人參皂苷Rg1對LRRK2突變致帕金森病果蠅的治療作用探討

趙文學(xué)，趙雨，王偉楠，鄭麗娜，劉美辰

（長春中醫(yī)藥大學(xué)吉林省人參科學(xué)研究院，吉林長春130117）

帕金森病（parkinson's disease，PD）是常見晚發(fā)型神經(jīng)退行性疾病，是進(jìn)行性發(fā)展的致死性復(fù)雜疾病。PD 的發(fā)病誘因大多為散發(fā)性，只有約5%～10%的人群為家族遺傳性[1]。雖然只有少數(shù)人群的發(fā)病誘因?yàn)榧易暹z傳性，但描述這些致病基因的致病機(jī)理，為深入了解PD 的發(fā)病機(jī)制及藥物靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)提供了新的研究思路。

LRRK2 是較為常見的常染色體顯性遺傳PD 相關(guān)基因，LRRK2 突變是構(gòu)成家族性和散發(fā)性PD 的最常見已知原因[2-4]。LRRK2 基因在受黑質(zhì)（substantia nigra，SN）影響的多巴胺神經(jīng)元中呈現(xiàn)極低的表達(dá)量，而在接受黑質(zhì)多巴胺（dopamine，DA）輸入的紋狀體神經(jīng)元中則出現(xiàn)更高的表達(dá)[5-6]。LRRK2 是一種具有激酶和GTP 酶結(jié)構(gòu)域的大型多域蛋白，其激酶功能域與MAPK 蛋白激酶功能相近，其活性的升高是較為公認(rèn)的PD 致病機(jī)制之一，更是臨床PD 治療藥物開發(fā)的主要設(shè)計(jì)靶點(diǎn)[7]。已有研究表明，MAPK 傳導(dǎo)途徑中有3種蛋白與PD 的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，分別為ERK、P38 MAPK 以及 JNK[8]。LRRK2 能夠激活 P38 MAPK 進(jìn)而調(diào)控JNK 信號傳遞途徑，引起細(xì)胞凋亡[9]。此外，氧化應(yīng)激所產(chǎn)生的活性氧（reactive oxygen species，ROS）亦是引起凋亡的另一個(gè)關(guān)鍵因素。但當(dāng)ROS 產(chǎn)生量上升時(shí)，機(jī)體可誘導(dǎo)產(chǎn)生保護(hù)性蛋白，進(jìn)而起到保護(hù)細(xì)胞免受凋亡的作用。其中的Keap1/Nrf2/ARE 信號傳遞途徑是機(jī)體抗氧化機(jī)制中最為重要的信號傳遞途徑[10]。當(dāng)機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)時(shí)，Nrf2（NF-E2-related factor 2）與 Keap1（Kelch-like ECH-associated protein-1）親和能力降低，呈現(xiàn)游離狀態(tài)轉(zhuǎn)入細(xì)胞核內(nèi)，與ARE結(jié)合，啟動GCLC 等關(guān)鍵抗氧化蛋白的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞自身抗氧化能力增強(qiáng)，維護(hù)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激的損傷[11]。

人參皂苷是人參中的主要活性成分，人參皂苷Rg1 對于PD 模型的作用效應(yīng)已取得了比較多的研究進(jìn)展。人參皂苷 Rg1 對于 1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶（1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-terahydropyridine，MPTP）及魚藤酮等神經(jīng)毒性物質(zhì)誘導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞凋亡具有顯著保護(hù)作用，其作用途徑可能是通過降低活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平以及線粒體細(xì)胞色素C 向細(xì)胞質(zhì)的釋放，進(jìn)而抑制caspase-3活力，減少凋亡實(shí)現(xiàn)的[12]。同時(shí)，人參皂苷Rg1 在磷酸化胞外調(diào)節(jié)激酶1/2（phospho extracellular regulated protein kinases，P-ERK1/2）信號通路依賴的神經(jīng)保護(hù)作用中亦發(fā)揮了協(xié)同作用[13-15]。人參皂苷Rg1 預(yù)處理，可見磷酸化P-38，COX-2 和PGE2 陽性細(xì)胞顯著減少，并且改善了TH（+）神經(jīng)元的顯著減少現(xiàn)象，這意味著Rg1 可能通過作用于P-38 信號通路以保護(hù)PD中的多巴胺能神經(jīng)元[16]。以上研究結(jié)果證明了人參皂苷Rg1 對于PD 的潛在治療效應(yīng)。因此，本實(shí)驗(yàn)選用LRRK2 突變轉(zhuǎn)基因果蠅品系，于體內(nèi)整體水平驗(yàn)證人參皂苷Rg1 對于果蠅PD 模型的保護(hù)作用，驗(yàn)證其對LRRK2 激酶活性的抑制作用效應(yīng)，并通過進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其作用途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人參皂苷Rg1：長春中醫(yī)藥大學(xué)生物工程實(shí)驗(yàn)室；辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記羊抗鼠二抗Ig G、HRP 標(biāo)記羊抗兔二抗Ig G：英國英杰生命技術(shù)有限公司；抗體P-LRRK2、P-P38MAPK、ERK、P-ERK：艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司；抗體兔抗Nrf2多抗、兔抗谷氨酰半胱氨酸合成酶（glutamate-cysteine ligase catalytic，GCLC）多抗：上海斯信生物科技有限公司；抗體Flag：上海欣百諾生物科技有限公司；37%多聚甲醛、TritonX-100：美國西格瑪奧德里奇公司；二氫乙啶：威格拉斯生物技術(shù)（北京）有限公司；動物非免疫血清（羊）：福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器

SZ660 系列連續(xù)變倍體式顯微鏡：重慶奧特光學(xué)儀器有限公司；MJX-430 果蠅培養(yǎng)箱：浙江托普儀器有限公司；DHG-9070A 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；PL203 型天平：Mettler TOLEDD；SX-700 滅菌鍋：上海博訊實(shí)業(yè)有限醫(yī)療設(shè)備廠；WPUP-YJ-40 超純水儀：沃特浦；DFPCO2LID 型 CO2麻醉板：上海玉博生物科技有限公司；BT01-100 型恒流泵：上海滬西分析儀器廠有限公司；S210 型pH 計(jì)：梅特勒-托利多；1645050 型電泳儀：伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司；FL1000 成像系統(tǒng)：上海哈靈生物技術(shù)有限公司；501985 型解剖鑷子：世界精密儀器商貿(mào)（上海）有限公司。

1.3 果蠅品系

實(shí)驗(yàn)所用品系 TH-GAL4；UAS-LRRK2 1915T 以及MHC-GAL4；UAS-LRRK2 1915T 由長春中醫(yī)藥大學(xué)生物工程實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。

1.4 方法

1.4.1 果蠅培養(yǎng)基的制備

稱取玉米粉175 g，黃豆粉30 g 及瓊脂粉20 g，加入3 L 純凈水充分?jǐn)嚢枞芙?。保持沸騰狀態(tài)30 min 后加入60 g 安琪酵母粉，50 g 蔗糖，50 g 葡萄糖，充分混勻后繼續(xù)加熱煮沸。隨后量取90mL甘蔗糖漿加入容器中，冷卻20 min 加入10%尼泊金甲酯40mL及丙酸20mL制成普通培養(yǎng)基。在普通培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，配成Rg1 終濃度為 0.1、0.4 mmol/L 和 1.6 mmol/L 的含藥培養(yǎng)基。

1.4.2 藥物分組

將LRRK2 1915T 突變果蠅分為4 個(gè)不同作用濃度組（0、0.1、0.4、1.6 mmol/L），并設(shè)置于幼蟲期和成蟲期均給藥（L+/A+）和僅有成蟲期給藥（L-/A+）兩種藥物作用方式。利用果蠅壽命實(shí)驗(yàn)確定給藥方式和最佳藥物作用濃度以用于后續(xù)果蠅爬行能力分析、腦部多巴胺含量分析和Western blot 檢測。

1.4.3 果蠅壽命實(shí)驗(yàn)

收取各組8 h 內(nèi)新羽化未交配的雄蠅成蟲100只，每管分裝20 只果蠅到含藥培養(yǎng)基中，于29 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。之后每24 h 于同一時(shí)刻觀察記錄各模型各喂藥組果蠅生存情況，直至受試果蠅全部死亡，期間每隔1 d 更換一次新的培養(yǎng)基，以防因食物黏連造成死亡。

1.4.4 果蠅爬行能力檢測

果蠅的負(fù)趨地性用來分析果蠅的爬行能力。取各生長時(shí)間點(diǎn)（I：3日齡～6日齡；II：10日齡～15日齡；III：20日齡～25日齡）實(shí)驗(yàn)組和對照組果蠅，經(jīng) CO2麻醉后，各隨機(jī)抽取30 只放于長10 cm，直徑約為1.5 cm的塑料長管中。室溫（25 ℃）放置20 min 以確保果蠅于麻醉狀態(tài)中蘇醒，且充分適應(yīng)環(huán)境。設(shè)置終點(diǎn)距離為距離管底6 cm 處。隨后，輕柔將爬行管中的果蠅敲至管底，記錄10 s 內(nèi)到達(dá)終點(diǎn)處的果蠅數(shù)，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)10 次。

1.4.5 果蠅腦部多巴胺含量檢測

取各病理模型組及對照組2日齡雄蠅100 只，按照每培養(yǎng)管20 只隨機(jī)分為對照組和藥物組。藥物濃度設(shè)置為單一藥物濃度，選擇依據(jù)為果蠅壽命實(shí)驗(yàn)篩選出的有效藥物濃度。受試果蠅轉(zhuǎn)管至含藥培養(yǎng)基，并置于29 ℃培養(yǎng)箱中實(shí)驗(yàn)即為正式開始，于疾病發(fā)展的 3 個(gè)不同時(shí)期（I：3 d～5 d；II：15 d～18 d；III：25 d～30 d）在培養(yǎng)的100 只果蠅中隨機(jī)選取3 只，剪取果蠅大腦進(jìn)行多巴胺含量檢測，每組設(shè)置5 個(gè)平行對照。

1.4.6 Western blot 檢測

收取各實(shí)驗(yàn)組10日齡～15日齡果蠅30 只，冰上剪取果蠅頭部，提取蛋白質(zhì)，檢測給藥前后果蠅腦中P-LRRK2、Nrf2、谷氨酰半胱氨酸合成酶（glutamate--cysteine ligase catalytic，GCLC）、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）、P -P38MAPK 的表達(dá)變化。

1.4.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

除特殊說明外，所有研究均進(jìn)行至少3 次的生物學(xué)重復(fù)，數(shù)據(jù)以means±SD 形式展示。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用GraphPad Prism6 軟件完成，組間差異分析應(yīng)用Oneway ANOVA 分析方法完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 人參皂苷Rg1對LRRK2-1915T果蠅存活率的影響

人參皂苷Rg1 對LRRK2-1915T 果蠅存活率的影響見圖1。

圖1 人參皂苷Rg1 對LRRK2-1915T 果蠅存活率的影響Fig.1 Effect of ginsenoside Rg1 on the survival rate of LRRK2-1915T fruit fly

相對于對照組TH-GAL4 果蠅，LRRK-1915T 突變果蠅的存活率顯著降低（P＜0.05）。以0.4 mmol/L 人參皂苷Rg1 于幼蟲發(fā)育期和成蟲發(fā)育期同時(shí)喂食病理模型果蠅時(shí)，可在一定程度上提高病理模型果蠅的存活率。同樣作用濃度下如幼蟲期不給藥，則作用效應(yīng)消失。以0.1 mmol/L 和0.6 mmol/L 人參皂苷Rg1 喂食病理模型果蠅時(shí)，則無顯著作用效應(yīng)。

2.2 人參皂苷Rg1對LRRK2-1915T果蠅爬行能力的影響

人參皂苷Rg1 對LRRK2-1915T 果蠅爬行能力的影響見圖2。

圖2 人參皂苷Rg1 對LRRK2-1915T 果蠅爬行能力的影響Fig.2 Effect of ginsenoside Rg1 on the crawling ability of LRRK2-1915T fruit fly

由圖2 可知，對照組果蠅MHC-GAL4 的爬行能力隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長出現(xiàn)了一定程度的降低，但LRRK-1915T 病理模型組爬行能力降低的更為顯著。而在疾病發(fā)展的I（3 d～5 d）和II（15 d～18 d）期，人參皂苷Rg1 0.4 mmol/L 能在一定程度上挽救1915T 果蠅爬行能力的降低，但當(dāng)疾病進(jìn)展至 III（25 d～30 d）期時(shí)，藥物作用效應(yīng)消失。

2.3 人參皂苷Rg1對LRRK2-1915T果蠅腦多巴胺（DA）含量的影響

人參皂苷Rg1 對TH＞dLRRK2-1915T 果蠅腦DA含量的影響見圖3。

圖3 人參皂苷Rg1 對LRRK2-1915T 果蠅腦部多巴胺含量的影響Fig.3 Effect of ginsenoside Rg1 on dopamine content in LRRK2-1915T drosophila brain

由圖3 可見 I（3 d～5 d）、II（15 d～18 d） 以及 III（25 d～30 d）3 個(gè)不同時(shí)期中，對照組 TH-GAL4 果蠅隨生長時(shí)間的延長DA 含量也出現(xiàn)了一定程度的下降，但病理模型組DA 下降更為顯著，0.4 mmol/L 人參皂苷Rg1 均可在一定程度上挽救LRRK2 突變導(dǎo)致的DA 含量降低。以上研究結(jié)果充分說明于果蠅幼蟲發(fā)育和成蟲發(fā)育時(shí)期同時(shí)給與0.4 mmol/L 人參皂苷Rg1干預(yù)，可以挽救LRRK2 突變導(dǎo)致的果蠅PD 樣病理表型。

2.4 人參皂苷Rg1對LRRK2-1915T果蠅保護(hù)作用機(jī)制探討

2.4.1 磷酸化LRRK2 表達(dá)量的改變

人參皂苷Rg1 對TH＞dLRRK2-1915T 果蠅磷酸化LRRL2 蛋白表達(dá)量的影響見圖4。

圖4 人參皂苷Rg1 對1915T 突變果蠅P-LRRK2 表達(dá)水平的影響Fig.4 Effect of ginsenoside Rg1 on the expression of P-LRRK2 in 1915T mutant Drosophila

由圖4 可知，與陰性對照組TH-GAL4 相比，LRRK2-1915T 突變果蠅磷酸化LRRK2 水平顯著升高（P＜0.000 1），給與 0.4 mmol/L 人參皂苷 Rg1 干預(yù)后，磷酸化 LRRK2 表達(dá)水平降低（P＜0.001）。

2.4.2 對Nrf2 和GCLC 表達(dá)的影響

人參皂苷Rg1 對 TH＞dLRRK2-1915T 果蠅 Nrf2和GCLC 蛋白表達(dá)量的影響見圖5。

圖5 人參皂苷Rg1 對1915T 突變果蠅Nrf2 和GCLC 表達(dá)水平的影響Fig.5 Effects of ginsenoside Rg1 on the expression of Nrf2 and GCLC in 1915T mutant Drosophila

由圖5 可知，與陰性對照組果蠅相比，LRRK-1915T 果蠅Nrf2 表達(dá)量顯著降低，而GCLC 無顯著變化，當(dāng)給與人參皂苷Rg1 時(shí)，人參皂苷Rg1 可顯著提升Nrf2 和GCLC 蛋白的表達(dá)水平。

2.4.3 P-P38MAPK 表達(dá)的影響

人參皂苷Rg1 對TH＞dLRRK2-1915T 果蠅P-P38蛋白表達(dá)量的影響見圖6。

由圖6 可知，與陰性對照組果蠅相比，LRRK-1915T 果蠅磷酸化P38 水平顯著升高，而人參皂苷Rg1 可顯著抑制磷酸化P38 水平的上升趨勢。

2.4.4 磷酸化ERK 表達(dá)量的變化

人參皂苷Rg1 對TH＞dLRRK2-1915T 果蠅磷酸化ERKE 蛋白表達(dá)量的影響見圖7。

圖6 人參皂苷Rg1 對1915T 突變果蠅P-P38 表達(dá)水平的影響Fig.6 Effect of ginsenoside Rg1 on the expression of P-P38 in 1915T mutant drosophila

圖7 人參皂苷Rg1 對1915T 突變果蠅P-ERK 表達(dá)水平的影響Fig.7 Effect of ginsenoside Rg1 on the expression of P-ERK in 1915T mutant drosophila

由圖7 可知，與陰性對照組果蠅相比，LRRK-1915T 果蠅磷酸化ERK 水平顯著升高，而人參皂苷Rg1 可顯著抑制磷酸化ERK 水平的上升趨勢。

3 結(jié)論與討論

人參皂苷Rg1 對于PD 模型的作用效應(yīng)已取得了比較多的研究進(jìn)展。人參皂苷Rg1 對于MPTP 誘導(dǎo)的黑質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡顯示出保護(hù)作用，體內(nèi)研究表明使用5.0、10.0 mg/kg 的Rg1 預(yù)處理，可增加體內(nèi)Zona compacta 區(qū) Nissl 染色和 TH（+） 神經(jīng)元并且減少TUNEL（+）神經(jīng)元（P ＜0.01）[17]。人參皂苷 Rg1 對于MPTP 誘導(dǎo)的SN 區(qū)神經(jīng)元丟失現(xiàn)象的挽救也可能是通過其抗氧化效應(yīng)實(shí)現(xiàn)的，同時(shí)抑制JNK 信號途徑的級聯(lián)反映。Rg1 可阻止GSH 的下降，保持SOD 活力，降低JNK 和c-Jun 的磷酸化程度[18]。關(guān)于人參皂苷Rg1的保護(hù)作用，在不同模型中的其他研究也提到Rg1 在磷酸化胞外調(diào)節(jié)激酶1/2（P-ERK1/2）信號通路作為神經(jīng)保護(hù)中涉及的機(jī)制的重要性。CNS 中的抗炎活性被認(rèn)為在PD 中發(fā)揮有益作用。在這一觀點(diǎn)的基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rg1 抑制體內(nèi)MPTP 誘導(dǎo)的小鼠PD 模型SN 區(qū) COX-2 表達(dá)；與 MPTP 模型組相比，用 Rg1 預(yù)處理磷酸化P-38，COX-2 和PGE2 陽性細(xì)胞顯著減少，并且改善了TH（+）神經(jīng)元的顯著減少現(xiàn)象，意味著Rg1 可能通過作用于P-38 信號通路以保護(hù)PD 中的多巴胺能神經(jīng)元[19]。

由此可見人參皂苷Rg1 對LRRK2 突變果蠅的挽救作用途徑可能是通過：1）激活Nrf2，從而升高了GCLC 蛋白的表達(dá)，產(chǎn)生了一定的抗氧化作用效用，提高神經(jīng)元抵抗氧化應(yīng)激的能力，進(jìn)而保護(hù)了多巴胺能神經(jīng)元的功能，維護(hù)DA 含量；2）抑制磷酸化P38 表達(dá)，阻斷JNK 信號傳遞途徑，一定程度抑制了LRRK2突變導(dǎo)致的LRRK2 激酶活性，進(jìn)而維系了多巴胺能神經(jīng)元功能。因此，本研究針對人參皂苷Rg1，利用果蠅活體器官模型，探討人參皂苷Rg1 對LRRK2 突變導(dǎo)致PD 樣病理癥狀的挽救作用，并從P38-JNK 信號途徑和氧化應(yīng)激相關(guān)Keap1-Nrf2-ARE 信號途徑解釋了其作用機(jī)制。研究成果為人參皂苷Rg1 的神經(jīng)保護(hù)作用提供了一定的科學(xué)依據(jù)。