在一家族性房間隔缺損家系中檢測出TBX20（D176N）致病突變[22]。因WES技術(shù)在遺傳病中的廣泛應(yīng)用，對有遺傳病家族史的孕婦行產(chǎn)前診斷提供很好的條件。麥明秦等[23]運(yùn)用WES產(chǎn)前診斷ZMPSTE24基因突變。

5.3 第三代的測序

第三代的測序技術(shù)也稱單分子測序技術(shù)。目前有2種，分別是利用合成測序理論測序的Helisope BioScience公司的SMS技術(shù)和以SMRT芯片為測序載體進(jìn)行的邊合成邊測序技術(shù)的Pacific Bioscience的SMRT技術(shù)[11]。第三代測序為單分子測序，不需進(jìn)行PCR擴(kuò)增。第三代測序方法的優(yōu)點為：（1）更高通量;（2）更短測序時間;（3）更長讀取長度;（4）更高精確性，可以檢測出極少的變異;（5）需要很少起始量;（6）更低的成本。當(dāng)然其也有缺點：（1）很難保持酶的活性與穩(wěn)定性;（2）很難在提高單分子信號靈敏度同時又不會把信號變成噪音增加熒光背景;（3）很難保持DNA的延展性而又不出現(xiàn)二聚體結(jié)構(gòu)等。因為超長的讀取長度[24]，單分子測序技術(shù)前景廣闊，其可以在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用被廣泛關(guān)注。2017年11月6日經(jīng)濟(jì)日報刊登了一例第三代單分子基因測序儀成功應(yīng)用于無創(chuàng)產(chǎn)前檢測（NIPT）的報道。第三代單分子基因檢測技術(shù)有望在不久后應(yīng)用于產(chǎn)前診斷方面，在基因檢測領(lǐng)域發(fā)揮更大作用。

5.4 第四代測序

第四代測序技術(shù)為納米孔測序技術(shù)，它改變了傳統(tǒng)的方法即序列讀取需要在復(fù)雜的酶促反應(yīng)中進(jìn)行，而是通過力學(xué)、電學(xué)等對DNA分子中的堿基直接判讀，但其尚處于研究當(dāng)中。其中代表性的方法是Nanopores測序法，它是一種基于電信號測序的新型技術(shù)。第四代測序技術(shù)的優(yōu)勢有：操作簡單、成本低、快速[25]。雖然目前第四代測序技術(shù)尚處于研究中，還不完善，但有望在不久的將來人們能利用其以最快的速度得到人類基因組信息，并期望其能用于產(chǎn)前診斷領(lǐng)域，為優(yōu)生優(yōu)育事業(yè) 做貢獻(xiàn)。

6 小結(jié)與展望

綜上所述，產(chǎn)前診斷實驗室檢測技術(shù)發(fā)展迅速，科技的發(fā)展推動著產(chǎn)前診斷實驗室檢測技術(shù)的發(fā)展，產(chǎn)前診斷實驗室檢測技術(shù)已從20世紀(jì)60年代的染色體核型分析發(fā)展到現(xiàn)在的基因測序，是朝著更快速、準(zhǔn)確、方便、經(jīng)濟(jì)的方向發(fā)展。各種產(chǎn)前診斷實驗室檢測技術(shù)各有優(yōu)缺點，各有其適用范圍。目前染色體核型分析仍然是產(chǎn)前診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)胎兒存在結(jié)構(gòu)異常時可加做微陣列芯片雜交等，近年來基因測序技術(shù)發(fā)展迅速，其中二代測序近年來發(fā)展尤為迅速，其在遺傳性單基因疾病的產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用及植入前產(chǎn)前診斷的應(yīng)用越來越被重視。產(chǎn)前診斷實驗室檢測技術(shù)的發(fā)展對防控出生缺陷及提高人口素質(zhì)有重要意義。

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