基于DNA條形碼技術(shù)的海參物種鑒定

胡冉冉,邢冉冉,王 楠,葛毅強,陳 穎,*

(1.中國檢驗檢疫科學(xué)研究院,北京 100123; 2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院,北京 100083; 3.中國農(nóng)村技術(shù)開發(fā)中心,北京 100045)

海參是一種名貴海產(chǎn)品,富含多種營養(yǎng)物質(zhì),在世界各地特別是亞洲國家深受消費者的喜愛,尤其在中國的消費量最大[1-2]。目前全球可食用海參大概有60種[3],不同種的海參價格相差可高達(dá)數(shù)十倍。由于海參的自溶特性,鮮活海參的運輸較為困難,因此海參多以干制品的形式在貿(mào)易中流通。但一般加工后的海參產(chǎn)品形態(tài)學(xué)特征會全部或部分消失,使得通過形態(tài)學(xué)鑒定海參種類變得困難。在經(jīng)濟利益的驅(qū)動下,不法商人通過貼錯標(biāo)簽等形式以次充好,擾亂海參市場秩序。市場上最常見的是以刺參屬海參冒充高值仿刺參。此外,部分市售海參產(chǎn)品根據(jù)產(chǎn)地或顏色貼標(biāo),如美國海參、黑海參等,混淆了海參的物種來源。

針對海參物種的鑒別,目前主要有形態(tài)學(xué)鑒定[4]、理化鑒定[5]和分子生物學(xué)鑒定[6]方法。形態(tài)學(xué)鑒定對于形態(tài)學(xué)特征消失的海參加工制品的物種鑒定具有局限性,理化鑒定結(jié)果容易受加工過程中酸、堿的影響。以DNA為基礎(chǔ)的分子生物學(xué)檢測方法,如DNA條形碼技術(shù)(DNA barcoding)[7]、多重PCR[8]、實時熒光PCR技術(shù)[9]、聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism,PCR-RFLP)[10]等不受季節(jié)、加工方法、產(chǎn)品形態(tài)的影響,鑒別結(jié)果準(zhǔn)確度高。多重PCR和實時熒光PCR技術(shù)局限于對已知樣品的檢測。PCR-RFLP雖然在物種鑒定中已成為一種重要的方法,但種內(nèi)變異可能使目標(biāo)序列某一特定的酶切位點消失或產(chǎn)生新的酶切位點,PCR產(chǎn)物酶切片段長度差異不大,可能造成結(jié)果假陰性。DNA條形碼技術(shù)是近幾年發(fā)展迅速的一項分子生物學(xué)鑒定技術(shù),其利用通用引物擴增一段標(biāo)準(zhǔn)的、較短的DNA序列,將測序得到的序列在生命條形碼數(shù)據(jù)系統(tǒng)(The Barcode of Life Data System,BOLD)和美國國家生物技術(shù)信息中心網(wǎng)站(National Center for Biotechnology Information,NCBI)數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對,進(jìn)而實現(xiàn)物種鑒定[11]。與其他分子生物學(xué)技術(shù)不同,DNA條形碼技術(shù)是一種通用的檢測方法,具有操作簡單、快速可靠等優(yōu)勢,可廣泛應(yīng)用于未知樣品的物種鑒定[12-15]。高通量測序技術(shù)的出現(xiàn)為混合樣品的物種鑒定提供了新的工具,將DNA條形碼和高通量測序技術(shù)結(jié)合可檢出混合樣品中的未知成分,使得DNA條形碼技術(shù)在多物種混合樣品的物種鑒定中具有更廣闊的應(yīng)用前景[16]。

在動物物種鑒定中,一般將線粒體細(xì)胞色素氧化酶亞基I(cytochrome coxidase subunit I,COI)基因作為DNA條形碼研究的靶基因[17-19]。律迎春等[7]計算7種海參基于COI基因的遺傳距離并建立系統(tǒng)發(fā)育樹,發(fā)現(xiàn)海參COI種間差異較大而種內(nèi)差異較小,不同海參在系統(tǒng)發(fā)育樹中分別形成各自獨立的分支,說明COI用于海參物種鑒定的可行性。除COI外,16S核糖體RNA(16S ribosomal RNA,16S rRNA)基因亦可作為DNA條形碼使用[20-21]。Wen等[22]以16S rRNA基因為分子標(biāo)記進(jìn)行海參物種鑒定時發(fā)現(xiàn),5種市售刺參科(Stichopodidae)海參中有1個仿刺參(Apostichopusjaponicus)被暗刺參屬(Isostichopus)海參所替代。

本研究選取線粒體COI基因和16S rRNA基因片段作為海參物種鑒定的通用DNA條形碼,比較兩個靶基因的物種鑒別能力,旨在建立基于DNA條形碼技術(shù)的海參物種鑒定方法，并應(yīng)用于市售海參樣品的標(biāo)簽符合性判別,為市售海參的品種鑒別提供有效的技術(shù)方法。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

16種食用干海參:玉足海參(Holothurialeucospilota)、糙海參(Holothuriascabra)、墨西哥海參(Holothuriamexicana)、短刺烏爪參(Holothuriapoli)、長刺烏爪參(Holothuriatubulosa)、黑海參(Holothuriaatra)、黃乳海參(Holothuriafuscogilva)、圖紋白尼參(Bohadschiamarmorata)、蛇目白尼參(Bohadschiaargus)、仿刺參(Apostichopusjaponicus)、綠刺參(Stichopuschloronotus)、糙刺參(Stichopushorrens)、加州擬刺參(Parastichopuscalifornicus)、梅花參(Thelenotaananas)、大西洋瓜參(Cucumariafrondosa)、智利瓜參(Athyonidiumchilensis),分屬3科8屬。其中,玉足海參、糙海參、仿刺參由渤海大學(xué)提供,其余海參由青島?？邓a(chǎn)發(fā)展有限公司提供。以上實驗樣品均經(jīng)過形態(tài)學(xué)鑒定,具體信息見表1。2017年3月到4月從水產(chǎn)市場(9份)、海參專賣店(3份)、超市(2份)和電子商務(wù)平臺(10份)共計購買24份市售海參樣品;海洋動物組織基因組DNA提取試劑盒 天根生化科技北京有限公司;PCR Mix預(yù)混液 北京百泰克生物技術(shù)有限公司;6×上樣緩沖液、DL2000 DNA分子標(biāo)記 購自寶生物工程(大連)有限公司;瓊脂糖 購自北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司;PCR產(chǎn)物回收試劑盒 購自美國Sigma公司;PCR產(chǎn)物純化試劑盒 購自美國Affymetrix公司;5×測序緩沖液、DNA測序試劑盒BigDye 3.1、測序產(chǎn)物純化試劑盒 購自美國Applied Biosystems公司;PCR擴增引物 均由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成。

表1 收集的海參樣品信息Table 1 Information of collected sea cucumber samples

BT323S電子天平 賽多利斯科學(xué)儀器有限公司;Venticell烘箱 德國MMM公司;PICO17臺式離心機 美國Thermo Fisher Scientific公司;Research可調(diào)量程移液器、BioPhotometer plus紫外分光光度計 德國Eppendorf公司;200/2.0 Power Supply電泳儀、Versa Doc 4000MP凝膠成像系統(tǒng) 美國BIO-RAD公司;Veriti 96孔熱循環(huán)梯度PCR儀、ABI3500基因分析儀 美國Applied Biosystems公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 DNA提取 收集的干海參和市售海參分別取2～3個整塊樣品在液氮中研磨成細(xì)小微粒,收集到干凈離心管中。分別稱取30 mg的海參組織樣品,用海洋動物組織基因組DNA提取試劑盒提取DNA,按照試劑盒說明書操作,對個別不易裂解的樣品適當(dāng)延長裂解時間,最后用去離子水代替洗脫緩沖液TE溶解DNA。取DNA原液5 μL溶于45 μL去離子水中,以去離子水作為空白對照,使用紫外分光光度計在波長260 nm紫外線下檢測DNA的濃度,并以O(shè)D260/OD280比值判斷DNA純度。一般DNA純品的OD260/OD280為1.7～2.0,若OD260/OD280>2.0,表明有RNA的污染,OD260/OD280<1.7則表明DNA中有蛋白質(zhì)、酚等污染。

1.2.2 PCR擴增COI通用引物[23]為COIe-F(5′-ATAATGATAGGAGGRTTTGG-3′)和COIe-R(5′-GCTCGTGTRTCTACRTCCAT-3′)。16S rRNA基因通用引物[24]為16Sar(5′-CGCCTGTTTATCAAAAACAT-3′)和16Sbr(5′-CTCCGGTTTGAACTCAGATCA-3′)。

PCR反應(yīng)體系總體積為25 μL:上、下游引物各1 μL(引物濃度10 μmol/L),2×PCR Mix預(yù)混液12.5 μL,DNA模板10 ng,用滅菌雙蒸水補足體積至25 μL。擴增程序:94 ℃ 5 min;94 ℃ 50 s,引物COIe-F/R退火溫度46 ℃ 1 min,16Sar/Sbr退火溫度52 ℃ 1 min,72 ℃ 60 s,35個循環(huán);最后72 ℃延伸10 min;4 ℃保存。PCR產(chǎn)物均用2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳,電壓110 V 30 min,將目的片段電泳條帶單一且明亮的PCR產(chǎn)物純化回收。

1.2.3 測序 將純化后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙向測序,測序反應(yīng)體系總體積10 μL:PCR純化產(chǎn)物1 μL,5×測序緩沖液1 μL,BigDye 3.1 1 μL,引物1.6 μL(1 μmol/L),無菌水5.4 μL。PCR擴增反應(yīng)條件為:96 ℃ 2 min;96 ℃ 30 s,50 ℃ 40 s,60 ℃ 4 min,30個循環(huán);4 ℃保存。采用測序產(chǎn)物純化試劑盒進(jìn)行純化,每管吸取10 μL上清液于96孔板中,于ABI 3500基因分析儀進(jìn)行測序。

1.3 數(shù)據(jù)處理

1.3.1 序列比對及分析 使用DNAStar7.0[25]軟件中的SeqMan程序?qū)y序成功的序列進(jìn)行拼接,將拼接好的序列經(jīng)過MEGA6.0軟件進(jìn)行多重序列比對,刪除兩端引物序列。將處理過的COI序列分別在BOLD中的公共DNA條形碼數(shù)據(jù)庫(Public Record Barcode Database)和NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對鑒定物種來源;16S rRNA基因序列在GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對得到物種信息。

1.3.2 系統(tǒng)發(fā)育樹分析 根據(jù)序列比對結(jié)果,從NCBI網(wǎng)站下載部分相關(guān)海參物種的COI參考序列與16S rRNA基因參考序列。將樣本序列與下載的基因序列采用MEGA6.0軟件進(jìn)行多重序列比對后,基于K-2-P(Kimura-2-parameter)[26]模型構(gòu)建鄰接法(N-J法)系統(tǒng)發(fā)育樹,Bootstrap自展檢測1000,驗證DNA條形碼鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2 結(jié)果與分析

2.1 海參COI、16S rRNA基因片段擴增

用紫外分光光度計測得海參樣品DNA的A260 nm/A280 nm比值在1.6～1.8之間,說明所提取的海參基因組DNA純度好,可用于常規(guī)PCR擴增。擴增結(jié)果顯示被測的16種海參樣品均擴增出長度為690 bp的COI目的片段和長度為560 bp的16S rRNA基因目的片段(圖1),PCR產(chǎn)物可用于下一步的測序。

圖1 海參樣品COI和16SrRNA基因的擴增結(jié)果Fig.1 PCR amplification of COI and 16S rRNA gene of sea cucumbers samples注:A:海參樣品COI目的片段的擴增B:海參樣品16S rRNA基因目的片段的擴增;M:DL 2000 分子量標(biāo)準(zhǔn);1:H. leucospilota(玉足海參);2:H. scabra(糙海參);3:H. mexicana(墨西哥海參);4:H. poli(短刺烏爪);5:H. tubulosa(長刺烏爪);6:H. atra(黑海參);7:H. fuscogilva(黃乳海參);8:B. marmorata(圖紋白尼參);9:B. argus(蛇目白尼參);10:A. japonicus(仿刺參);11:S. horrens(糙刺參);12:S. chloronotus(綠刺參);13:P. californicus(加州擬刺參);14:T. ananas(梅花參);15:A. chilensis(智利瓜參);16:C. frondosa(大西洋瓜參);17:空白對照。

2.2 COI和16S rRNA基因?qū)⒌奈锓N鑒別能力分析

本研究對收集的16種海參先進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定,然后基于DNA條形碼技術(shù),以線粒體COI和16S rRNA基因分別作為靶基因,通過序列比對得到海參的物種信息,評價COI與16S rRNA基因?qū)κ秤煤⒌奈锓N鑒別能力。

目前用于物種鑒定的16S rRNA基因數(shù)據(jù)庫只有GenBank數(shù)據(jù)庫,而COI基因數(shù)據(jù)庫有GenBank數(shù)據(jù)庫[27]和BOLD數(shù)據(jù)庫[28],考慮到許多科學(xué)家并不同時向BOLD和GenBank數(shù)據(jù)庫提交COI序列信息[29],綜合兩個數(shù)據(jù)庫的比對結(jié)果更能保證COI基因鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性。研究表明基于COI和16S rRNA基因的海參種內(nèi)遺傳距離均低于2%[26,30],因此在進(jìn)行序列比對時相似度≥98%的可判定為同一物種,低于95%的認(rèn)定為不同種,而相似度介于95%～98%的需結(jié)合其他方法進(jìn)一步驗證。根據(jù)COI序列相似度結(jié)果,16種海參中除糙刺參(Stichopushorrens)外,其余15種的鑒定結(jié)果與形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果一致,物種序列相似度均≥99%,其中6種海參的結(jié)果結(jié)合了BOLD數(shù)據(jù)和GenBank數(shù)據(jù)庫的鑒定結(jié)果?；?6S rRNA基因14種海參能夠得到準(zhǔn)確鑒定,標(biāo)注為黃乳海參(Holothuriafuscogilva)和糙刺參(Stichopushorrens)目前已將本研究獲得的BOLD數(shù)據(jù)庫缺少的海參COI序列信息上傳至BOLD數(shù)據(jù)庫。的海參無法鑒定出明確物種(表2)。

表2 海參樣品基于COI和16S rRNA基因的物種鑒定結(jié)果Table 2 Identification results of sea cucumber samples based on COI and 16S rRNA gene

COI與16S rRNA基因都是目前用于海參系統(tǒng)進(jìn)化和遺傳多樣性研究的重要目的基因。在進(jìn)化速率上,16S rRNA基因相對COI來說在線粒體基因中更為保守[31]。COI序列沒有插入或缺失位點,16S rRNA基因序列有部分插入或缺失位點,而且COI的變異位點大于16S rRNA基因[32]。比較COI和16S rRNA基因的鑒定結(jié)果發(fā)現(xiàn),兩種靶基因均能較好的鑒定出海參物種,14種海參的鑒定結(jié)果一致,兩個例外是糙刺參(Stichopushorrens)和黃乳海參(Holothuriafuscogilva)。糙刺參(Stichopushorrens)的COI序列和16S rRNA基因序列分別與單疣刺參(Stichopusmonotuberculatus)、花刺參(Stichopushermanni)的物種序列相似度達(dá)99%,因此無法將糙刺參、單疣刺參以及花刺參區(qū)分開。黃乳海參(Holothuriafuscogilva)則是基于COI序列可準(zhǔn)確鑒別但其16S rRNA基因序列在GenBank數(shù)據(jù)庫的物種序列相似度低于90%,僅鑒定到科,無法有效鑒定到種名,可能與GenBank數(shù)據(jù)庫中缺乏黃乳海參的16S rRNA基因參考序列有關(guān)。DNA條形碼技術(shù)用于物種準(zhǔn)確鑒定需要完整和準(zhǔn)確的DNA序列數(shù)據(jù)庫作為支撐。目前海參DNA條形碼數(shù)據(jù)庫并不完整,部分海參品種的基因序列未上傳數(shù)據(jù)庫,在一定程度上限制了DNA條形碼技術(shù)的應(yīng)用。因此,必須進(jìn)一步完善DNA條形碼數(shù)據(jù)庫,提高數(shù)據(jù)庫中DNA序列的數(shù)量和質(zhì)量。

鑒于本研究中擴增得到的部分海參COI序列在BOLD數(shù)據(jù)庫無匹配(表2),為了豐富海參品種的線粒體DNA序列信息,為今后對海參品種進(jìn)行更精確的分析、鑒定奠定基礎(chǔ)。根據(jù)BOLD數(shù)據(jù)庫要求,已將本研究獲得的BOLD數(shù)據(jù)庫缺少的海參COI序列信息上傳至BOLD數(shù)據(jù)庫。

2.3 系統(tǒng)發(fā)育樹分析

基于K-2-P模型分別得到海參COI序列的N-J系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)和16S rRNA基因序列的N-J系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3),在進(jìn)化樹中樣品以序號-物種種名表示。兩個靶基因的系統(tǒng)發(fā)育樹均顯示海參科白尼參屬的圖紋白尼參和蛇目白尼參親緣關(guān)系最近;刺參科的加州擬刺參和仿刺參的親緣關(guān)系較近;糙刺參與花刺參、單疣刺參的親緣關(guān)系較近聚為單支(100%的置信度),然后與其他刺參屬海參再聚在一起;其他海參物種都分別聚為獨立的一支?；诜N內(nèi)和種間遺傳差異的系統(tǒng)發(fā)育樹驗證了DNA條形碼鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性。

圖2 基于COI構(gòu)建的海參物種N-J系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Neighbor-joining phylogenetic tree of sea cucumbers based on COI

圖3 基于16S rRNA基因構(gòu)建的海參物種N-J系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Neighbor-joining phylogenetic tree of sea cucumbers based on 16S rRNA gene

本研究基于COI和16S rRNA基因的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示糙刺參、單疣刺參和花刺參的親緣關(guān)系較近,與Uthicke等[26]和文菁等[33]的研究結(jié)果一致。Uthicke等[26]研究了47種海參的COI序列和系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系,豐富了海參COI序列數(shù)據(jù),基于遺傳距離的系統(tǒng)發(fā)育樹也表明COI可用于大部分海參的物種鑒定,系統(tǒng)發(fā)育樹中糙刺參和單疣刺參聚為單支。文菁等[33]基于16S rRNA基因序列對我國15種重要經(jīng)濟海參物種的親緣關(guān)系進(jìn)行了研究,分子系統(tǒng)發(fā)育的結(jié)果符合傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)分類結(jié)果,在系統(tǒng)發(fā)育樹中花刺參與糙刺參兩者聚為一簇。因此COI或16S rRNA基因?qū)τ谟H緣關(guān)系較近的部分海參物種,即種間序列差異較小的海參物種無法實現(xiàn)準(zhǔn)確鑒定,說明單一靶標(biāo)在DNA條形碼技術(shù)應(yīng)用于海參物種鑒定方面存在一些不足。未來DNA條形碼技術(shù)的發(fā)展趨勢之一是多個基因聯(lián)合標(biāo)記的DNA條形碼物種鑒定方法[34],以鑒定進(jìn)化關(guān)系近、序列差異小的近源種。本研究建議在海參物種鑒定中,綜合COI和16S rRNA兩種靶基因,然后在GenBank和BOLD兩個數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對,選擇一致的物種作為鑒定結(jié)果。同時,本研究首次基于16S rRNA基因序列分析海參屬的黃乳海參與其他海參物種的親緣關(guān)系,與COI序列的系統(tǒng)發(fā)育樹不同,在16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹中黃乳海參與白尼參屬先聚為一簇,再與海參屬聚為一簇,其原因還有待進(jìn)一步研究。

2.4 市售海參產(chǎn)品標(biāo)簽名稱符合性分析

采用建立的DNA條形碼方法對24份市售海參進(jìn)行鑒定,結(jié)果表明基于COI序列24份海參產(chǎn)品中21份可鑒別出明確物種(3號墨西哥小有刺參、9號豬婆參、18號刺參除外);而基于16S rRNA基因序列可鑒別出22份海參(9號豬婆參和10號黑香參樣品除外)(表3)。將兩個靶基因的鑒定結(jié)果結(jié)合起來,除了9號豬婆參樣品無法得到鑒定,其余23份海參均可得到海參種名。9號豬婆參COI和16S rRNA基因的鑒定結(jié)果均顯示其物種序列相似度小于90%,可能與兩個數(shù)據(jù)庫中COI序列和16S rRNA基因序列缺乏有關(guān)。

表3 市售海參樣品的鑒定結(jié)果Table 3 Identification results of commercial sea cucumber samples

在被測的24份市售海參產(chǎn)品中,大部分海參標(biāo)注的為俗名。將DNA條形碼鑒定結(jié)果與標(biāo)簽名稱比對,10份樣品標(biāo)簽名稱與DNA條形碼鑒定結(jié)果一致,6份樣品與DNA條形碼鑒定結(jié)果不一致(8號黑海參、9號豬婆參、11號靴參、18號刺參、20號花刺參和21號白刺參),如11號樣品將阿氏輻肛參(Actinopygaagassizi)標(biāo)為價格更高的白底輻肛參(Actinopygamauritiana),18號樣品將經(jīng)濟價值較低的、形態(tài)類似的糙刺參(Stichopushorrens)標(biāo)記為經(jīng)濟價值較高的仿刺參(Apostichopusjaponicus),21號樣品將挪威擬刺參(Parastichopustremulus)標(biāo)為花刺參(Stichopusherrmanni),存在虛假標(biāo)識,以次充好,標(biāo)簽混亂的情況。24份樣品中,有8份只標(biāo)注了某類海參的總稱,既非俗名,也非分類學(xué)上的物種名稱,如1號禿參、2號和3號小有刺參、4號小黑刺參、7號米刺參、10號黑香參、12號海參絲和23號夢貝海參,利用DNA條形碼技術(shù)對其鑒定可得到海參物種的準(zhǔn)確信息(表3)。

3 結(jié)論

以COI和16S rRNA基因作為靶基因建立的DNA條形碼方法可有效適用于海參物種鑒定。對于某些親緣關(guān)系較近的海參物種,應(yīng)結(jié)合COI和16S rRNA的鑒定結(jié)果,加強多基因條形碼技術(shù)的研究,彌補單一靶標(biāo)的局限性,使鑒定結(jié)果更加準(zhǔn)確。此外,DNA條形碼數(shù)據(jù)庫的完整性直接關(guān)系DNA條碼方法的適用性,應(yīng)進(jìn)一步完善DNA數(shù)據(jù)庫,以充分發(fā)揮其在海參物種鑒定中的作用。基于建立的DNA條形碼方法對市售海參樣品鑒定,結(jié)果大部分市售海參的標(biāo)簽符合性較差,存在標(biāo)識混亂、標(biāo)簽錯誤的現(xiàn)象。由于消費者對海參品種的認(rèn)識較少,加之海參市場監(jiān)管的不完善,經(jīng)銷商以貼錯標(biāo)簽的形式用價格相對便宜的低值物種替代高值物種欺騙消費者或者濫用海參的方言名稱迷惑消費者,通過不同種海參間的價格差獲取巨大的經(jīng)濟利益。鑒于上述原因,海產(chǎn)品正確的標(biāo)簽對海鮮貿(mào)易的經(jīng)銷商、消費者和食品監(jiān)管部門來說都是必不可少的,因此必須要加強海參的標(biāo)簽符合性監(jiān)管。本研究中的DNA條形碼方法可對海參品種進(jìn)行鑒定,為海參進(jìn)出口檢測和市場監(jiān)管提供科學(xué)依據(jù)。