板栗糯米清酒中氨基酸分析及其抗氧化活性

葛祎楠,李 斌,常學(xué)東,鄒 靜,*

(1.河北科技師范學(xué)院食品科技學(xué)院,河北昌黎 066600;2.河北省板栗工程技術(shù)中心,河北昌黎 066600;3.河北省板栗產(chǎn)業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心,河北秦皇島 066000;4.河北省(承德)板栗產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院,河北承德 067000)

板栗(Castaneamollissima)是殼斗科栗屬植物,廣泛種植于我國(guó)山區(qū)。板栗營(yíng)養(yǎng)豐富,享有“干果之王”的美譽(yù)[1-3]。板栗除了富含糖類、不飽和脂肪酸[4]、維生素和微量元素外[5],還富含鞣花酸等多酚類物質(zhì),具有較好的抗氧化活性及保健作用[6]。板栗雖然營(yíng)養(yǎng)豐富,但是因?yàn)槠洳荒唾A藏[7],導(dǎo)致每年板栗在貯藏過(guò)程中損失量高達(dá)50%[8],造成了極大的經(jīng)濟(jì)損失。因此在研究板栗貯藏方法的同時(shí)[7,9-11],也應(yīng)該大力發(fā)展多種板栗深加工途徑,以減少板栗的貯藏量。

由于板栗富含淀粉和可溶性糖,因此可將其作為釀酒原料。為了更好的保留板栗中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),開(kāi)發(fā)板栗釀造酒是較為合理的方法之一。清酒是釀造酒的代表之一,雖然不同等級(jí)清酒的口感及香氣差異較大,但總體而言,清酒口感柔和順滑、香氣淡雅、不能有明顯的 “曲味”[12],易與多種菜肴配伍。

目前有關(guān)板栗釀造酒的報(bào)道主要集中于板栗淀粉的糖化工藝,如王琳等[13]以板栗和糯米為原料,加入甜酒曲,液態(tài)發(fā)酵得到香氣濃郁的板栗酒,并對(duì)香氣進(jìn)行了測(cè)定。王蔚新等[14]利用酶制劑對(duì)板栗淀粉進(jìn)行水解。葛祎楠[15-16]等對(duì)釀造糖化曲種進(jìn)行了選擇并對(duì)發(fā)酵工藝進(jìn)行了優(yōu)化。本文主要對(duì)板栗糯米清酒的氨基酸種類與含量,板栗糯米清酒的抗氧化能力進(jìn)行研究,為板栗糯米清酒的開(kāi)發(fā)以及市場(chǎng)化提供了理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大米 吉林龍羲米業(yè)有限公司;燕龍板栗 河北遷安;米曲霉(Aspergillusoryzae)2011 中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心;清酒酵母(Saccharomycescerevisiae) 實(shí)驗(yàn)室保藏菌種;DPPH(1,1-二苯基-2-苦肼基,純度≥98%)、BHA(丁基羥基茴香醚,純度≥98%)、Ferrozine(菲洛嗪,純度≥97%)、生育酚(純度≥96%) Sigma公司;其他試劑 均為國(guó)產(chǎn)分析純。

V1800型可見(jiàn)分光光度計(jì) 尤尼柯(上海)儀器有限公司;日立L-8900型氨基酸自動(dòng)分析儀 天美(中國(guó))科學(xué)儀器有限公司;1.75 L發(fā)酵缸 景德鎮(zhèn)洛薩陶瓷有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 米曲的制備 稱取大米20 g,洗凈后,浸泡24 h,淋干,裝入250 mL三角瓶,121 ℃滅菌20 min。滅菌后,冷卻到20 ℃,以無(wú)菌操作接種米曲霉(接種量為4%,以干大米質(zhì)量計(jì)),充分搖勻后,34 ℃恒溫培養(yǎng),24 h后搖動(dòng)一次,在培養(yǎng)48 h,米曲成熟。

1.2.2 酵母的活化 無(wú)菌操作下接種酵母菌于米曲汁培養(yǎng)基,28 ℃、110 r/min培養(yǎng)12 h,擴(kuò)培后的酵母菌細(xì)胞數(shù)達(dá)到1×106～2×106個(gè)/mL。

1.2.3 工藝流程及操作要點(diǎn)

1.2.3.1 釀造工藝流程

糯米清酒工藝流程同上,但不添加板栗。

1.2.3.2 操作要點(diǎn) 板栗去殼去衣后清洗;糯米清洗并浸泡12 h后瀝干水分。生板栗與糯米添加比例為1∶3混合、蒸煮、晾涼后按15%的比例加入米曲,裝缸,搭窩,28 ℃恒溫發(fā)酵,1 d后,按0.2%(以糯米質(zhì)量計(jì))接種量添加酵母,28 ℃發(fā)酵1 d后,以1∶1.9(以糯米質(zhì)量計(jì))比例加入水(用乳酸調(diào)節(jié)pH至4.2),25 ℃發(fā)酵8 d。從第3 d起,每天攪拌1次,到第9 d停止攪拌,18 ℃密閉發(fā)酵20 d。然后壓榨、粗濾、錯(cuò)流過(guò)濾后,12 ℃陳釀9個(gè)月,最后再過(guò)濾、殺菌。

1.2.4 氨基酸組分的測(cè)定 板栗清酒中氨基酸組分測(cè)定參照GB5009.124-2016[17]。吸取酒樣10 mL,置于50 mL容量瓶中,加入5%三氯乙酸20 mL,搖勻,加水稀釋至刻度,搖勻,于微孔漏斗上過(guò)濾,吸取濾液,直接裝樣于氨基酸自動(dòng)分析儀上,測(cè)定除色氨酸外的其它17種氨基酸的含量。糯米清酒測(cè)定方法同上,并計(jì)算兩種清酒中氨基酸增加倍數(shù)。

氨基酸增加倍數(shù)=板栗糯米酒氨基酸含量/糯米清酒氨基酸含量

1.2.5 總酚含量的測(cè)定 酒中總酚含量的測(cè)定采用福林-肖卡比色法[18]。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作:使用微量移液器,分別吸取250 μL濃度為0、50、100、150、250和500 mg/L沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液,加入12.5 mL蒸餾水、1250 μL福林肖卡顯色劑、5 mL 20%碳酸鈉溶液,顯色1 h后,于765 nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度,并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

酒樣總酚含量的測(cè)定:以250 μL酒樣代替沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液,測(cè)定方法同上。

1.2.6 亞油酸體系抗氧化性的測(cè)定 參考Gǜlc等[19]的檢測(cè)方法并進(jìn)行改進(jìn)。取310 μL亞油酸和350 mL吐溫-20,加入磷酸鉀緩沖液(0.04 mol/L,pH7.0),定容至50 mL,均質(zhì)制備亞油酸乳狀液。取磷酸鉀緩沖液(0.04 mol/L,pH7.0)2.5 mL、一定體積的板栗糯米清酒(50、100、200 μL)、2.5 mL亞油酸乳狀液,混勻,37 ℃避光培養(yǎng)5 d。每12 h準(zhǔn)確量取上述100 μL混合溶液,加入4.7 mL 75%乙醇、100 μL 30%硫氰酸銨溶液和100 μL FeCl2(20 mmol/L,溶于3.5% HCl中),準(zhǔn)確反應(yīng)4 min,在500 nm處測(cè)得吸光度,并計(jì)算第10次的樣品的抑制率。糯米清酒測(cè)定方法同上。以蒸餾水代替酒樣為空白對(duì)照,1 g/L BHT、BHA和生育酚作陽(yáng)性對(duì)照。

抑制率(%)=(1-A1/A0)×100

式中,A0為空白吸光度,A1為加入樣品吸光度。

1.2.7 還原力的測(cè)定 參考Siddhuraju等[20]方法并進(jìn)行改進(jìn)。取一定體積的板栗糯米清酒(50、100、150、200 μL),加入1 mL蒸餾水、2.5 mL磷酸緩沖液(0.2 mol/L,pH6.6),混勻后,加入1%鐵氰化鉀溶液2.5 mL,50 ℃水浴20 min,急速冷卻后,加入2 mL 10%三氯乙酸溶液,5000 r/min離心15 min,取5 mL上層清液,加入5 mL蒸餾水、1 mL 0.1%氯化亞鐵溶液,在700 nm處測(cè)定吸光度。糯米清酒測(cè)定方法同上。以蒸餾水調(diào)零,以1 g/L BHT(2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚)和抗壞血酸為陽(yáng)性對(duì)照。

1.2.8 金屬螯合能力的測(cè)定 參考Wang等[21]的方法進(jìn)行改進(jìn),取一定體積的板栗糯米清酒(0.2、0.4、0.6、0.8、1 mL)板栗糯米清酒于蒸餾水中,配制總體積為4.7 mL的樣品水溶液,然后加入0.1 mL 2 mmol/L氯化亞鐵溶液和0.2 mL 5 mmol/L Ferrozine,25 ℃反應(yīng)20 min。在562 nm處測(cè)吸光度。糯米清酒測(cè)定方法同上。以蒸餾水代替酒樣為空白對(duì)照,以1 g/L EDTA(乙二胺四乙酸)和檸檬酸為陽(yáng)性對(duì)照。

鰲合率(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100

式中:A0為空白吸光度,A1為加入樣品吸光度,A2為蒸餾水代替菲啰嗪溶液的吸光度

1.2.9 DPPH自由基清除能力的測(cè)定 參考Concepción等[22]的方法。吸取一定體積的板栗糯米清酒(50、100、150、200 μL),配制總體積為2 mL的樣品水溶液,加入2 mL 0.01% DPPH乙醇溶液,搖勻,30 ℃水浴恒溫30 min,在517 nm下測(cè)定吸光度。糯米清酒測(cè)定方法同上。以蒸餾水代替酒樣為空白對(duì)照,以1 g/L BHT和抗壞血酸為陽(yáng)性對(duì)照。

清除率(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100

式中:A1加入樣品吸光度,A2為無(wú)水乙醇代替DPPH溶液的吸光度,A0為蒸餾水代替樣品溶液的吸光度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組試驗(yàn)3組平行實(shí)驗(yàn),采用Excel軟件處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)并計(jì)算結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 氨基酸組分分析

氨基酸是人體必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),也是酒中重要的風(fēng)味物質(zhì)。用相同的曲種及釀造工藝分別釀造了糯米清酒和板栗糯米清酒,用氨基酸測(cè)定儀分別測(cè)定了兩款酒中氨基酸的種類及含量,平行測(cè)定3次酒樣后,取均值,結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 糯米酒和板栗糯米清酒中氨基酸種類及含量

板栗中含蛋白質(zhì) 5%～11%,含量高于稻米,并且賴氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸、蘇氨酸,纈氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸等氨基酸的含量超過(guò) FAO/WHO的標(biāo)準(zhǔn)。從表1可以看出,板栗糯米清酒富含17種氨基酸。相同工藝條件下,以板栗作為主要原料之一,可以明顯增加板栗糯米清酒中氨基酸含量,其中天冬氨酸、蘇氨酸、谷氨酸、丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸的含量是純米清酒中的二倍以上。因此板栗的添加對(duì)酒體中氨基酸的種類沒(méi)有影響,只改變了酒體中的各種氨基酸的含量。

2.2 板栗糯米清酒抗氧化性研究

2.2.1 總酚含量 酚類物質(zhì)是較強(qiáng)的體外抗氧化劑。采用福林-肖卡法測(cè)定清酒中的總酚含量,并以沒(méi)食子酸計(jì)。

由圖1可知,建立的標(biāo)曲方程為Y=0.0012X+0.0598,決定系數(shù)R2為0.9977,表明沒(méi)食子酸濃度與檢測(cè)響應(yīng)值呈良好的線性關(guān)系。

圖1 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

如圖2,總酚含量以沒(méi)食子酸等價(jià)表示,1 mL板栗糯米清酒和糯米清酒分別約含有187.1、113.2 μg酚類物質(zhì)。對(duì)比Minussi等[23]測(cè)得紅葡萄酒中的酚類物質(zhì)含量為1000～4000 μg/mL,板栗糯米清酒總酚含量較低,這可能主要是由于原料之間酚類含量的差異造成的。通過(guò)與糯米清酒的總酚含量對(duì)比,添加板栗可以明顯提高清酒總酚含量,這與板栗中的鞣花酸等酚類物質(zhì)密切相關(guān)。當(dāng)然對(duì)于酒液而言,除多酚物質(zhì)外,酒中自由氨基酸、美拉德反應(yīng)產(chǎn)物等[24]對(duì)酒的抗氧化活性也可能會(huì)有一定的影響,這有待于進(jìn)一步研究。

圖2 兩種清酒的總酚含量

2.2.2 亞油酸體系抗氧化性 采用亞油酸體系檢測(cè)樣品的抗氧化能力。通過(guò)反應(yīng)液吸光度的變化,反映樣品抗氧化能力強(qiáng)弱,吸光度越低,樣品抗氧化能力越強(qiáng)。結(jié)果如圖3。

圖3 樣品對(duì)亞油酸體系抗氧化能力

從圖3可以看出,樣品對(duì)亞油酸自氧化抑制能力強(qiáng)弱直觀表現(xiàn)為100 μL BHA>100 μL BHT>100 μL板栗糯米清酒>100 μL生育酚>100 μL糯米清酒。所測(cè)樣品吸光度均小于空白組,說(shuō)明5中樣品均可以有效抑制亞油酸自氧化。200 μL板栗糯米清酒>100 μL板栗糯米清酒>50 μL板栗糯米清酒,說(shuō)明隨著用量增加,板栗糯米清酒對(duì)亞油酸的抗氧化能力也逐漸變強(qiáng),但其抗氧化能力增幅變小。圖3中100 μL板栗糯米清酒抗氧化性明顯高于同量的糯米清酒,說(shuō)明板栗加入到糯米清酒中,可以提高酒液的抗氧化能力。96 h之后,除生育酚和空白外,其它吸光度不再增加。120 h后,所有反應(yīng)基本達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡,吸光度基本趨于穩(wěn)定。

隨著時(shí)間增加,吸光度趨于穩(wěn)定時(shí),反應(yīng)基本達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡,因此計(jì)算120 h處對(duì)亞油酸自氧化抑制率,可以準(zhǔn)確反映待測(cè)樣品對(duì)亞油酸自氧化抑制率的大小。圖4為120 h相同用量的5種樣品對(duì)亞油酸自氧化的抑制率,其中BHA、BHT的抗氧化能力較強(qiáng),自氧化抑制率分別達(dá)到96.78%和94.18%。板栗糯米清酒的抑制率為80.70%。生育酚的抑制率較弱為70.05%,糯米清酒對(duì)亞油酸自氧化抑制率最低,僅為69.73%。

圖4 100 μL樣品對(duì)亞油酸自氧化的抑制率

2.2.3 還原力 采用普魯士藍(lán)法檢測(cè)樣品的還原力。通過(guò)反應(yīng)液吸光度的變化,比較樣品還原能力強(qiáng)弱,吸光度越大,樣品還原力越強(qiáng),結(jié)果如圖5。

圖5 樣品的還原能力

由圖5可知,隨著試驗(yàn)樣品用量增加,抗壞血酸、BHT、板栗糯米清酒、糯米清酒的還原力均呈一定用量的依賴性。用量在50～200 μL時(shí),抗壞血酸對(duì)Fe3+的還原力遠(yuǎn)強(qiáng)于其它3種樣品,其他樣品的還原力強(qiáng)弱表現(xiàn)為BHT>板栗糯米清酒>糯米清酒。板栗糯米清酒的還原能力雖遠(yuǎn)不及其他兩種抗氧化劑標(biāo)品,但卻高于糯米清酒,說(shuō)明在清酒中添加板栗可以提高酒樣的還原力。當(dāng)用量超過(guò)100 μL時(shí),抗壞血酸還原力呈現(xiàn)突增趨勢(shì)。其他3種樣品的還原力增幅相對(duì)減緩,其中板栗糯米清酒的增幅最為明顯減緩。

2.2.4 金屬螯合能力 采用菲啰嗪法測(cè)定樣品的金屬螯合能力。通過(guò)反應(yīng)液吸光度的變化,比較樣品金屬螯合活性,吸光度越低,樣品金屬螯合能力越強(qiáng)。結(jié)果如圖6。

圖6 樣品的金屬螯合能力

由圖6可知,4種樣品均具有一定的金屬螯合作用。用量達(dá)到200 μL后,EDTA的金屬螯合率基本不再變化。而檸檬酸、板栗糯米清酒、糯米清酒在200～1000 μL之間時(shí),其金屬螯合能力均隨用量增加而增加。800 μL后,檸檬酸、板栗糯米清酒、糯米清酒的增幅減緩。用量為1000 μL時(shí),EDTA、檸檬酸、板栗糯米清酒以及糯米清酒的金屬螯合率分別為92.42%、19.54%、11.57%、6.57%。因此,添加板栗提高了糯米清酒的金屬螯合能力。就抗氧化劑而言,主要是通過(guò)直接方式和間接方式來(lái)實(shí)現(xiàn)抗氧化作用[23],直接方式主要為酚類物質(zhì)直接淬滅自由基;間接方式主要是通過(guò)螯合金屬離子或清除氧氣等來(lái)實(shí)現(xiàn)。圖6中1000 μL的EDTA的金屬螯合活性最高在90%以上,但是1000 μL的板栗糯米清酒卻僅為11%左右。由此猜想板栗糯米清酒主要不是通過(guò)金屬螯合性體現(xiàn)抗氧化活性的,可能是通過(guò)酚類物質(zhì)淬滅自由基體現(xiàn)的。

2.2.5 DPPH自由基清除率 DPPH是一種穩(wěn)定的紫色的自由基,抗氧化物質(zhì)可以與其自由基單電子配對(duì),使其醇溶液發(fā)生顏色變化。通過(guò)溶液吸光度變化反映自由基清除能力,吸光度越小,清除DPPH自由基能力越強(qiáng)。

由圖7中可知,4種樣品均具有清除DPPH自由基的能力,其中最強(qiáng)的為抗壞血酸,其次為BHT,板栗糯米清酒較低,糯米清酒最弱。用量達(dá)到50 μL時(shí),抗壞血酸對(duì)DPPH自由基清除率趨于穩(wěn)定,基本不再變化。用量達(dá)到100 μL后,糯米清酒、板栗糯米清酒以及BHT對(duì)DPPH自由基清除率都出現(xiàn)增長(zhǎng)減緩的趨勢(shì)。用量達(dá)到200 μL時(shí),4種樣品清除率分別為81.69%、78.74%、38.67%、23.36%。

圖7 樣品對(duì)DPPH自由基清除能力

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)板栗糯米清酒的氨基酸組分分析,發(fā)現(xiàn)板栗糯米清酒中17種氨基酸含量均高于糯米清酒中的氨基酸含量,其中天冬氨酸、蘇氨酸、谷氨酸、丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸的含量是糯米清酒中的二倍以上?？寡趸钚匝芯勘砻?板栗糯米清酒具有抑制亞油酸自氧化的能力,抑制率可達(dá)到80.70%,還原能力較強(qiáng),金屬螯合活性較低為11.57%,DPPH自由基清除率達(dá)到38.67%,總酚含量約為187.1 μg/mL,板栗糯米清酒具有較強(qiáng)的抗氧化性,優(yōu)于相同工藝的糯米清酒。板栗糯米清酒作為一種新型釀造酒,具有良好的養(yǎng)生保健功能,可以滿足人們對(duì)于功能性飲品的需求,具有進(jìn)一步研究和開(kāi)發(fā)實(shí)際的應(yīng)用價(jià)值。