重新編譯遺傳密碼：全基因合成大腸桿菌

■文/馬曉顰

生物基因編碼的本源

在自然界中，大部分生命都使用64個(gè)密碼子進(jìn)行編碼。這64個(gè)密碼子中，61個(gè)密碼子編碼天然的20種氨基酸。這些氨基酸通過首尾相連、脫水縮合而形成不同長度的共價(jià)多肽鏈——不同分子量大小的蛋白質(zhì)。剩下的3個(gè)密碼子則起到終止翻譯蛋白質(zhì)的作用。

研究人員發(fā)現(xiàn)，這20種天然氨基酸中的18種存在同義密碼子（1種氨基酸有1個(gè)或多個(gè)密碼子）編碼。但實(shí)際上，這些同義密碼子有著相似的功能，其原因尚不明確。2013年，美國哈佛大學(xué)學(xué)者大膽地做了改造嘗試。他認(rèn)為，TAA、TAG、TGA都是執(zhí)行終止蛋白翻譯的命令，沒有必要用3個(gè)終止密碼子。于是，他將大腸桿菌基因組上的終止密碼子TAG替換成TAA，成功實(shí)現(xiàn)了同義密碼子的替換。

不僅終止密碼子存在冗余性，編碼20種天然氨基酸的61個(gè)密碼子也存在同樣的重復(fù)問題。2016年，研究人員將大腸桿菌中含有靶標(biāo)密碼子的20千堿基對（Kbp）基因組進(jìn)行替換，實(shí)現(xiàn)了重新編寫密碼子的人工改造。然而，這一技術(shù)僅限于基因組小范圍內(nèi)的同義密碼子替換。那么，我們是否可以將這項(xiàng)技術(shù)應(yīng)用于整個(gè)基因組內(nèi)的同義密碼子替換之中呢？

不難想象，實(shí)現(xiàn)整個(gè)基因組內(nèi)的同義密碼子替換，其難度相當(dāng)大。正如DNA化學(xué)結(jié)構(gòu)的共同發(fā)現(xiàn)者弗朗西斯·克里克（Francis Crick）提出的“冰凍事故”理論：一旦基本生活形式發(fā)生變化，三重密碼就會被鎖定，因?yàn)槿魏纹x通用程序的做法都將是一個(gè)巨大的劣勢。

全基因組合成的“先河”

最近，英國劍橋大學(xué)醫(yī)學(xué)研究委員會分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的研究團(tuán)隊(duì)成功地為大腸桿菌完整基因組重新編寫了一套遺傳密碼子，實(shí)現(xiàn)了合成生物學(xué)家合成全基因的夢想。

研究人員首先設(shè)計(jì)了開放閱讀框（Open Reading Frame，ORF）內(nèi)基因序列TCG、TCA、TAG替換為AGC、AGT、TAA的基因組序列?？紤]到這些被替換的密碼子會出現(xiàn)在兩個(gè)相同或者相反方向的ORF重疊區(qū)域，研究人員對其進(jìn)行了相應(yīng)處理。當(dāng)重疊區(qū)域所屬的ORF方向相反時(shí)，研究人員將重疊區(qū)復(fù)制成兩份，分別連接到兩個(gè)ORF的3’端；當(dāng)所屬ORF的方向相同時(shí)，將重疊區(qū)域復(fù)制并在之間插入重疊區(qū)域上游20個(gè)堿基對（bp）的序列。最終，研究人員設(shè)計(jì)了3 978 937bp的大腸桿菌基因組序列。

為把大腸桿菌基因組替換為設(shè)計(jì)的基因組序列，研究人員將設(shè)計(jì)的基因組分成8個(gè)部分，每個(gè)部分約0.5兆堿基對（Mbp）。然后，他們再將每個(gè)部分劃分為4～5個(gè)片段（Fragment），劃分過程中盡量避開必需基因，最后得到37個(gè)片段。每個(gè)片段再被進(jìn)一步分成9～14個(gè)小片段（Stretch），每個(gè)小片段長度在10 Kbp左右。為了將這些合成的片段拼接起來，研究人員在酵母中利用同源重組的方法將其分步組裝至細(xì)菌人工染色體中，然后重組替換至大腸桿菌基因組中對應(yīng)的部分。這個(gè)過程迭代使用5次，就能讓大腸桿菌基因組多個(gè)DNA節(jié)段被合成DNA取代。

接下來，研究人員對構(gòu)建的部分基因組進(jìn)行測序，發(fā)現(xiàn)仍有部分同義密碼子未被替換。針對這一問題，研究人員及時(shí)進(jìn)行優(yōu)化并將全部的TCG、TCA、TAG替換為人工設(shè)計(jì)的同義密碼子AGC、AGT、TAA。最后，研究人員使用細(xì)菌接合的方法，獲得新型的大腸桿菌，其被命名為Syn61。該菌株可存活，但生長速度比天然大腸桿菌較慢，形狀有些稍長。

遺傳密碼的改寫正是解凍代碼、開啟生命基本公式改寫的新篇章，是迄今為止全球最龐大的DNA編碼替換研究。

遺傳密碼改寫的研究意義

這一研究正是解凍代碼、開啟生命基本公式改寫的新篇章，是迄今為止全球最龐大的DNA編碼替換研究，實(shí)現(xiàn)了合成生物學(xué)家合成完整人類基因組的初步夢想。

研究人員表示，他們試圖在今后的研究中將轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸的tRNA改去接附其他的非天然氨基酸，進(jìn)而在細(xì)胞或生物體內(nèi)合成新的多肽或蛋白質(zhì)。當(dāng)然，在未來的研究中，他們還想嘗試合成更多種的非天然氨基酸及氨基酸聚合物。通過非標(biāo)準(zhǔn)氨基酸的摻入，蛋白質(zhì)能夠被多種標(biāo)記探針修飾。例如，用于研究電子傳遞的氧化還原探針，適用于核磁共振分析的同位素探針和適用于X射線衍射的重原子標(biāo)記探針等。此外，非標(biāo)準(zhǔn)氨基酸側(cè)鏈標(biāo)記芳基疊氮、苯甲酮或雙吖丙啶可在光誘導(dǎo)下發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，從而檢測到免疫沉淀可能檢測不到的體內(nèi)蛋白相互作用。交聯(lián)氨基酸還能被特異地化學(xué)斷裂，從而簡化質(zhì)譜分析過程。此外，非標(biāo)準(zhǔn)氨基酸修飾的細(xì)胞因子、生長因子和抗體能延長半衰期并增強(qiáng)治療效果。例如，將CD3抗體標(biāo)記上能特異結(jié)合腫瘤表面抗原的小分子，從而可以幫助細(xì)胞毒性T細(xì)胞識別癌細(xì)胞，這會在前列腺癌移植性小鼠模型及其他疾病模型中發(fā)揮良好的治療作用。此外，將琥珀密碼子TAG摻入丁型肝炎病毒、艾滋病病毒或甲型流感病毒的基因組中，使病毒只能在琥珀抑制的宿主中進(jìn)行復(fù)制，從而使得改造后的病毒復(fù)制受限，進(jìn)而降低病毒感染的風(fēng)險(xiǎn)。

研究人員還指出，大腸桿菌在癌癥、多發(fā)性硬化癥、心臟病和糖尿病的藥劑生產(chǎn)和治療中得以廣泛應(yīng)用。但是，當(dāng)遭到病毒或其他微生物入侵時(shí)，整個(gè)生產(chǎn)過程都會被破壞。此研究的主要負(fù)責(zé)人認(rèn)為，此次重新編碼的密碼子與通用的密碼子不同，對應(yīng)合成的大腸桿菌比天然的大腸桿菌具有一定的防御性，使得入侵的病毒在體內(nèi)很難傳播，這樣可以保護(hù)整個(gè)生產(chǎn)過程免受病毒的攻擊。

合成基因組學(xué)潛在的疑問

從低等到高等的生命世界，基本采用一套固有的遺傳密碼，也就是說該套遺傳密碼在很長的進(jìn)化過程中是保持不變的。因此，這套遺傳密碼在生物界是普遍通用的。目前，研究發(fā)現(xiàn)，人線粒體中的密碼子與通用密碼子有些不同。例如，人線粒體中共有4個(gè)終止密碼子（AGA、AGG、TAA和TAG），與通用的3個(gè)（TAA、TAG和TGA）終止密碼子不同。但是，從整體密碼子的使用來看，類別差異不是很大，說明生物界中密碼子較為保守。

在通常情況下，1個(gè)密碼子的第3個(gè)堿基是沒有特異性的，當(dāng)密碼子的第3個(gè)堿基改變時(shí)，也會合成原來的氨基酸——密碼子的簡并性。密碼子簡并性的出現(xiàn)對于降低細(xì)胞內(nèi)有害突變有著重要意義。即使當(dāng)DNA堿基出現(xiàn)突變時(shí)，對應(yīng)的密碼子還是可以編譯成原有的氨基酸的，不會影響相應(yīng)蛋白質(zhì)的翻譯。因此，密碼子的簡并性可以抵御有害突變。此外，編譯同一種氨基酸的多個(gè)密碼子能夠大大提高肽鏈合成的速率和延長效率。在某種程度上，密碼子簡并性的存在可阻止因單一密碼子劑量不足或者突變引發(fā)的肽鏈合成提前終止的現(xiàn)象發(fā)生。倘若我們?nèi)斯ぬ鎿Q靶標(biāo)密碼子，那么天然存在的64個(gè)密碼子中僅有部分密碼子發(fā)揮作用。這在一定程度上不僅減少編譯氨基酸所需的密碼子，還會增加肽鏈合成提前終止的概率。

此外，在這項(xiàng)研究中，我們發(fā)現(xiàn)Syn61菌株生長速度和形態(tài)發(fā)生了改變。那么，密碼子的刪減或替換會不會對整個(gè)基因網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)和生物本身產(chǎn)生影響呢？已有的研究結(jié)果表明，編碼1種氨基酸的多個(gè)密碼子的存在有一定的必要性。例如，轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸的tRNA不同，與之對應(yīng)的編譯密碼子也會不同。倘若實(shí)行不同密碼子的替換，那么tRNA轉(zhuǎn)運(yùn)和蛋白翻譯的效率也許會受到影響，最終影響肽鏈的合成和蛋白質(zhì)的表達(dá)。mRNA的穩(wěn)定性又是分子作用力的體現(xiàn)之一。同義密碼子間進(jìn)行互換，原有密碼子的分子量發(fā)生變化，分子作用力也會變化。隨之，mRNA的穩(wěn)定性可能會受到影響，最終影響蛋白質(zhì)的表達(dá)或后續(xù)的功能。密碼子除了參與翻譯氨基酸外，還會充當(dāng)一些轉(zhuǎn)錄識別因子，拼接調(diào)控因子的識別對象。密碼子間進(jìn)行互換，也許會影響細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄水平。

從生物進(jìn)化的角度而言，密碼子的簡并性在物種的穩(wěn)定上起著重要的作用。對同一種氨基酸而言，每個(gè)物種的基因組里使用的編譯密碼子有時(shí)是不同的。進(jìn)化上越接近的物種，這種密碼子的偏好性就會越接近。倘若實(shí)行人工替換密碼子，是否會影響物種間的進(jìn)化研究，我們未能知曉。

總之，在這一研究中，人工替換的編譯密碼子僅有3處。是否會出現(xiàn)上述的擔(dān)憂？也許會有，也許根本沒有，我們無從談起。如果針對基因組內(nèi)多處的密碼子進(jìn)行同義替換和刪減，大大顛覆原有生物基因編碼的固有模式，是否會有不可預(yù)測的變化？我們也未知。我們只希望這一技術(shù)能夠不斷地被挖掘并優(yōu)化，為合成生物學(xué)家在人類基因組的改造上提供更有利的幫助。