川芎醇提物抗氧化活性及抗食源性致病菌特性分析

葛慧芳,孫明飛,葉 佳,陳繼承

(福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院,福建福州 350002)

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)[1-2]、大腸桿菌(Escherichiacoli)[3]、沙門(mén)氏菌(Salmonella)[4]、銅綠假單胞菌(Pseudomonas)[5]及枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)[6]等食源性致病菌廣泛存在于日常飲食中,引起食品腐敗,造成重大經(jīng)濟(jì)損失的同時(shí),誤食還會(huì)引發(fā)胃炎、腸炎、呼吸道感染等不同程度的疾病,已成為全球嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題。目前,化學(xué)試劑雖能實(shí)現(xiàn)防腐保鮮,但對(duì)人體造成的危害不容小覷,研究和開(kāi)發(fā)天然防腐劑顯的尤為重要。中草藥具有高效、低毒、無(wú)污染以及廣譜抗菌性等優(yōu)點(diǎn),應(yīng)用于食品的防腐與保鮮效果顯著[7-8],且市場(chǎng)前景廣闊。

川芎藥材是傘形科植物川芎(Ligusticumchuanxiong)干燥根莖,主要活性成分包括阿魏酸[9-10]、川芎嗪[11]、揮發(fā)油等,其中生物堿川芎嗪(TMP)又是食品中Maillard反應(yīng)的重要風(fēng)味產(chǎn)物[12],常用來(lái)做為食品添加劑。臨床研究發(fā)現(xiàn)川芎具有清除自由基[13]、抑制脂質(zhì)過(guò)氧化[14]、抗菌消炎[15]等作用。川芎臨床復(fù)方制劑 “十味敗毒湯”、“四物湯”就有較好的抗菌活性[16-17]?？浊锷彽萚8]將川芎作為天然防腐劑應(yīng)用于果蔬的加工與貯藏,可以很好地抑制真菌的生長(zhǎng)。阿魏酸也具有較好的抗菌消炎[18-19]、抗病毒作用[20]。肖乃玉[21]通過(guò)將阿魏酸與膠原蛋白相結(jié)合制備出抗菌膜應(yīng)用于臘腸的保鮮,可以很好地延長(zhǎng)臘腸的貨架期。但目前有關(guān)川芎醇提物抗氧化及抑制食品中常見(jiàn)致病菌的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究分析了川芎醇提物的還原力、總抗氧化能力、對(duì)羥自由基和超氧陰離子的清除效果及其對(duì)常見(jiàn)食源性致病菌的抑制效果,為川芎醇提物應(yīng)用于食品防腐保鮮提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌 均由福建農(nóng)林大學(xué)微生物室提供;川芎 產(chǎn)地四川,生產(chǎn)許可證20160084;TMP、沒(méi)食子酸及阿魏酸標(biāo)品及福林試劑 上海源葉生物科技有限公司;阿莫西林分散片 石藥集團(tuán)中諾藥業(yè)有限公司;總抗氧化能力(T-AOC)測(cè)定試劑盒、羥自由基測(cè)定試劑盒、超氧陰離子測(cè)定試劑盒 南京建成生物工程研究所;營(yíng)養(yǎng)瓊脂(蛋白胨10.0 g/L、牛肉粉3.0 g/L、氯化鈉5.0 g/L、瓊脂15.0 g/L)、EC肉湯(胰酪胨20 g/L、3號(hào)膽鹽1.5 g/L、磷酸氫二鉀4.0、磷酸二氫鉀1.5 g/L、乳糖5.0 g/L、氯化鈉5.0 g/L) 北京陸橋股份有限公司;其他試劑 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

G154 DWS立式自動(dòng)壓力蒸汽滅菌器 廈門(mén)致微儀器有限公司;HBS-1096A酶標(biāo)分析儀 南京德鐵實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;FDU-1200真空冷凍干燥機(jī) 上海愛(ài)朗儀器公司;LC-2030C島津高效液相色譜儀 日本島津制作;BSD-150震蕩培養(yǎng)箱 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 川芎醇提物與菌液的制備 稱(chēng)取川芎粉末5 g,加95%乙醇浸潤(rùn)0.5 h后,按照1∶8 (v/v)加入95%乙醇回流提取2次,每次提取1.5 h,合并提取液后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至2 mL,并至-20 ℃冷凍,最后用冷凍干燥機(jī)凍干,得黃褐色川芎醇提物干燥粉末[13]。

從4 ℃冰箱里取上述5種致病菌菌株各一管(菌接種于試管斜面培養(yǎng)基中,培養(yǎng)后于4 ℃冰箱內(nèi)保存,分別加入pH7.4 的PBS緩沖液5 mL進(jìn)行洗脫得5種菌原液,再用pH7.4 的PBS緩沖液5倍稀釋后使用。

1.2.2 川芎醇提物活性成分測(cè)定 參照Ge等[13]的方法測(cè)定川芎醇提物中TMP、阿魏酸及游離酚結(jié)合酚的含量。其中TMP與阿魏酸的測(cè)定采用HPLC法。HPLC色譜條件:C18柱(4.6 mm×150 mm);進(jìn)樣量:10 μL。流動(dòng)相:甲醇-1%冰醋酸溶液(45∶55,V/V);流速:1 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):310 nm。實(shí)驗(yàn)中TMP、阿魏酸及沒(méi)食子酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)分別為:y=8.97x-40.32(R2=0.9994);y=16884x+36257(R2=0.9944)。

游離酚與結(jié)合酚通過(guò)丙酮與堿提取制得,再用福林酚法測(cè)定含量。具體操作如下:用80%丙酮(1∶5,V/V)提取川芎醇提物中的游離酚,用2 mol/L NaOH去堿化川芎醇提物后再用80%丙酮(1∶5,V/V)提取,制得總酚酸,結(jié)合酚的含量為總酚酸與游離酚的差值。最后以蒸餾水為參照,通過(guò)96孔板測(cè)定不同濃度樣品的吸光度。每孔加樣品50 μL、0.2 mol/L福林試劑100 μL,再加100 μL 7.5% Na2CO3,避光反應(yīng)10 min后在760 nm處測(cè)定吸光度。實(shí)驗(yàn)中以沒(méi)食子酸標(biāo)品為參照,其標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程為y=0.0017x+0.0422(R2=0.9995)。

1.2.3 川芎醇提物還原力測(cè)定 參照王振斌的方法[22],取VC標(biāo)準(zhǔn)品配制成20、40、60、80、100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液,取不同濃度VC溶液各1 mL,分別加入2.5 mL pH6.6 PBS與2.5 mL 1%鐵氰化鉀,充分混勻后于50 ℃反應(yīng)20 min,冷卻后取上清液2 mL與2 mL蒸餾水、0.4 mL 0.1%三氯化鐵混勻,室溫反應(yīng)10 min后于700 nm處測(cè)定吸光度,并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),得標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程為:y=0.0084 x+0.0377(R2=0.997)。20 mg/mL川芎醇提物100倍稀釋后,以VC為對(duì)照測(cè)定吸光度A值,將A代入標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)中即可得出提取物相對(duì)VC的還原力大小。

1.2.4 川芎醇提物抗氧化能力測(cè)定 川芎醇提物清除超氧陰離子與羥自由基的效果及總抗氧化能力的測(cè)定參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。其中以不同濃度VC標(biāo)準(zhǔn)品為陽(yáng)性對(duì)照。

1.2.5 試藥抑菌效果測(cè)定 取100 μL菌與營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基混勻,冷卻凝固后均勻打孔,每孔中分別加入30 μL的抑菌劑,于37 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h后,測(cè)定各培養(yǎng)皿中透明抑菌圈的大小,每組3個(gè)平行。本次試驗(yàn)中各抑菌劑分別為:125 g/L的阿莫西林水溶液、100 g/L的TMP水溶液(50 ℃溶解)、濃度分別為75、100、150及200 g/L的川芎醇提物水溶液(此處選擇水溶液是避免乙醇的殺菌作用干擾,本試驗(yàn)中各抑菌劑均能溶于水)。

1.2.6 川芎醇提物抑制食源性致病菌MIC及MBC測(cè)定 采用二倍比稀釋法[23]測(cè)定川芎醇提物對(duì)5種食品中常見(jiàn)致病菌的最小抑菌濃度(MIC)與最小殺菌濃度(MBC)。具體操作如下:取11支潔凈試管,依次標(biāo)號(hào),其中一號(hào)管為陰性對(duì)照管,2～9號(hào)管中各加入1 mL肉湯培養(yǎng)基,再將1 mL 100 g/L的川芎醇提物溶液加到2號(hào)管中,混勻后取1 mL加入到3號(hào)管中,依次進(jìn)行二倍比稀釋。

以觀察陽(yáng)性組呈現(xiàn)渾濁狀,陰性組呈透明狀為前提,若藥物組試管中出現(xiàn)渾濁,說(shuō)明有細(xì)菌生長(zhǎng)(+),相反若試管內(nèi)澄清透明,證明無(wú)菌生長(zhǎng)(-),進(jìn)一步結(jié)合藥物組試管的渾濁度,判斷抑菌藥物的抑菌效果,越澄清,抑菌效果越好,其中肉眼觀察出現(xiàn)渾濁前一試管的藥物濃度記為MIC,并取出現(xiàn)渾濁試管中的菌液進(jìn)行鏡檢,觀察是否有菌存在。如藥液有很深的色素,可重新接種后觀察,若培養(yǎng)皿上無(wú)菌生長(zhǎng),說(shuō)明藥物具有殺菌的作用,無(wú)菌落出現(xiàn)的前一試管藥物濃度記為MBC。

1.2.7 菌落生長(zhǎng)曲線(xiàn) 菌落生長(zhǎng)曲線(xiàn)參照Liu等[24]的方法并做部分修改。具體操作如下:分別取上述5種食源性致病菌原液10倍稀釋后取15 μL,分別加入到15 mL肉湯培養(yǎng)基中,每種菌接種4管,每管加入100 μL不同濃度川芎醇提物(1/4 MIC、1/2 MIC、3/4 MIC),以同體積無(wú)菌水代替川芎醇提物為對(duì)照。將各試管置于37 ℃,120 r/min的搖床中培養(yǎng),每隔2 h在無(wú)菌條件下取樣,在660 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度以反映微生物生長(zhǎng)狀態(tài),繪制供試菌的生長(zhǎng)曲線(xiàn)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 川芎醇提物中活性成分含量

通過(guò)HPLC測(cè)定得川芎醇提物中TMP、阿魏酸含量分別為55.7、31.45 g/kg。福林酚法測(cè)得游離酚與結(jié)合酚的含量分別為177.38、42.86 g/kg。

2.2 川芎醇提物還原力及抗氧化能力測(cè)定

參照“1.2.3”測(cè)定方法,川芎醇提物稀釋100倍后的還原力相當(dāng)于14.79 μg/mL VC標(biāo)準(zhǔn)溶液的還原力。按照試劑盒測(cè)的川芎醇提物的總抗氧化能力為4.46 U/mg。川芎醇提物對(duì)羥自由基與超氧陰離子的抑制效果如圖1所示。從圖1(A、B)中可以看出,川芎醇提物對(duì)羥自由基的清除效果較超氧陰離子要好,其中川芎醇提物濃度在0.9 mg/mL時(shí)對(duì)超氧陰離子的清除率約為50%,即IC50約為0.9 mg/mL,與0.4 mg/mL VC的清除效果相當(dāng)。同樣,川芎醇提物對(duì)羥自由基的清除效果IC50約為0.75 mg/mL,此濃度條件下VC對(duì)羥自由基的清除率為84.56%,約為川芎醇提物的1.7倍。

圖1 川芎醇提物對(duì)羥自由基(A)與超氧陰離子(B)的清除效果Fig.1 Clearance rate of Ligusticum chuanxiong extract on hydroxy radicals(A)and superoxide anion(B)

2.3 抑菌劑抗食源性致病菌的效果

試驗(yàn)中不同濃度的抑菌劑對(duì)5種食品中常見(jiàn)致病菌的抑制效果如表1和圖2所示,其中阿莫西林作為陽(yáng)性對(duì)照藥物,對(duì)5種致病菌均有較好抑制作用,且對(duì)沙門(mén)氏菌的抑制效果最好,其抑菌圈最高能達(dá)到32.92 mm。125 g/L阿莫西林溶液對(duì)5種試驗(yàn)菌的抑制效果為:沙門(mén)氏菌>大腸桿菌>假單胞菌>金黃色葡萄球菌>枯草芽孢桿菌,且差異極顯著(p<0.01)。等價(jià)濃度下,TMP與阿魏酸標(biāo)品對(duì)5種試驗(yàn)菌的抑制效果比川芎醇提物弱,可能是由于其藥物半衰期短引起的[25-26],劉亞杰[27]通過(guò)將TMP進(jìn)行衍生化后,衍生化物的抗菌活性顯著提高。川芎醇提物對(duì)5種試驗(yàn)菌的抑制效果為:沙門(mén)氏菌>大腸桿菌>假單胞菌>金黃色葡萄球菌>枯草芽孢桿菌,抑菌圈大小存在明顯的濃度依賴(lài)性,此結(jié)果與高慧娟等[28]用75%的川芎醇提物對(duì)金黃葡萄球菌的抑制作用強(qiáng)于枯草芽孢桿菌結(jié)果一致。150 g/L與200 g/L 川芎醇提物對(duì)各試驗(yàn)菌間的抑制效果均呈極顯著差異(p<0.01)。200 g/L 川芎醇提物對(duì)大腸桿菌的和沙門(mén)氏菌的抑制效果分別為125 g/L阿莫西林的80.68% 與76.85%。同樣,從表1中可以發(fā)現(xiàn),當(dāng)川芎醇提物濃度為75 g/L時(shí),其對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌及假單胞菌的抑制效果均優(yōu)于125 g/L阿莫西林。綜上,川芎醇提物具有較好的抗菌活性,且對(duì)革蘭氏陰性菌的抑制作用較革蘭氏陽(yáng)性菌的要強(qiáng)。100 g/L純品TMP和阿魏酸的抗菌活性比川芎醇提物要弱,而川芎醇提物中這兩種組分含量為55.7、31.45 g/kg,含量極低,考慮可能是川芎醇提物中酚酸類(lèi)物質(zhì)起到主要的抗菌作用,多組分之間也存在一定的協(xié)同效果[29],從而表現(xiàn)出較高的抗菌活性。

圖2 川芎醇提物及阿莫西林對(duì)試驗(yàn)菌的抑菌效果Fig.2 Antibacterial effect of Ligusticum chuanxiong alcohol extract and amoxicillin on the test bacterials注:A～E依次為200 g/L川芎醇提物對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、 枯草桿菌、沙門(mén)氏菌及假單胞菌的抑制效果圖,F為125 g/L阿莫西林對(duì)大腸桿菌的抑制效果圖。

表1 不同抑菌劑對(duì)5種食源性致病菌的抑菌效果Table 1 Antimicrobial effects of different antimicrobial agents on 5 kinds of food-born pathogens

2.4 川芎醇提物抑制食品中致病菌的MIC與MBC測(cè)定

對(duì)上述5種食品中常見(jiàn)致病菌進(jìn)行倍比稀釋后測(cè)定MIC值,其MIC測(cè)定結(jié)果如表2所示,隨著藥液濃度的增加,菌液渾濁度呈下降趨勢(shì)。取各試驗(yàn)組MIC管前一管進(jìn)行鏡檢,鏡檢結(jié)果顯示枯草桿菌與金黃色葡萄球菌呈現(xiàn)藍(lán)紫色,其他3種呈現(xiàn)紅色。

表2 川芎醇提物對(duì)5種食源性致病菌的最小抑菌濃度(g/L)Table 2 MIC of Ligusticum chuanxiong alcohol extract against the 5 food-born pathogens(g/L)

川芎醇提物對(duì)5種試驗(yàn)菌的MBC與MIC具體濃度如表3所示,整體的MIC介于6.25～25 g/L之間,MBC介于12.5～50 g/L之間。同時(shí),從表3可以看出,川芎醇提物對(duì)沙門(mén)氏菌的敏感性最高,抑菌效果最好,結(jié)果與前面的敏感性結(jié)果一致。實(shí)驗(yàn)結(jié)果較唐杰等[15]用紙片擴(kuò)散法測(cè)定75%的川芎醇提物對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌及沙門(mén)氏菌的抑制效果要好,說(shuō)明此試驗(yàn)方法中川芎醇提物提取有效成分含量更多,打孔法做抗菌實(shí)驗(yàn)效果更佳。

表3 5種食源性致病菌的MIC與MBC(g/L)Table 3 MIC and MBC of the 5 food-born pathogens(g/L)

圖3 川芎醇提物對(duì)5種食源性致病菌生長(zhǎng)曲線(xiàn)的影響Fig.3 Influence of Ligusticum chuanxiong alcohol extract on growth curve of 5 food-born pathogens注:A為大腸桿菌,B為金黃色葡萄球菌,C為枯草芽孢桿菌,D為沙門(mén)氏菌, E為銅綠假單胞菌。MIC為最小抑菌濃度,對(duì)照組不加抑菌劑。

2.5 川芎醇提物對(duì)革蘭氏菌生長(zhǎng)曲線(xiàn)的影響

川芎醇提物對(duì)5種革蘭氏菌生長(zhǎng)曲線(xiàn)的影響如圖2所示,其中A～E分別為大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、沙門(mén)氏菌、假單胞菌的生長(zhǎng)曲線(xiàn),各種菌隨著時(shí)間的增長(zhǎng)其吸光度值均呈上升趨勢(shì),與對(duì)照組相比,隨著川芎醇提物濃度的提升,其吸光度度值均有下降。其中圖A、D中在前6 h的吸光度增加的比較快,而往后則逐漸平緩,此時(shí)處于細(xì)菌生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)期,說(shuō)明川芎醇提物在大腸桿菌與沙門(mén)氏菌的對(duì)數(shù)期對(duì)其有一定的抑制,肖悅等[30]發(fā)現(xiàn)川芎可以抑制葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的活性,減少水不溶性葡聚糖的合成,本文的結(jié)果與此一致,沙門(mén)氏菌與大腸桿菌在對(duì)數(shù)期被抑制。圖B、C、E中,前8 h檢測(cè)的吸光度值較A、D都要低,細(xì)菌生長(zhǎng)緩慢,菌落長(zhǎng)時(shí)間處于遲緩期,川芎醇提物的添加改變了環(huán)境條件不利于革蘭氏陽(yáng)性菌生長(zhǎng),8 h細(xì)菌適應(yīng)了生長(zhǎng)環(huán)境,生長(zhǎng)相對(duì)較快,最后趨向穩(wěn)定。上述結(jié)果表明川芎醇提物對(duì)5種致病菌的生長(zhǎng)影響不同,大腸桿菌與沙門(mén)氏菌對(duì)數(shù)期受抑制,其他三種革蘭氏陽(yáng)性菌的遲緩期被延長(zhǎng)。

3 結(jié)論

川芎醇提物具有較強(qiáng)的抗氧化活性,存在濃度依賴(lài)性。對(duì)常見(jiàn)的食源性致病菌沙門(mén)氏菌、大腸桿菌、假單胞菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌等具有較好的抑制效果,尤其是沙門(mén)氏菌、大腸桿菌,總體來(lái)說(shuō)其對(duì)革蘭氏陰性菌的抑制效果優(yōu)于陽(yáng)性菌。在格蘭氏陰性菌對(duì)數(shù)期與格蘭氏楊陽(yáng)性菌的遲緩期作用效果尤為顯著,MIC介于6.25～25 g/L之間,MBC介于12.5～50 g/L之間。等價(jià)濃度下川芎醇提物的抑菌效果優(yōu)于純品TMP和阿魏酸,可能是提取物中各組分之間存在一定協(xié)同作用。本文僅初步研究了川芎醇提物的抗氧化和抗菌活性,其抗菌機(jī)理及組分間的協(xié)同效應(yīng)有待進(jìn)一步研究。