銀杏落葉粗多糖除蛋白方法的篩選及優(yōu)化

王筱瑜,季子非,薩日娜,耿麗晶,周 圍

(錦州醫(yī)科大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,遼寧錦州 121001)

銀杏葉是銀杏科銀杏樹的葉。銀杏樹是古老的樹種之一,世界上70%的銀杏資源分布在我國[1]。目前,已經(jīng)從銀杏葉中發(fā)現(xiàn)了140多種化學(xué)成分[2],這說明銀杏葉存在很大的開發(fā)潛力。目前,我國每年有大量的銀杏落葉被燃燒處理,不但浪費資源,而且污染環(huán)境,如若將其有效成分提取出來,運用到醫(yī)藥、食品等行業(yè)中,將對人類生活有較大意義。銀杏多糖是銀杏葉中的一種有效成分,其可從銀杏葉、果和外種皮中提取,具有抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫、降血脂[3]、抗炎[4]、抗氧化[5]等功能。姚鑫[6]的研究表明,銀杏落葉中的多糖含量高于其他時期,而影響銀杏落葉中的多糖提取率的主要影響因素是提取過程中蛋白的去除效果。植物多糖最常用的清除蛋白方法是Sevage法和TCA法,雖然除蛋白效果較好[7],但多糖損失較多[8],且該兩種方法所涉及的試劑氯仿、正丁醇和三氯乙酸等均為有毒的有機試劑,存在安全隱患。

為獲得更高多糖提取率和更為安全的銀杏落葉多糖,本實驗以銀杏落葉為研究對象,比較Sevage法、TCA法、等電點法和酶法的除蛋白效果和多糖損失率,并將篩選除蛋白效果最佳的酶法和等電點法相結(jié)合,運用響應(yīng)面法優(yōu)化出一種除蛋白效率更高、更安全的銀杏落葉多糖除蛋白方法,為進一步提供可食用性多糖除蛋白的方法提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

銀杏落葉 錦州醫(yī)科大學(xué)2017年11月校園內(nèi)收集;木瓜蛋白酶 CAS:G8430,酶活力:≥60萬,純度99%,索萊寶生物科技有限公司;纖維素酶 CAS:C109262,酶活力:1萬,阿拉丁生化科技股份有限公司;葡萄糖標準品 CAS:14431-43-7,純度99%,上海山浦化工有限公司;考馬斯亮藍試劑盒 CAS:A045-2,南京建成生物工程研究所;透析袋MD55 截留分子量3500 Da,上海哈靈生物科技有限公司;蒽酮等試劑均為分析純 天津風船化學(xué)試劑科技有限公司。

HH-1型電子恒溫水浴鍋 上海醫(yī)療器械五廠;752型紫外可見分光光度計 上海精密科學(xué)儀器有限公司;HR/T20MM立式高速冷凍離心機 湖南赫西儀器裝備有限公司;PHS-3C型精密pH計 上海雷磁;FD-1B-80冷凍干燥機 北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司;RE5298A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠;JYL-C051物料機 九陽股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 銀杏落葉多糖的提取 將收集來的銀杏落葉清洗后在鼓風干燥箱中于60 ℃烘至完全干燥,并在物料機中研磨成粉末。準確稱取5.0 g銀杏落葉粉末,按料液比1∶30 g/mL加入蒸餾水,添加2%的纖維素酶,酶解pH為5.0,酶解溫度為50 ℃,酶解40 min后,再于80 ℃浸提3 h,重復(fù)浸提兩次。合并浸提液,濃縮至體積1/3,加入4倍體積的95%乙醇,混勻后4 ℃過夜,收集沉淀冷凍干燥后得銀杏落葉粗多糖。測得粗多糖得率為61.29%±0.13%,粗多糖中的多糖含量為88.12%±0.16%。

1.2.2 評價指標

1.2.2.1 多糖含量測定 配制0.1 mg/mL的水溶性粗多糖溶液,以葡萄糖溶液做標準曲線,參考王宏軍等[9]方法,測定樣品的吸光度A620,以葡萄糖標準品濃度(mg/mL)為橫坐標,以吸光度(A620 nm)為縱坐標,繪制標準曲線圖得到葡萄糖濃度與吸光度的線性關(guān)系方程為y=16.677x+0.0423,決定系數(shù)R2=0.998,并按照公式計算多糖含量。

多糖質(zhì)量(mg)=測定多糖濃度(mg/mL)×樣液體積(mL)

1.2.2.2 多糖損失率的計算

式中:A0為除蛋白前樣品中多糖含量,%;A1為除蛋白后樣品中多糖含量,%。

1.2.2.3 蛋白含量測定 配制50 mg/mL樣品溶液,根據(jù)考馬斯亮藍蛋白定量測試盒說明書的方法,以蛋白標準品為對照,雙蒸水調(diào)零,于波長595 nm處測定吸光度,根據(jù)公式計算樣本蛋白濃度。

待測樣本蛋白濃度(mg/mL)=(測定OD值-空白OD值)/(標準OD值-空白OD值)×標準品濃度(0.5 mg/mL)

1.2.2.4 除蛋白率的計算

式中:C0為除蛋白前樣品中蛋白濃度,mg/mL;C1為除蛋白后樣品中蛋白濃度,mg/mL。

1.2.3 除蛋白方法的篩選

1.2.3.1 Sevage法 配制50 mg/mL水溶性粗多糖溶液,參考胡日查[10]、陳靜靜等[11]的Sevage除蛋白方法配制Sevage混合液(氯仿∶正丁醇=4∶1,v/v),加入樣品溶液體積1/4的混合液,震蕩后靜置20 min,5000 r/min離心10 min,除去下層變性蛋白沉淀,重復(fù)此方法直至無沉淀物后進行測定。

1.2.3.2 TCA法 配制50 mg/mL水溶性粗多糖溶液,參考阮世良[12]的TCA方法除蛋白后,5000 r/min離心10 min,取上清進行測定。

1.2.3.3 酶法除蛋白 配制50 mg/mL水溶性粗多糖溶液,參考陳靜靜等[11]的木瓜蛋白酶法除蛋白,調(diào)節(jié)pH為6.0,酶解后放至室溫,于5000 r/min離心10 min,取上清溶液調(diào)pH為中性(pH=7.0),灌裝至透析袋透析,用流動的自來水透析12 h,蒸餾水透析24 h,每2～3 h更換一次蒸餾水[13]。透析后進行測定。

1.2.3.4 等電點法除蛋白 配制50 mg/mL水溶性粗多糖溶液,用1%的鹽酸調(diào)節(jié)pH到2.5,參考陳麗娟[14]的等電點法除蛋白,4 ℃沉淀過夜后取上清液,用1%的NaOH調(diào)pH到7.0,進行測定。

1.2.4 酶-等電點法除蛋白關(guān)鍵因素的優(yōu)化 根據(jù)1.2.3實驗結(jié)果,經(jīng)過綜合考量,選擇酶法結(jié)合等電點法進行除蛋白工藝的優(yōu)化。首先,進行酶法除蛋白工藝優(yōu)化,再利用響應(yīng)面法進一步優(yōu)化酶-等電點結(jié)合法除蛋白工藝參數(shù)。

1.2.4.1 酶法除蛋白關(guān)鍵單因素實驗 參考陳麗娟[14]中的除蛋白方法,以除蛋白率和多糖損失率為考察指標,實驗設(shè)計如下,分別取5 mL 50 mg/mL的水溶性粗多糖溶液于試管中,以木瓜蛋白酶做水解酶,分別考察酶添加量(0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%)、酶解時間(0.5、1、1.5、2、2.5、3 h)、酶解溫度(40、45、50、55、60 ℃)、酶解pH(4.0、5.0、6.0、7.0、8.0)四個單因素,在考察某一單因素時,其他基礎(chǔ)條件為固定酶添加量1.0%,酶解時間1 h,酶解溫度45 ℃,酶解pH=5.0。在酶解結(jié)束后結(jié)合等電點法,即將樣品溶液pH調(diào)節(jié)至2.5,于4 ℃放置過夜,5000 r/min離心10 min,取上清溶液調(diào)節(jié)pH為中性(pH=7.0),透析48 h后測定蛋白濃度。

1.2.4.2 響應(yīng)面法優(yōu)化酶-等電點法除蛋白方法 根據(jù)單因素實驗結(jié)果,以除蛋白率(%)為指標,選取每個單因素中三個效果最佳的水平設(shè)計響應(yīng)面試驗,以確定酶法除蛋白的最佳方法,Box-Behnken試驗因素與水平如表1。

表1 響應(yīng)面實驗因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface design

1.3 數(shù)據(jù)處理

每個實驗平行重復(fù)3次,數(shù)據(jù)用Mean±SD形式表示。用SPSS 17.0進行相關(guān)性、顯著性分析和Design-Expert V8.0.6統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行處理和統(tǒng)計分析。統(tǒng)計結(jié)果中不同大寫字母表示不同組間均數(shù)差異極顯著(p<0.01),不同小寫字母表示不同組間均數(shù)差異顯著(0.010.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 除蛋白方法比較結(jié)果

以多糖損失率和除蛋白率為指標,比較四種清除蛋白方法。結(jié)果顯示(圖1),Sevage法清除蛋白的效果(除蛋白率為72.02%)最好(p<0.01),但多糖損失率(26.95%)也最高(p<0.01);酶法(除蛋白率為67.54%)的清除蛋白效果低于Sevage法,差異極顯著(p<0.01),但酶法的多糖損失率(14.29%)極顯著低于Sevage法和TCA法(p<0.01);TCA法(除蛋白率為59.11%)清除蛋白效果低于酶法,差異極顯著(p<0.01),且多糖損失率(15.44%)也高于酶法(p<0.01);等電點法除蛋白效果(除蛋白率為49.85%)相對其他方法較差(p<0.01),但多糖損失率(9.51%)也最低(p<0.01),可降低至10%以下。實驗中發(fā)現(xiàn),Sevage法和TCA法中的有毒有機溶劑在醇沉過程中仍有殘留,雖然除蛋白率都較高,但相對安全性過低;酶法清除蛋白效果相對較好,且方法安全,但對于多糖損失仍有提升空間,故本實驗最終選擇以危害較低的酶法和等電點法開展下一步實驗,將酶法和等電點法結(jié)合,以提高除蛋白率,降低多糖損失率。

圖1 四種除蛋白法組間比較結(jié)果Fig.1 Comparison of three protein removal methods

2.2 酶-等電點結(jié)合法除蛋白方法優(yōu)化結(jié)果

2.2.1 單因素實驗結(jié)果

2.2.1.1 酶添加量對除蛋白率及多糖損失率的影響 由圖2可知,隨著酶添加量的增加除蛋白率也上升,但添加量大于1.0%～2.0%除蛋白率開始極顯著下降(p<0.01),隨后保持穩(wěn)定,其原因可能由于過量的蛋白酶殘留[15],影響最終蛋白清除率。多糖損失率變化緩慢,無明顯上升趨勢,說明木瓜蛋白酶的添加量對多糖損失并無影響。綜合評價選擇酶添加量1.0%為宜。

圖2 酶添加量對除蛋白率與多糖損失率的影響Fig.2 Effects of enzyme addition on protein removal rate and polysaccharide loss rate

2.2.1.2 酶解時間對除蛋白率及多糖損失率的影響 由圖3可知,木瓜蛋白酶開始酶解后,除蛋白率逐漸上升,達到1 h后,除蛋白率趨于平穩(wěn),此結(jié)果說明酶解1 h幾乎可以達到完全水解,所以除蛋白率不再升高,整個過程多糖損失率沒有明顯變化,這與張曜武等[16]研究的結(jié)果相似。綜合評價選擇酶解時間1 h為宜。

圖3 酶解時間對除蛋白率與多糖損失率的影響Fig.3 Effects of enzymatic hydrolysis time on protein removal rate and polysaccharide loss rate

2.2.1.3 酶解溫度對除蛋白率及多糖損失率的影響 由圖4可知,隨著酶解溫度的升高除蛋白率也升高,達到45 ℃時除蛋白率開始下降,可能與酶的最適作用溫度有關(guān),溫度過高會影響木瓜蛋白酶的活性,導(dǎo)致酶解效果降低[17]。溫度升高時,酶化的反應(yīng)和水解率速度都會增加,但溫度過高會導(dǎo)致底物蛋白的變性[18]。該過程中多糖損失率也隨溫度的升高緩慢上升的趨勢,但無顯著差異,說明60 ℃以下的酶解溫度對多糖損失率影響不顯著。綜合評價選擇酶解溫度45 ℃為宜。

圖4 酶解溫度對除蛋白率與多糖損失率的影響Fig.4 Effects of enzymatic hydrolysis temperature on protein removal rate and polysaccharide loss rate

2.2.1.4 酶解pH對除蛋白率及多糖損失率的影響 由圖5可知,微酸的環(huán)境下除蛋白率相對較高,最優(yōu)酶解pH為4.0～6.0,pH大于6.0除蛋白率開始顯著下降,說明該木瓜蛋白酶在微酸環(huán)境下酶解效果較好,此結(jié)果與說明書中提供的酶解條件信息相符。多糖損失率隨酶解pH升高無顯著變化。綜合評價選擇酶解pH=5.0為宜。

圖5 酶解pH對除蛋白率與多糖損失率的影響Fig.5 Effects of enzymatic hydrolysis pH on protein removal rate/polysaccharide loss rate

2.2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化結(jié)果

2.2.2.1 回歸模型的建立及顯著性檢驗 采用Design-Expert8.0.6軟件進行響應(yīng)面設(shè)計,以除蛋白率(Y)為響應(yīng)值獲得響應(yīng)面實驗結(jié)果如表2。

表2 Box-Behnken實驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Experimental design and results of response surface

對表2進行回歸分析,得到回歸方程為:

Y(除蛋白率,%)=92.03-3.31A+2.37B+2.54C-2.54D+0.13AB-0.80AC+1.25AD-1.87BC-0.38BD+0.50CD-10.75A2-2.23B2-5.38C2-5.98D2。

響應(yīng)面實驗設(shè)計對回歸模型進行方差分析和顯著性檢驗如表3。

表3 回歸模型的方差分析結(jié)果Table 3 Analysis of variance for the fitted quadratic polynomial model

2.2.2.2 響應(yīng)面交互作用分析 結(jié)果見圖6,B酶解時間與C酶解溫度的等高線圖形為橢圓形,且等高線相對較密集,響應(yīng)面圖形曲線趨勢陡峭,表明B酶解時間與C酶解溫度交互效應(yīng)對響應(yīng)值的影響顯著(p<0.05);而A酶添加量與B酶解時間、A酶添加量與C酶解溫度、A酶添加量與D酶解pH、B酶解時間與D酶解pH、C酶解溫度與D酶解pH的等高線圖形均為近似圓形,且等高線相對稀疏,結(jié)果表明A酶添加量與B酶解時間、A酶添加量與C酶解溫度、A酶添加量與D酶解pH、B酶解時間與D酶解pH、C酶解溫度與D酶解pH之間的交互效應(yīng)對響應(yīng)值的影響不顯著。

圖6 酶添加量、酶解溫度、酶解時間和酶解pH交互作用的響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface diagrams of enzyme addition amount,enzymatic hydrolysis temperature,enzymatic hydrolysis time and enzymatic hydrolysis pH interaction

2.2.2.3 優(yōu)化及其驗證實驗 通過軟件Design-Expert V8. 0.6,得到提取的最佳工藝條件:酶添加量為0.90%,酶解時間為1.11 h,酶解溫度為45.83 ℃,酶解pH為4.66，預(yù)測除蛋白率為93.16%。結(jié)合實際試驗的情況,將提取條件進行修正:酶添加量為0.90%,酶解時間為1.1 h,酶解溫度46 ℃,酶解pH為4.7。此條件下重復(fù)3次實驗,得到除蛋白率為92.73%±0.13%,與預(yù)測值接近,說明該模型能夠較好地反映酶-等電點法除蛋白的條件,并測定其多糖損失率為9.28%±0.12%,相比較2.1中酶法清除蛋白的結(jié)果,除蛋白率提高了25.19%,多糖損失率也降低了5.01%,結(jié)果說明酶-等電點法優(yōu)化工藝后可以更高效的清除銀杏落葉中的蛋白并降低多糖的損失率。

相比陳麗娟[14]研究銀耳多糖的酶—等電點除蛋白法,本實驗優(yōu)化了該方法,除蛋白率提高了1.5%,多糖損失率升高1.41%,此結(jié)果可能由于銀耳多糖與銀杏落葉多糖成分的不同導(dǎo)致差異;相比陳靜靜等[11]研究銀杏外種皮多糖酶法除蛋白,蛋白質(zhì)清除率提高了40.16%,多糖損失率降低了6.97%,與其相比除蛋白率與多糖損失率都有優(yōu)化。侯小濤等[19]的研究中,采用天然澄清劑進行蛋白清除,此方法雖然安全,但選擇的最優(yōu)多糖濃度為30 mg/mL,而本實驗選擇的多糖濃度可達到50 mg/mL,說明此方法可以更高效率的清除蛋白,從而節(jié)約成本。

3 結(jié)論

本實驗確定酶法除蛋白的效果較好,多糖損失率相對較低,在食品加工方面更為安全,所以最適合可食性多糖的除蛋白。酶-等電點法除銀杏落葉多糖中蛋白的最佳工藝條件為酶添加量為0.90%(以底物計算),酶解時間為1.1 h,酶解溫度46 ℃,酶解pH為4.7。在此條件下,除蛋白率92.73%±0.13%,多糖損失率9.28%±0.12%。