一種含肉桂醛包裝紙對(duì)面包腐敗發(fā)霉的抑制作用

田 芳,李凱龍,李 勇,唐嬌艷,張周洋

(1.郴州市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心,湖南郴州 423000; 2.湖南省食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院,湖南長沙 410111)

面包營養(yǎng)豐富,水分含量高,容易發(fā)霉變質(zhì),特別是在高溫高濕環(huán)境中,兩三天內(nèi)就能長霉,使其失去食用價(jià)值,造成浪費(fèi),且易引起食物中毒。因此抑制面包霉腐變質(zhì),延長面包貨架期,是一個(gè)重要的食品安全問題。匍枝根霉(Rhizopusstolonifer)亦稱黑面包霉,極易侵染在密閉潮濕環(huán)境中存放的面包和水果。抑制切片面包霉變的傳統(tǒng)方法主要有紫外線滅菌處理、無菌包裝和添加化學(xué)防腐劑(如苯甲酸、丙酸鈣、脫氫乙酸和山梨酸)等[1]。隨著食品包裝新材料和新技術(shù)的開發(fā)應(yīng)用,將具有抗菌活性的天然抗菌劑添加到食品包裝材料上是現(xiàn)代食品包裝的趨勢(shì),一方面,活性包裝材料可以減少微生物污染,保障食品品質(zhì);另一方面則可有效減少食品中防腐劑的添加,滿足消費(fèi)者的購買需求[2-5]。前人研究結(jié)果表明,天然香精油因其富含萜烯類和酚類化合物,具有很強(qiáng)的抗菌特性[6],可以作為食品防腐劑添加到食品中發(fā)揮其抗菌作用[7-8],也可以添加到食品包裝中制成抗菌活性包裝材料發(fā)揮其抗菌作用[9]。

從肉桂中提取的肉桂精油,對(duì)細(xì)菌、霉菌和酵母均有很強(qiáng)的抑制作用,且短暫的加熱處理對(duì)肉桂精油的抑菌效果無明顯影響[10]。而肉桂精油中肉桂醛的含量為86.8%,是其主要抗菌成分[11-12]。植物源肉桂醛作為一種天然香料,已被聯(lián)合國糧農(nóng)組織與世界衛(wèi)生組織(FAO/WHO)以及美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)認(rèn)定為安全無毒的化學(xué)成分,食品添加劑聯(lián)合專家委員會(huì)(JECFA)和美國香味料和萃取物質(zhì)制造者協(xié)會(huì)(FEMA)也認(rèn)定其為一種安全放心的食品香料成分和食品添加劑,我國也于2011年將其納入食品添加劑國家安全標(biāo)準(zhǔn)GB28346-2012[13]。研究表明肉桂醛可能是通過損傷霉菌細(xì)胞質(zhì)膜而進(jìn)入細(xì)胞,改變胞內(nèi)大分子空間結(jié)構(gòu)導(dǎo)致霉菌正常的新陳代謝被破壞,從而抑制霉菌的生長[14]。王新偉等[15]的研究表明肉桂醛對(duì)面包酵母和黑曲霉均有明顯的抑制作用,且肉桂醛體外抗菌活性測(cè)定氣體擴(kuò)散法抗黑曲霉效果優(yōu)于牛津杯法。本研究通過將含量不同的肉桂醛石蠟涂層應(yīng)用于包裝紙上,制成一種新型面包抑菌活性包裝材料,研究活性包裝材料及其內(nèi)面包對(duì)黑面包霉的抑制作用,同時(shí)通過設(shè)置間接擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)和測(cè)定活性包裝材料內(nèi)面包中肉桂醛的含量,用以探索肉桂醛應(yīng)用于面包包裝材料的可行性及其發(fā)揮抑菌作用的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

OPP透明食品自粘包裝紙(食品級(jí)) 桐城市昌宏包裝有限公司;特級(jí)小麥粉 郴州市步步高超市;植物源提取肉桂醛 上海阿拉丁生化科技有限公司;食品包裝石蠟(食品級(jí)) 鄭州松泰化工產(chǎn)品有限公司;黑面包霉(RhizopusstoloniferATCC30306) 中國微生物菌種保藏中心;乙酸乙酯(色譜純) 德國Meker公司;馬鞭草烯酮標(biāo)準(zhǔn)品(CAS No.:18309-32-5) 法國中草藥EXTRASYNTHESE公司;平板計(jì)數(shù)瓊脂(生化試劑) 青島海博生物技術(shù)有限公司。

Hewlett-Packard 6890N氣相色譜儀、5975B inert XL MSD質(zhì)譜檢測(cè)器 美國安捷倫科技有限公司;SPX-100B-Z恒溫培養(yǎng)箱 上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司;DHG-9140A電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海培因?qū)嶒?yàn)儀器有限公司;BCD-196TXZ型冰箱 青島海爾股份有限公司;Milli-Q凈化器 美國Millipore公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 微生物的培養(yǎng) 取保存于-20 ℃冰箱中的匍枝根霉R.stoloniferATCC30306凍干菌種,在PDA培養(yǎng)基中于30 ℃條件下孵化5 d得到活化霉菌,利用生理鹽水沖洗培養(yǎng)皿蓋子上的真菌孢子收集得到孢子懸浮液,調(diào)整孢子懸浮液濃度為102CFU/mL備用。

1.2.2 面包制作工藝 面包制作按照國家標(biāo)準(zhǔn)(GB/T 14611)小麥粉面包烘焙品質(zhì)試驗(yàn)直接發(fā)酵法[16],經(jīng)過稱樣、和面、發(fā)酵和揉壓、成型、醒發(fā)、烘烤制得到即食面包,然后將面包切成均勻的切片面包,現(xiàn)做現(xiàn)用。

1.2.3 活性包裝紙的制作 將食品級(jí)石蠟加熱到60 ℃后添加不同質(zhì)量的肉桂醛,得到肉桂醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1%、2%、4%和6%(w/w)的混合石蠟涂液,然后將相同質(zhì)量的石蠟均勻涂布薄薄的蠟層于OPP透明食品自粘包裝紙的一面,常溫條件下干燥后待用。涂布不添加肉桂醛石蠟的包裝紙為陰性對(duì)照,不涂布石蠟的包裝紙為空白對(duì)照。

1.2.4 包裝紙?bào)w外抑菌實(shí)驗(yàn) 體外抑菌實(shí)驗(yàn):將100.0 μL 102CFU/mL的孢子懸浮液接種于土豆培養(yǎng)基中,每處理設(shè)置10個(gè)培養(yǎng)皿,隨后將空白對(duì)照包裝紙、陰性對(duì)照包裝紙和活性包裝紙剪成1 cm×1 cm的小方塊粘在培養(yǎng)皿蓋上,25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(時(shí)間以空白對(duì)照培養(yǎng)基中長出霉菌為準(zhǔn)),評(píng)估肉桂醛不同含量活性包裝紙的抑菌效果,所有處理重復(fù)10次,抑菌率以長出霉菌培養(yǎng)皿數(shù)占總培養(yǎng)皿的比例計(jì)算而得。

1.2.5 切片面包防霉實(shí)驗(yàn) 通過前期預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)1.0×105CFU/mL是誘導(dǎo)面包霉變的最佳孢子溶度,因此將孢子濃度為1.0×105CFU/mL或1.0×106CFU/mL的200 μL孢子懸浮液涂抹在一片切片面包上,然后將感染黑面包霉的切片面包放置于兩片沒有感染黑面包霉的面包中間,然后分別用空白對(duì)照、陰性對(duì)照和1%～6%肉桂醛含量的包裝紙包裝,置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中保存,觀察記錄各處理包裝紙中面包開始發(fā)生霉變的天數(shù)。

在培養(yǎng)箱中保存第3 d,分別取每個(gè)包裝紙中的兩側(cè)和夾心面包各7 g,在無菌操作臺(tái)上剪碎混勻后置于均質(zhì)袋中,參照GB 4789.2-2016在25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后,測(cè)定面包中黑面包霉的菌落總數(shù),所有樣品重復(fù)測(cè)試3次,抑菌率計(jì)算方法為:

抑菌率(%)=(空白對(duì)照菌落總數(shù)-處理菌落總數(shù))/空白對(duì)照菌落總數(shù)×100

式(1)

表1 切片面包防霉應(yīng)用實(shí)驗(yàn)Table 1 Experiment on anti-mildew of sliced bread

1.2.6 活性包裝紙內(nèi)切片面包中肉桂醛含量的測(cè)定 1.2.5中不同處理方式的面包在25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中保存3 d后,進(jìn)行肉桂醛含量的檢測(cè)。根據(jù)文獻(xiàn)方法[17]和預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,本研究肉桂醛含量測(cè)定方法如下:切片面包進(jìn)行粉碎后,隨機(jī)稱取0.3 g樣品置于20 mL萃取瓶中,加入3.0 mL乙酸乙酯后用力振蕩3 min,靜置20 min,隨后乙酸乙酯提取物直接進(jìn)行GC/MS分析。GC/MS分析在安捷倫公司配備有5975B inert XL MSD質(zhì)譜檢測(cè)器的Hewlett-Packard 6890N氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀上執(zhí)行,采用HP-5MS色譜柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm),升溫程序:70 ℃保持1 min,以2 ℃/min升至85 ℃,隨后以5 ℃/min升至170 ℃,最后以5 ℃/min升至220 ℃,保持3 min;采用不分流進(jìn)樣,進(jìn)樣注射器和進(jìn)樣口溫度250 ℃,進(jìn)樣量為1.0 μL;載氣(99.999%,He),流速1.0 mL/min,壓力96.1 kPa。采用馬鞭草烯酮作為內(nèi)標(biāo)進(jìn)行定量分析,通過連續(xù)測(cè)定切片面包中肉桂醛的含量來評(píng)估方法的可行性,直到檢測(cè)加標(biāo)回收率達(dá)到98%以上,當(dāng)天重復(fù)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)偏差不超過2.4%時(shí)才開始進(jìn)行正式樣品的檢測(cè)。根據(jù)內(nèi)標(biāo)物保留時(shí)間、峰面積As,樣品目標(biāo)色譜峰保留時(shí)間、峰面積Ai,樣品量Mi和內(nèi)標(biāo)量Ms,應(yīng)用內(nèi)標(biāo)法相對(duì)定量公式計(jì)算肉桂醛含量(Mn):

式(2)

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel表格進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和作圖,利用SPSS軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,兩個(gè)處理數(shù)據(jù)采用t檢驗(yàn)進(jìn)行比較,兩個(gè)以上處理數(shù)據(jù)采用雙因素方差分析(Two-way ANOVA)進(jìn)行比較,p<0.05視為不同處理具有顯著性差異的判定標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 活性包裝紙的抑菌活性

本研究測(cè)定了1%～6%肉桂醛石蠟涂層的抑菌活性包裝紙對(duì)培養(yǎng)基中黑面包霉的體外抑菌作用(n=10),與空白和陰性處理比較發(fā)現(xiàn),隨著肉桂醛含量的增加,抑菌活性包裝紙的抑菌率也相應(yīng)增加,涂層肉桂醛成分含量6%的抑菌活性包裝紙的抑菌率達(dá)到了100%,4%抑菌活性包裝紙的抑菌率為80%,2%抑菌活性包裝紙的抑菌率為20%,1%抑菌活性包裝紙的抑菌率為0(圖1)。本研究通過石蠟來添加肉桂醛有利于肉桂醛的緩慢釋放和增加肉桂醛的穩(wěn)定性。結(jié)果表明,肉桂醛通過石蠟涂層可添加到包裝紙中,且制作的活性包裝紙具有很好的間接抑菌效果。有研究表明肉桂醛具有高的正辛醇/水分配系數(shù),在普通的材料中具有溶解性、擴(kuò)散性和很好的滲透性,可以通過控制其釋放行為發(fā)揮抗菌作用[18-19],本研究發(fā)現(xiàn)的其間接抑菌效果機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。

圖1 不同肉桂醛含量活性包裝紙?bào)w外抑菌試驗(yàn)Fig.1 In vitro antibacterial test of active wrapping paper with different concentration of cinnamaldehyde

2.2 活性包裝紙面包防霉應(yīng)用及其內(nèi)面包抑菌活性

將新鮮制作的切片面包分別用對(duì)照包裝紙和1%～6%肉桂醛含量的包裝紙包裝,置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中觀察結(jié)果,對(duì)照組包裝面包在第3 d就發(fā)生霉變了,而1%、2%、4%和6%肉桂醛含量的包裝紙中的面包分別在第3、第5、第15、第24 d才開始發(fā)生霉變。結(jié)果表明,肉桂醛顯著抑制了面包霉變的發(fā)生,延長了面包保存時(shí)間。肉桂醛對(duì)于食品中大多數(shù)真菌具有很好的抑制作用,其可通過損傷霉菌細(xì)胞質(zhì)膜而進(jìn)入細(xì)胞,使霉菌胞內(nèi)大分子空間結(jié)構(gòu)改變,生長繁殖和產(chǎn)毒代謝被破壞,從而抑制霉菌的生長和霉菌毒素的產(chǎn)生[14,20]。

通過測(cè)定保存3 d面包中的真菌含量,研究活性紙包裝面包的抑菌活性。結(jié)果表明(圖2),面包中霉菌孢子接種濃度為1.0×105CFU/mL時(shí),4%和6%肉桂醛活性包裝紙對(duì)真菌具有64.0%和93.4%的抑菌率,而1%和2%肉桂醛活性包裝紙對(duì)真菌只有0.5%和4.2%的抑菌率;而面包中霉菌孢子接種濃度為1.0×106CFU/mL時(shí),4%和6%肉桂醛活性包裝紙對(duì)真菌具有58.4%和83.2%的抑菌率,而1%和2%肉桂醛活性包裝紙對(duì)真菌只有0.2%和2.8%的抑菌率,抗菌活性與孢子接種濃度為1.0×105CFU/mL時(shí)沒有顯著差異,說明肉桂醛活性面包包裝紙的抑菌效果隨肉桂醛濃度的增加而增加,而接種真菌孢子濃度的初始濃度與抗菌活性之間沒有直接關(guān)系。通過肉桂醛對(duì)鐮刀菌的抑菌作用研究也發(fā)現(xiàn)肉桂醛的抑菌性能存在劑量-效應(yīng)關(guān)系,抑菌效果隨肉桂醛濃度的增加而增加[21],而抑菌實(shí)驗(yàn)中肉桂醛熏蒸法比直接接觸法的抑菌效率更高[15,17,22],所以本研究在面包包裝紙上添加含有肉桂醛的石蠟涂層,可以更好的抑制沒有和包裝紙直接接觸面包上的黑面包霉。

圖2 不同活性包裝紙包裝內(nèi)面包的抑菌試驗(yàn)Fig.2 Antibacterial test of packaged bread in different active wrapping paper

2.3 活性包裝紙內(nèi)面包中的肉桂醛含量及其與抑菌作用的關(guān)系

肉桂醛對(duì)真菌的抑制作用主要發(fā)生在真菌菌絲生長期,所以在真菌發(fā)生的前3 d肉桂醛的濃度對(duì)于其抑制作用具有重要影響[23-24]。因此本文通過測(cè)定保存3 d一個(gè)包裝中兩側(cè)面包和夾心面包的肉桂醛含量來分析肉桂醛含量與其抑制作用的關(guān)系,結(jié)果發(fā)現(xiàn)面包中肉桂醛含量與活性包裝紙石蠟涂層中肉桂醛的含量呈正相關(guān)(R2=0.9625和0.9679),不同活性包裝紙包裝的夾心和兩側(cè)面包片中肉桂醛含量均沒有顯著性差異(圖3)。2%實(shí)驗(yàn)組夾心和兩側(cè)面包中肉桂醛的最終濃度為19.7和22.7 μg/g,而4%實(shí)驗(yàn)組夾心和兩側(cè)面包中肉桂醛的最終濃度為60.9和62.7 μg/g。結(jié)合圖2分析,說明肉桂醛對(duì)黑面包霉的抑制作用與面包中肉桂醛濃度有關(guān),且初期的抑制濃度對(duì)抑制效果具有重要作用。接種真菌孢子的面包片放置在兩片沒有接種真菌孢子的面包中間,所以活性包裝紙與接種真菌孢子之間沒有直接接觸。綜合活性包裝紙?bào)w外抑菌結(jié)果圖1、實(shí)際面包抑菌結(jié)果圖2和面包中肉桂醛含量結(jié)果圖3分析表明,肉桂醛可通過非接觸發(fā)揮抑菌作用而非僅僅通過直接接觸發(fā)揮抑菌作用,且通過直接接觸擴(kuò)散到面包上的肉桂醛的量很少。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果為肉桂醛通過間接擴(kuò)散從包裝紙中轉(zhuǎn)移到包裝內(nèi)的面包中而發(fā)揮其抑菌活性提供了直接證據(jù)。

圖3 不同活性包裝紙包裝內(nèi)兩側(cè)和夾心面包中肉桂醛濃度測(cè)定Fig.3 Concentration of cinnamaldehyde in lateral and centralslices bread in different active wrapping paper

3 結(jié)論

肉桂醛對(duì)黑面包霉具有很好的抑制作用,由固體石蠟涂制的活性包裝紙具有很好抗黑面包霉活性。石蠟涂層中肉桂醛含量越高,活性包裝紙和包裝內(nèi)面包抗菌活性越強(qiáng),石蠟涂層中肉桂醛含量達(dá)到4%是抑制黑面包霉,防治面包發(fā)霉的最小濃度,可達(dá)到延長面包貨架期的目的。本實(shí)驗(yàn)中的活性包裝紙和黑面包霉沒有直接接觸,但其包裝內(nèi)不同位置的切片面包均具有很好的抑菌作用,所以這可能是肉桂醛通過非接觸方式擴(kuò)散至面包中而發(fā)揮抑菌作用的,但沒有更近一步的證據(jù)證明這種擴(kuò)散方式。且這種非接觸方式的作用機(jī)理及肉桂醛擴(kuò)散過程中是否對(duì)黑面包霉具有靶向作用還有待進(jìn)一步研究。