等電點(diǎn)法純化太平洋鱈魚皮膠原蛋白及其結(jié)構(gòu)特性研究

劉鳳鳴,李八方,侯 虎

(中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東青島 266003)

我國是漁業(yè)大國,2014年魚類總產(chǎn)量即已接近4000萬噸[1]。水產(chǎn)品加工業(yè)的快速發(fā)展,隨之而來的是加工中產(chǎn)生的大量副產(chǎn)品,如魚皮、魚骨、魚鱗等。大量副產(chǎn)品未經(jīng)處理便被隨意丟棄,不僅造成了環(huán)境污染,還造成了生物資源的浪費(fèi)。而這些副產(chǎn)品中,以鱈魚皮為例,淑英等[2]發(fā)現(xiàn),鱈魚皮干物質(zhì)中有50%以上為膠原蛋白。且鱈魚屬于深海魚類,污染小,是生產(chǎn)膠原蛋白的優(yōu)質(zhì)原料。

在膠原蛋白的生產(chǎn)過程中,純化是極其重要的一步,純度高的膠原蛋白才能應(yīng)用于醫(yī)藥領(lǐng)域。傳統(tǒng)的膠原蛋白純化方法主要是鹽析法,常用的鹽類是氯化鈉、硫酸銨等。鹽析法的原理在于,加入鹽溶液后,鹽分子所帶的電荷會中和膠原蛋白分子表面的電荷,使膠原蛋白分子之間的靜電相互作用降低,逐漸聚集并沉淀下來[3]。鹽析法具有回收率高、無污染的優(yōu)點(diǎn),且不會對膠原蛋白的三螺旋結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響,因此一直被用于膠原蛋白的純化領(lǐng)域。但是鹽的加入會使后期的透析時間大大延長，一般鹽析后需要透析3～4 d,才能保證終產(chǎn)品不受鹽和酸的影響。任海濤等[4]采用鹽析法純化鼠尾膠原蛋白,需在超純水中持續(xù)透析3 d,每天換液3次。

等電點(diǎn)沉淀法是利用蛋白質(zhì)在其等電點(diǎn)時溶解度最低,且不同蛋白質(zhì)具有不同的等電點(diǎn)進(jìn)行分離的方法。等電點(diǎn)沉淀法具有效率高、專一性強(qiáng)等特點(diǎn),且不需要后期長時間的透析,因此應(yīng)用廣泛。例如被用于牛奶乳清蛋白[5]的分離純化,藻類蛋白的提取[6],甚至是污水蛋白的回收[7],但關(guān)于其在膠原蛋白回收純化中的應(yīng)用鮮有報道。

因此,本文采用等電點(diǎn)沉淀法純化鱈魚皮膠原蛋白,以期為一種新的、高效的膠原蛋白純化方法提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鱈魚皮 青島三洋水產(chǎn)品加工公司;氫氧化鈉、氯化鈉、冰醋酸、溴化鉀 分析純,國藥集團(tuán);鼠尾Ⅰ型膠原蛋白 美國Sigma公司;蛋白質(zhì)Marker 美國New England生物技術(shù)有限公司;BCA法總蛋白測試試劑盒 南京建成生物工程研究所。

ZS90型Zeta電位分析儀 英國Malvern Instruments公司;Powerpac型電泳儀 美國Bio-Rad公司;Powerwave XS型酶標(biāo)儀 美國Biotek公司;UV-2102PC型紫外-可見分光光度計 上海尤尼柯儀器有限公司;200SXV型傅里葉變換紅外光譜儀 美國Nicolet公司;D8 Advance型X-射線衍射儀 德國Bruker公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 膠原粗溶液和膠原蛋白凍干品的制備 取新鮮潔凈鱈魚皮,用干凈剪刀剪成1 cm×1 cm的塊狀,按照1∶60 g/mL加入冷藏0.08 mol/L的氫氧化鈉溶液,于4 ℃環(huán)境下采用磁力攪拌器攪拌12 h。后以冷藏蒸餾水清洗至中性。在按料液比1∶60 g/mL,乙酸濃度為0.55 mol/L的條件,于4 ℃攪拌酸提至大部分魚皮溶解,4 ℃環(huán)境下9000 r/min(8603×g)離心30 min后取上清液即為膠原蛋白粗提液。取一部分膠原粗溶液,加入預(yù)先磨好的氯化鈉粉末至終濃度為1.5 mol/L。后采用0.5 mol/L乙酸溶液攪拌復(fù)溶12 h,采用500 Da透析袋,隔6 h換一次透析液(蒸餾水),連續(xù)透析3 d后,凍干得到經(jīng)鹽析法純化得到的膠原蛋白干品。

1.2.2 溶解度的測定 參考Pal等[8]方法測定樣品的溶解度。首先,將經(jīng)鹽析法純化得到的膠原凍干品溶解于0.5 mol/L乙酸中配制成濃度為6 mg/mL的膠原溶液。使用6 mol/L的氫氧化鈉或鹽酸溶液將樣品的pH調(diào)節(jié)至1～10。然后,將樣品溶液在4 ℃下攪拌30 min后在4 ℃下8603×g離心30 min。收集上清液,計算相對溶解度RS:

其中,Ps為上清液的蛋白質(zhì)濃度;Pm是最高的蛋白質(zhì)濃度。

1.2.3 Zeta電位的測定 參照程海明等[9]方法進(jìn)行。將鱈魚皮膠原蛋白凍干品溶于0.5 mol/L乙酸中配成0.5 mg/mL的膠原溶液。使用1.0 mol/L的硝酸溶液和1.0 mol/L的氫氧化鉀溶液將上述溶液的pH調(diào)節(jié)至2～11。在4 ℃下測定樣品的Zeta電位值。樣品的等電點(diǎn)為Zeta電位值為零時對應(yīng)的pH。

1.2.4 等電點(diǎn)沉淀法純化膠原蛋白粗提液 將1.2.1中提取得到的膠原粗溶液使用濃度為5 mol/L的氫氧化鈉和乙酸溶液調(diào)至pH7.0左右,靜置3 h后,4 ℃環(huán)境下8603×g離心30 min取沉淀,沉淀用0.5 mol/L的乙酸溶液復(fù)溶后透析48 h,期間每隔6 h換一次預(yù)冷透析液(蒸餾水),最后凍干得到等電點(diǎn)法純化膠原蛋白。

1.2.5 SDS-PAGE分析膠原純度 對等電點(diǎn)純化后的膠原進(jìn)行SDS-PAGE分析。采用5%的濃縮膠和7.5%的分離膠。采用0.6 mol/L的Tris-HCl緩沖液(含有2%的SDS、0.1%的溴酚藍(lán)、25%的甘油和14.4 mol/L的β-ME,pH為6.8)為樣品緩沖液;染色液為0.1%的考馬斯亮藍(lán)溶液(考馬斯亮藍(lán)∶甲醇∶冰醋酸=9∶9∶2,v/v);脫色液按照水∶甲醇∶冰醋酸=8∶1∶1的比例配制。取凍干樣品1 mg溶于5%的SDS溶液中,按照1∶4(樣品:緩沖液1)的比例加入樣品緩沖液,沸水浴煮5 min,8603×g離心5 min后取10 μL上樣。同時取10 μL蛋白質(zhì)Marker作為分子量的參考,10 μL上鼠尾Ⅰ型膠原作為對照。電泳過程采用直流恒壓電源,電壓為100 V。

1.2.6 結(jié)構(gòu)特性分析 采用X-射線衍射、傅里葉紅外光譜和紫外吸收光譜對等電點(diǎn)純化后得到的膠原進(jìn)行結(jié)構(gòu)特性分析。

對樣品進(jìn)行X-射線衍射分析。射線源為Cu靶Kα輻射,電壓為40 KV,電流為40 mA。掃描角度5°～50°(2θ),掃描速度為4°/min。掃描結(jié)果采用Origin 8.5作圖。

對樣品進(jìn)行傅里葉紅外光譜分析。將溴化鉀烘干至恒重,取適量用瑪瑙研缽充分研磨,后用壓片機(jī)壓片,在500～4000 cm-1范圍內(nèi)掃描,掃描的結(jié)果作為背景。后取適量等電點(diǎn)純化膠原凍干品和烘干溴化鉀充分研磨混勻(大約1∶100 g/g),在同樣波長范圍內(nèi)掃描,分辨率為2 cm-1,掃描次數(shù)32次。

對樣品進(jìn)行紫外吸收光譜分析。取凍干后的等電點(diǎn)純化膠原,溶解于0.5 mol/L的乙酸溶液中,配制成1 mg/mL的溶液。取0.5 mol/L的乙酸溶液用于基線的測定。采用紫外可見分光光度計在200～400 nm范圍內(nèi)以中速掃描。

1.2.7 等電點(diǎn)沉淀法純化工藝的研究 采用不同沉淀時間、不同沉淀pH、不同膠原濃度,對膠原粗溶液進(jìn)行純化,以確定最優(yōu)純化工藝。

固定沉淀pH為7.0、膠原濃度為6 mg/mL,將沉淀時間分別定為0、1、2、3、6、24 h,4 ℃環(huán)境下8603×g離心30 min取沉淀,沉淀用0.5 mol/L的乙酸溶液復(fù)溶。測定復(fù)溶液的膠原蛋白濃度和總蛋白濃度,計算回收率和純度。

固定沉淀時間為3 h、膠原濃度為6 mg/mL,將膠原粗溶液的pH分別調(diào)至6.4、6.6、6.8、7.0、7.2,4 ℃環(huán)境下8603×g離心30 min取沉淀,沉淀用0.5 mol/L的乙酸溶液復(fù)溶。測定復(fù)溶液的膠原蛋白濃度和總蛋白濃度,計算回收率和純度。

固定沉淀時間為3 h、沉淀pH為7.0,將膠原粗溶液的濃度分別調(diào)至2、4、6、8、10 mg/mL,4 ℃環(huán)境下8603×g離心30 min取沉淀,沉淀用0.5 mol/L的乙酸溶液復(fù)溶。測定復(fù)溶液的膠原蛋白濃度和總蛋白濃度,計算回收率和純度。

1.2.8 回收率和純度的計算

回收率(%)=(復(fù)溶液羥脯氨酸含量/膠原粗溶液的羥脯氨酸含量)×100

純度以復(fù)溶液羥脯氨酸含量/復(fù)溶液總蛋白含量表示。

1.2.9 羥脯氨酸含量和總蛋白含量的測定 根據(jù)Sun等[10]的方法測定羥脯氨酸的含量。首先,取0.5 mL液體樣品加入0.5 mL的6 mol/L鹽酸(固體樣品取1～2 mg,加入1 mL的6 mol/L鹽酸)在110 ℃水解8 h,然后將水解產(chǎn)物徹底轉(zhuǎn)移并調(diào)至中性。使用10 μg/mL羥脯氨酸溶液作為標(biāo)準(zhǔn)溶液。經(jīng)計算，羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=0.0939x+0.0129(R2=0.9991)。 取1 mL樣品溶液和標(biāo)準(zhǔn)溶液,加入1.5 mL無水乙醇和1 mL氯胺T,然后,在每個管中加入1 mL高氯酸反應(yīng)5 min。最后,加入1 mL對二甲基氨基苯甲醛,置于60 ℃水浴中靜置20 min。冷卻反應(yīng)溶液后用酶標(biāo)儀測定560 nm處的吸光值。總蛋白測定根據(jù)試劑盒采用BCA法。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行三次平行實(shí)驗(yàn),每次實(shí)驗(yàn)平行測定三次。結(jié)果均采用Origin 8.5作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 溶解度曲線

如圖1所示,鱈魚皮膠原在pH1～3時都是高度可溶的,并且在pH=3時溶解度最高。隨著pH的升高(pH3～pH7),溶解度急劇下降,并且在pH=7時溶解度最低。lvarez等[11]報道,當(dāng)膠體系統(tǒng)接近其等電點(diǎn)時,分子的凈電荷將接近零。在這種情況下,分子間的靜電排斥最小,分子將發(fā)生聚集和沉淀。也就是說,蛋白質(zhì)在其等電點(diǎn)時具有最小的溶解度。因此,鱈魚皮膠原的的等電點(diǎn)在7左右。此外,從pH9～11,樣品的溶解度有增加,Jongjareonrak等[12]報道,當(dāng)pH遠(yuǎn)離等電點(diǎn)時,膠原分子將攜帶更多的凈電荷,膠原分子之間的排斥力增高,溶解度也隨之增高。

圖1 pH對膠原蛋白溶解度的影響Fig.1 Effects of pH on the solubility of collagen from pacific cod skin

2.2 Zeta電位

如圖2所示,膠原蛋白分子的電荷在pH2～6時為正,在pH7～10時為負(fù),并且在pH=6.83時凈電荷為零。根據(jù)先前的報道[13],在特定的pH下,膠原分子所帶的正電荷將等于負(fù)電荷,該pH即為膠原蛋白的等電點(diǎn)。因此,樣品的等電點(diǎn)為6.83,該結(jié)果與溶解度的結(jié)果一致。樣品的等電點(diǎn)處于弱酸性,這可能是因?yàn)槟z原中谷氨酸和天冬氨酸等酸性氨基酸含量高[14]。

圖2 Zeta電位分析Fig.2 Zeta potential analysis of collagen

2.3 SDS-PAGE

根據(jù)圖3,圖譜中條帶清晰,無雜帶出現(xiàn)。這表示等電點(diǎn)純化得到的樣品純度較高,等電點(diǎn)純化法可以作為一種有效的純化方法。且樣品的電泳圖譜與鼠尾Ⅰ型膠原類似,均由至少兩種不同的α多肽鏈(α1和α2)組成。這些α鏈的分子量約為135 kDa。由圖3可以看出,α1帶的強(qiáng)度約為α2帶的兩倍。因此,鱈魚皮膠原蛋白的分子組成可表示為(α1)2α2。此外,在圖中還可以觀察到二聚體(β鏈)和三聚體(γ鏈),它們代表了膠原蛋白的分子間和分子內(nèi)交聯(lián)[15]。這些β鏈的分子量約為245 kDa,而γ鏈的分子量一般大于245 kDa。樣品和鼠尾Ⅰ型膠原的電泳圖譜之間沒有實(shí)質(zhì)性差異,這也證明了膠原的亞基或交聯(lián)未受pH的影響。

圖3 等電點(diǎn)純化膠原的SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE pattern of collagen purified by isoelectric precipitation method注:M為高分子蛋白marker泳道; A為等電點(diǎn)純化膠原泳道;B為鼠尾Ⅰ型膠原泳道。

2.4 結(jié)構(gòu)性質(zhì)分析

2.4.1 等電點(diǎn)純化膠原的X-射線衍射(X-RD)分析 根據(jù)圖4,等電點(diǎn)純化得到的膠原具有兩個主要的衍射峰。對應(yīng)的衍射角(2θ)分別為7.4°,22.3°。根據(jù)布拉格方程d(?)=λ/2sinθ(其中λ是X射線波長,θ 是布拉格衍射角)可以計算出衍射峰對應(yīng)的最小重復(fù)面間距d。計算出d值分別為11.93?和3.98?。Giraud-Guille等[16]研究表明,第一個衍射峰反映了膠原纖維分子鏈之間的距離,其值在12?左右，第二個衍射峰反映了由膠原纖維引起的彌漫性散射,其值在4?左右。該結(jié)果與文獻(xiàn)報道一致,說明等電點(diǎn)純化膠原的三螺旋結(jié)構(gòu)仍保持完整。

圖4 等電點(diǎn)純化膠原的X-射線衍射Fig.4 X-ray diffraction of collagen purified by isoelectric precipitation method

2.4.2 等電點(diǎn)純化膠原的傅里葉變換紅外光譜(FTIR)分析 由圖5所示,等電點(diǎn)純化得到的樣品具有五個典型的酰胺帶。酰胺A帶出現(xiàn)在3308 cm-1。正如Doyle等[17]報道的那樣,酰胺A帶與N-H伸縮振動有關(guān),發(fā)生在3400～3440 cm-1范圍內(nèi),最終在氫鍵形成后轉(zhuǎn)移到3300 cm-1附近,這有助于維持膠原蛋白的三螺旋結(jié)構(gòu)。此外,分別在2933和1655 cm-1處觀察到酰胺B帶和酰胺I帶。通常出現(xiàn)在1550～1600 cm-1范圍內(nèi)且主要與N-H彎曲振動有關(guān)的酰胺Ⅱ帶[18]出現(xiàn)在1543 cm-1。由C-N伸縮振動產(chǎn)生的酰胺III帶出現(xiàn)在1232 cm-1。上述發(fā)現(xiàn)與其他相關(guān)研究相似[19-20]。

圖5 等電點(diǎn)純化膠原的傅里葉變換紅外光譜Fig.5 FTIR spectra of collagen purified by isoelectric precipitation method

2.4.3 等電點(diǎn)純化膠原的紫外吸收光譜分析 如圖6所示,等電點(diǎn)純化后的膠原在234 nm處有最大紫外吸收,這是膠原的典型吸收波長[19]。根據(jù)Sun等[20]的研究,紫外吸收與-COOH,-CONH2基團(tuán)和C=O的n→π*躍遷有關(guān)。此外,苯丙氨酸,酪氨酸和色氨酸分別在250、270和280 nm附近有最大紫外吸收[21]。然而,該樣品在275 nm處僅有微小的吸收,而在280 nm處沒有吸收,這表明樣品中含有微量的酪氨酸但沒有色氨酸,這也進(jìn)一步證明樣品的純度很高。

圖6 等電點(diǎn)純化膠原的紫外吸收光譜Fig.6 Ultraviolet absorption spectrum of collagen purified by isoelectric precipitation method

2.5 等電點(diǎn)沉淀最優(yōu)工藝的確定

由圖7A可以看出,隨著時間的延長,回收率和純度均呈現(xiàn)出先上升后趨于平穩(wěn)的趨勢。在6 h時,回收率達(dá)到85%左右。此時羥脯氨酸/總蛋白的比值為0.0875。綜合兩個指標(biāo),選擇6 h作為最適沉淀時間。由此也可以看出,等電點(diǎn)沉淀較鹽析沉淀在時間上有較大優(yōu)勢。而對于工業(yè)化生產(chǎn)來說,時間的降低就相當(dāng)于成本的降低。

由圖7B可以看出,隨著pH的升高,回收率和純度均呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢。在pH=6.8時,回收率最高,為90.05%,這個結(jié)果也與溶解度和Zeta電位的結(jié)果一致。此時羥脯氨酸/總蛋白的比值為0.092。純度在pH=7.0時達(dá)到最大,但此時回收率有明顯的下降。綜合兩個指標(biāo),當(dāng)工業(yè)要求產(chǎn)品純度較高時,選擇pH=7.0作為最適pH;當(dāng)要求回收率最大時,選擇pH=6.8作為最適pH。

由圖7C可以看出,隨著膠原蛋白濃度的升高,回收率和純度均呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢。在膠原濃度為6 mg/mL時,回收率和純度均達(dá)最高,回收率為85.12%,此時羥脯氨酸/總蛋白的比值為0.089。因此選擇6 mg/mL作為最適膠原濃度。對于膠原濃度大于6 mg/mL后出現(xiàn)的下降現(xiàn)象,推測可能是因?yàn)榇藭r膠原溶液濃度過高,溶液的黏度過大,導(dǎo)致酸或堿的加入很難中和膠原分子所帶的電荷。

圖7 不同沉淀時間、pH和膠原濃度對回收率和純度的影響Fig.7 Effects of sediment time,pH and collagen concentration on the recovery yield and purity注：A：沉淀時間；B:pH；C：膠原濃度。

在上述最優(yōu)條件(pH6.8,沉淀6 h,6 mg/mL)的基礎(chǔ)上進(jìn)行了驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),回收率為了85.62±1.01%,羥脯氨酸含量/總蛋白含量為0.0872。若按羥脯氨酸和膠原蛋白間的換算系數(shù)11.1計算,純度可達(dá)96.79%±1.12%。因此,該優(yōu)化條件準(zhǔn)確。

3 結(jié)論

溶解性曲線和Zeta電位法聯(lián)合確定了鱈魚皮膠原蛋白的等電點(diǎn)。利用等電點(diǎn)沉淀的原理純化了鱈魚皮膠原蛋白。結(jié)果顯示樣品的純度較高,且三螺旋結(jié)構(gòu)保持完整。這說明等電點(diǎn)純化法可以作為一個有效的辦法應(yīng)用于鱈魚皮膠原蛋白的純化。優(yōu)化結(jié)果顯示，在pH=6.8，膠原蛋白濃度為6 mg/mL時，沉淀6 h，回收率能達(dá)到85.62%±1.01%，羥脯氨酸含量/總蛋白含量能達(dá)到0.087。 等電點(diǎn)純化法能大大減少后期透析的時間,節(jié)約了時間成本,這將有利于膠原蛋白的工業(yè)化生產(chǎn)。