超高效液相串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)茶葉及茶飲料中咖啡因含量

秦 園,王惠芳,吳建兵,錢志榮,吳 梅,陳祝軍

(張家港市疾病預(yù)防控制中心,江蘇張家港 215600)

咖啡因(Caffeine)是從茶葉、咖啡果中提煉出來的一種黃嘌呤生物堿化合物[1],是一種中樞神經(jīng)興奮劑,適度地使用有去除疲勞、興奮神經(jīng)并恢復(fù)精力的作用,臨床上常用于治療昏迷復(fù)蘇和神經(jīng)衰弱[2-3]。長期或過量地食用含咖啡因的食物或飲品會(huì)刺激中樞神經(jīng)[4]、影響睡眠[5],甚至引起嬰幼兒早產(chǎn)[6-7]等;一但停用還會(huì)出現(xiàn)精神萎糜、渾身困乏等戒斷現(xiàn)象,危害人體健康[8-10]。因此,對(duì)不同產(chǎn)品及飲料中咖啡因含量快速、準(zhǔn)確的測(cè)定,有助于人們科學(xué)、適量地?cái)z入相關(guān)產(chǎn)品。

目前用于檢測(cè)咖啡因的方法有:薄層色譜法[11]、紫外分光光度法[12-14]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(Gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)[15]、高效液相色譜法(High performance lipid chromatography,HPLC)[16-20]及液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(Lipid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS)[21-22]。其中薄層色譜法步驟復(fù)雜、有毒溶劑用量多且為半定量法;紫外分光光度法靈敏度較低;液相色譜檢測(cè)周期長;氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法無法直接測(cè)定,具有假陽性;液相串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)咖啡因的方法國內(nèi)已有報(bào)道,陳彩云等[2]探究了液相串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)巴西綠蜂膠制品中的咖啡因,而該方法用于檢測(cè)茶及茶飲料中咖啡因含量報(bào)道較少,且專屬性不夠強(qiáng)。

本文探究超高效液相串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)咖啡因的具體實(shí)驗(yàn)條件,并用于多種茶葉及茶飲料中咖啡因含量檢測(cè)。對(duì)茶葉中咖啡因含量的檢測(cè)方法進(jìn)行補(bǔ)充,為證明該方法檢測(cè)食品中咖啡因含量的可行性提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

咖啡因標(biāo)準(zhǔn)品(GBW(E)082413,濃度為0.50 mg/mL) 北京海岸鴻蒙標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)技術(shù)有限責(zé)任公司;甲醇、乙腈 色譜純,TEDIA公司;甲酸 色譜純,上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;去離子水 由去離子水器制得,美國Millipore公司;龍井 產(chǎn)地為浙江;碧螺春 產(chǎn)地為蘇州;普洱 產(chǎn)地為云南;金駿眉、鐵觀音、大紅袍 產(chǎn)地為福建;各茶飲料 均從市場(chǎng)自購。

UPLC/XEVO TQD液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀、ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(2.1 mm×50 mm,1.7 μm)、Waters 2695液相色譜儀、SunFireTMC18色譜柱(2.1 mm×250 mm,5 μm) 美國Waters公司;一次性針頭過濾器(13 mm×0.22 μm) 上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司;調(diào)節(jié)式電爐 上海華聯(lián)環(huán)境試驗(yàn)設(shè)備公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品前處理 茶葉:直接稱取茶葉樣品0.500 g(精確至0.001 g),置于250 mL錐形瓶,加入100 mL水,沸水浴30 min,不時(shí)振搖,取出錐形瓶流水冷卻1 min,轉(zhuǎn)移至250 mL容量瓶中,加水定容,搖勻,靜置,取上清液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后,備用。

茶飲料:稱取1.00 g(精確至0.001 g)樣品,加水定容至2 mL,搖勻,經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后,備用[23]。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液 配制吸取咖啡因標(biāo)準(zhǔn)溶液200 μL于100 mL容量瓶中,用4%甲醇水溶液稀釋并定容,配制成1000 μg/L標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,4 ℃避光保存,備用。

1.2.3 色譜條件 ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(2.1 mm×50 mm,1.7 μm)美國Waters公司;柱溫為25 ℃;流動(dòng)相:0.1%甲酸水溶液-乙腈(80∶20,v/v);流速為0.3 mL/min;分離時(shí)間5 min;進(jìn)樣體積10 μL。

1.2.4 質(zhì)譜條件 電噴霧電離離子源(ESI);掃描方式為正離子掃描;MRM監(jiān)測(cè)模式;脫溶劑氣(N2)溫度:500 ℃;毛細(xì)管電壓:3.5KV;脫溶劑氣(N2)流速:700L/Hr;錐孔電壓:55V;碰撞氣為高純氬氣。

1.2.5 方法學(xué)考察

1.2.5.1 準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn) 方法準(zhǔn)確度以加標(biāo)回收率來判定,精確取出0.5 mL含已知咖啡因含量的金駿眉茶湯9份,分成3組,每組3份,于每組中加入0.5 mL咖啡因標(biāo)準(zhǔn)溶液,濃度分別為100、200、400 μg/L,按“1.2.3”色譜條件、“1.2.4”項(xiàng)質(zhì)譜條件進(jìn)行檢測(cè),記錄峰面積,計(jì)算回收率。

1.2.5.2 精密度實(shí)驗(yàn) “1.2.5.1”項(xiàng)中的各加標(biāo)樣品,按“1.2.3”色譜條件、“1.2.4”項(xiàng)質(zhì)譜條件連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6次,記錄峰面積,計(jì)算RSD。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用Excel軟件,計(jì)算實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,茶葉及茶飲料樣本結(jié)果以配對(duì)t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,p<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件建立

GB5009.139-2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中咖啡因的測(cè)定》是檢測(cè)食品中咖啡因現(xiàn)行有效的方法,本實(shí)驗(yàn)將該方法[23]中流動(dòng)相條件:甲醇-純水(24∶76,v/v),分別應(yīng)用于Waters 2695液相色譜儀和超高液相串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定咖啡因標(biāo)準(zhǔn)溶液,其他色譜條件均參考GB5009.139-2014[23]。研究發(fā)現(xiàn):甲醇-純水(24∶76,v/v)流動(dòng)相可在液相色譜儀上很好的分離出咖啡因,基線穩(wěn)定,對(duì)目標(biāo)峰響應(yīng)無影響(見圖1A),目標(biāo)峰分離時(shí)間穩(wěn)定為10.21 min;但該流動(dòng)相用于超高效液相串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)咖啡因時(shí),發(fā)現(xiàn)目標(biāo)峰雖分離時(shí)間縮短(分離時(shí)間1.35 min),但其響應(yīng)值易受基線干擾(見圖1B)且加標(biāo)回收率不理想,說明甲醇-純水(24∶76,v/v)流動(dòng)相條件不適用于超高效液相串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定咖啡因。

圖1 UPLC-MS、LC檢測(cè)的咖啡因標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖Fig.1 Chromatogram of standard caffeine detected by UPLC-MS and LC注:A.液相色譜儀檢測(cè)咖啡因標(biāo)準(zhǔn)液; B.超高效液相串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)咖啡因標(biāo)準(zhǔn)液。

本文參考相關(guān)文獻(xiàn)[2,24-25]關(guān)于咖啡因的檢測(cè),篩選出0.1%甲酸水溶液-乙腈(80∶20,v/v)流動(dòng)相進(jìn)行等度洗脫用于超高液相串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)咖啡因,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:0.66 min目標(biāo)峰即出現(xiàn),響應(yīng)值高、峰形好且不受基底干擾,能夠準(zhǔn)確分離和定量咖啡因(見圖2),優(yōu)于國標(biāo)法[23]6.263 min出峰時(shí)間,因此將0.1%甲酸水溶液-乙腈(80∶20,v/v)流動(dòng)相作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)條件。

圖2 UPLC-MS檢測(cè)的咖啡因標(biāo)準(zhǔn)品多反應(yīng)監(jiān)測(cè)色譜圖Fig.2 MRM chromatogram of standard caffeine detected by UPLC-MS

2.2 質(zhì)譜條件優(yōu)化

根據(jù)咖啡因的分子結(jié)構(gòu),本實(shí)驗(yàn)采用正離子(ESI+)作為離子化模式。質(zhì)譜條件優(yōu)化采用自動(dòng)進(jìn)樣方式,將濃度為500 μg/L的咖啡因標(biāo)準(zhǔn)液以10 μL/min的速度注入質(zhì)譜系統(tǒng),在ESI+模式下,通過Q1全掃描找出母離子。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,咖啡因在ESI+模式下有較高的響應(yīng)值。同時(shí)考查脫溶劑氣(N2)溫度、毛細(xì)管電壓、脫溶劑氣(N2)流速、錐孔電壓對(duì)離子強(qiáng)度的影響,并利用儀器自動(dòng)優(yōu)化目標(biāo)化合物的碰撞能,最終選出母離子、兩個(gè)峰度較大的特征性子離子和最優(yōu)碰撞能參數(shù),詳見表1。

表1 咖啡因MRM參數(shù)Table 1 Parameters of Caffeine in multiple reaction monitoring(MRM)

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1 檢出限與標(biāo)準(zhǔn)曲線 以1000 μg/L咖啡因標(biāo)準(zhǔn)液為初始溶液,通過倍比稀釋法,用純水分別稀釋成2、5、50、500、1000 μg/L的工作液,經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾,進(jìn)樣檢測(cè),以目標(biāo)峰響應(yīng)值為三倍信噪比(S/N=3)時(shí)相對(duì)應(yīng)的工作液濃度作為該方法的檢出限。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:本方法中咖啡因的檢出限為2.0 μg/L,優(yōu)于咖啡因國標(biāo)法[23]70 μg/L的檢出限。

以咖啡因濃度分別為2、5、50、500、1000 μg/L的工作液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。以溶液濃度(x,μg/L)為橫坐標(biāo),各濃度對(duì)應(yīng)的色譜峰面積(y)為縱坐標(biāo),進(jìn)行線性回歸計(jì)算,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(見圖3)。線性方程:y=40.3738x-18.1993,線性相關(guān)系數(shù)(r):0.9969,濃度范圍在2.0～1000 μg/L之間線性關(guān)系良好。

圖3 咖啡因標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Standard curve of caffeine

2.3.2 準(zhǔn)確度和精密度 實(shí)驗(yàn)計(jì)算結(jié)果顯示:不同標(biāo)準(zhǔn)液添加水平下,茶樣品中咖啡因的回收率為90.2%～103.9%,表明該方法測(cè)定咖啡因含量的準(zhǔn)確度良好;不同濃度標(biāo)準(zhǔn)液添加水平下,茶樣品中咖啡因含量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.00%～3.00%,表明該方法測(cè)定咖啡因含量的精密度良好。各水平加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差見表2。

表2 UPLC-MS法檢測(cè)咖啡因加標(biāo)回收率和RSD測(cè)定結(jié)果Table 2 Precision and recoveries of UPLC-MS examining caffeine

2.4 實(shí)際樣品檢測(cè)

以本實(shí)驗(yàn)建立的超高效液相串聯(lián)質(zhì)譜法以及國標(biāo)液相色譜法對(duì)綠茶、紅茶、烏龍茶茶葉及4種茶飲料中的咖啡因含量進(jìn)行測(cè)定,每個(gè)樣品重復(fù)3次。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:茶葉與茶飲料中均有咖啡因檢出,茶葉中咖啡因含量在4.38～13.31 mg/g,茶飲料中咖啡因含量在0.07～0.16 mg/g,茶葉較茶飲料中咖啡因的含量高;紅茶中咖啡因含量略低于綠茶、烏龍茶茶葉中咖啡因含量(見表3),這可能與不同茶葉的產(chǎn)地、制作方式等有關(guān)。

表3 兩種方法測(cè)定茶葉及茶飲料中咖啡因含量Table 3 Detect caffeine in different tea and tea drinks with two

兩種檢測(cè)方法所得咖啡因含量結(jié)果經(jīng)配對(duì)t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析(t=-0.820;p=0.433>0.05),無顯著性差異;且UPLC-MS法及國標(biāo)法檢測(cè)咖啡因含量RSD分別為:2.05%～3.75%、1.18%～3.19%(表3),經(jīng)配對(duì)t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析(t=1.897;p=0.09>0.05),無顯著性差異;表明超高效液相串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)咖啡因含量準(zhǔn)確性可靠。

3 結(jié)論與討論

本研究結(jié)果顯示:超高液相串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)咖啡因的檢出時(shí)間為0.66 min;檢出限為2.0 μg/L;線性濃度范圍:2.0～1000 μg/L,相關(guān)系數(shù)(r)為0.9969;樣品加標(biāo)回收率達(dá)90.2%～103.9%;相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.00%～3.00%之間(n=6)。與國標(biāo)法[23]相比,本法具有檢測(cè)時(shí)間短、靈敏度高等特點(diǎn)。

本文建立了超高液相串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)不同茶葉及茶飲料中的咖啡因含量測(cè)定的方法。與國標(biāo)色譜法及現(xiàn)有其他檢測(cè)方法相比[11-22,24-29],其檢測(cè)速度、靈敏度均具有明顯優(yōu)勢(shì);且準(zhǔn)確度、精密度、回收率均符合食品檢測(cè)相關(guān)要求[30],可用于實(shí)際樣品的檢測(cè);且該法對(duì)茶葉及茶飲料中咖啡因含量檢測(cè)結(jié)果及RSD與國標(biāo)法相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,結(jié)果準(zhǔn)確可靠。該方法為實(shí)際情況下快速檢測(cè)樣品中咖啡因含量提供了高效、可靠的新方法。