基于酪蛋白酸鈉/EGCG/阿拉伯膠自組裝構(gòu)建EGCG納米粒及其形成機制研究

黃煒超,劉春花,羅旭洸,王淑惠,周愛梅,*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,廣東廣州 510642; 2.廣東省功能食品活性物重點實驗室,廣東廣州 510642)

茶葉中富含的表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)是一種極具開發(fā)前景的抗氧化、抗腫瘤功能活性物質(zhì),但其脂溶性較差,遇到高溫或堿性條件,易發(fā)生氧化分解,且降解速度隨著溫度、pH、氧化濃度的增加而加快,限制了其在醫(yī)藥和食品等行業(yè)的應(yīng)用[1]。構(gòu)建活性物質(zhì)運載體系可以有效的解決功能活性物口服利用度低這一瓶頸問題[2]。納米乳液(Nanoemulsion)作為活性物質(zhì)運載體系中的一種,是大小范圍在10～1000 nm不等的膠體顆粒體系[3],其可以對藥物增容和包裹,提高活性物質(zhì)溶解度和穩(wěn)定性,同時由于體積微小,可在血液循環(huán)系統(tǒng)中自由流動,因此較容易吸收和代謝,降低毒副作用[4]。在安全性上要求構(gòu)建納米粒的材料應(yīng)為一般認為安全(Generally recognized as safe,GRAS)級別,同時要具有良好的生物相容性和生物可降解性。以往報道的一些納米粒的構(gòu)建涉及使用具有潛在毒性的溶劑或不可降解的材料,增加了口服利用的難度[5]。蛋白質(zhì)和多糖是兩類重要的食品大分子,它們通過相互作用形成的納米粒具有良好的生物相容性和可降解性,同時具有更為突出的承載效果和靶向性[6]。因此利用蛋白質(zhì)與多糖作為構(gòu)建納米體系的材料是近年來納米領(lǐng)域的研究熱點[7]。

酪蛋白酸鈉(sodium caseinate,SC)具有親水基團和疏水基團,因此具有良好的親水性、乳化性、表面活性等,又因其具有良好的穩(wěn)定性、成膠性和自組裝特性,無毒副作用,高營養(yǎng)價值,可作為制備納米載體的良好材料[8]。阿拉伯膠(gum arabic,GA)是一種安全無害的增稠劑,具有良好的親水親油性、水溶性和乳化穩(wěn)定性,也是理想的載體材料[9]。目前未見到利用SC、GA自組裝構(gòu)建EGCG納米粒的研究。因此,本研究基于SC、EGCG和GA三者自組裝構(gòu)建EGCG納米粒,在前期研究SC與GA自組裝構(gòu)建空載SC-GA納米粒的基礎(chǔ)上,以EGCG和SC的濃度比、SC和GA總濃度為因素,以粒徑及其分布、Zeta電位、包封率和載藥量為指標,研究形成高載藥量且穩(wěn)定性好的SC-EGCG-GA納米粒的條件,同時考察了納米粒的微觀形貌和貯藏穩(wěn)定性,最后采用紅外光譜、熒光光譜和圓二色譜對納米粒結(jié)構(gòu)進行表征,探討納米粒的形成機制。以期為EGCG新型功能性食品的研發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

酪蛋白酸鈉(純度98%)、阿拉伯膠(純度97%) 美國Sigma公司;EGCG,純度98%(HPLC) 日本TCI公司;甲醇(色譜純) 美國 J.T.Baker公司;其他試劑 均為國產(chǎn)分析純;Millipore Amicon Ultra-0.5超濾離心管 上海優(yōu)寧維生物科技股份有限公司。

90 plus納米粒度及Zeta電位儀 美國布魯克海文儀器有限公司;LC-10ATVP plus高效液相色譜儀 日本島津公司;VERTEX 70傅里葉變換紅外光譜儀 德國Bruker公司;RF-5301PC熒光分光光度計 日本島津制作所;JEM-2100F場發(fā)射電子顯微鏡 日本電子株式會社;Chirascan圓二色光譜儀 英國應(yīng)用光物理公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 SC-EGCG-GA納米粒的制備

1.2.1.1 SC-EGCG-GA納米?；鞈乙旱闹苽?分別配制濃度為10 mg/mL的SC、GA和EGCG母液,在轉(zhuǎn)速為400 r/min、25 ℃下攪拌的10 mmol/L NaCl體系中(pH6.0),按照相應(yīng)比例加入一定體積的SC母液,之后逐滴加入相應(yīng)比例的EGCG母液,避光攪拌30 min,隨后逐滴加入相應(yīng)比例的GA母液,用鹽酸調(diào)節(jié)pH至4.2,避光攪拌2 h,得到SC-EGCG-GA納米粒混懸液。

1.2.1.2 SC-EGCG-GA納米粒制備條件研究 本研究在前期研究的基礎(chǔ)上,固定SC和GA濃度比1∶1,pH4.2,NaCl濃度10 mmol/L,以EGCG和SC的濃度比(1∶10、1∶8、1∶6、1∶5、1∶4、3∶10、1∶3、2∶5和1∶2,固定SC和GA總濃度為1.5 mg/mL)和SC、GA總濃度(0.25、0.75、1.2、1.5、1.8、2 mg/mL,固定EGCG和SC的濃度比為2∶5)為因素,以粒徑及其分布(多分散指數(shù),polydispersity index,PDI)、表面帶電量、包封率和載藥量為指標,研究形成高載藥量且穩(wěn)定性好的SC-EGCG-GA納米粒的條件。

1.2.2 包封率及載藥量的測定 參照Hu等[10]的方法并稍作改進,采用超濾離心法測定EGCG的包封率和載藥量。將0.5 mL SC-EGCG-GA納米?；鞈乙貉b入截留分子量為3000 Da 的超濾離心管中,4 ℃下12000 r/min 離心30 min,分別收集外管內(nèi)離心后的液體和內(nèi)管的納米粒沉淀(凍干后稱量即為納米粒的總質(zhì)量),通過HPLC檢測超濾管中游離EGCG的含量。

HPLC檢測條件:色譜柱:Eclipse Plus C18反相色譜柱(5 μm,4.6×250 mm,Agilent);檢測器:島津SPD-10A;檢測波長:280 nm;柱溫25 ℃;流速:1 mL/min;進樣量:10 μL;流動相:A相為0.1%乙酸水溶液,B相為100%的甲醇溶液;梯度洗脫程序:30% B等度洗脫20 min。其中EGCG的包封率和載藥量按照式1、2計算:

包封率(%)=(EGCG總投藥量-游離EGCG量)/EGCG總投藥量×100

式(1)

載藥量(μg/mg)=(EGCG總投藥量-游離EGCG量)/納米?？傎|(zhì)量

式(2)

1.2.3 納米粒貯藏穩(wěn)定性研究 參照Li等[11]的方法并稍作修改,將制備的納米?；鞈乙撼涞?添加4‰的疊氮鈉作為防腐劑,于4 ℃下避光分別貯藏7、15、30 d后進行粒徑、電位的表征,通過HPLC測定EGCG各個貯藏時間下納米粒中EGCG含量,通過式3計算EGCG的保留率。

EGCG保留率(%)=貯藏指定時間時樣品中被包埋的EGCG的含量/貯藏前樣品中被包埋的EGCG的含量

式(3)

1.2.4 SC-EGCG-GA納米粒的表征

1.2.4.1 粒徑測定 取上述方法制備的SC-EGCG-GA納米粒混懸液適量于樣品池中,通過激光動態(tài)光散射法(DLS)測定納米粒在水中的流體力學(xué)直徑Dh(Particle size)和多分散指數(shù)(PDI)。

1.2.4.2 表面Zeta電位測定 將上述方法制備的SC-EGCG-GA納米?；鞈乙杭尤氲綐悠烦?/3高度處,趕走氣泡,將鈀電極插入溶液中,連上插頭,關(guān)上儀器外蓋,利用Zeta電位儀測定納米粒的Zeta電位。

1.2.4.3 微觀形貌分析 采用透射電子顯微鏡(transmission electron microscopy,TEM)觀察SC-EGCG-GA納米粒的表觀形態(tài)及大小。參照Lu等[12]的方法稍作修改,將干凈的銅網(wǎng)浸沒于SC-EGCG-GA納米?；鞈乙褐泻笕〕?2 min后用濾紙吸去多余的納米?；鞈乙?用2%的磷鎢酸染色3 min后吸取多余的染液,自然風(fēng)干后進行電鏡觀察,測試加速電壓為80 kV。

1.2.4.4 紅外光譜分析 參考前人[13-14]的方法稍作修改,取少許EGCG、SC、GA,SC和GA為1∶1研磨混合的混合物,SC、GA和EGCG比例為5∶5∶2研磨混合的混合物,凍干的SC-GA納米粒、凍干的SC-EGCG-GA納米粒,分別按1∶100的比例與溴化鉀混合研磨,經(jīng)壓片機壓成透明的薄片,在4000～400 cm-1的范圍以4 cm-1的分辨率掃描32次,采集樣品圖譜,環(huán)境溫度為25 ℃。在與測試樣品相同的條件下采集背景。

1.2.4.5 熒光發(fā)射光譜 參照前人[14-15]的方法稍作修改,固定SC濃度為0.5 mg/mL,按EGCG:SC(摩爾比)為0∶1、1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、6∶1、12∶1、15∶1的比例分別制備SC-EGCG復(fù)合物、SC-EGCG-GA納米粒復(fù)合物(GA濃度為0.5 mg/mL),分別在298和308 K的溫度下進行測定。測定過程中固定激發(fā)波長λex=280 nm,激發(fā)狹縫和發(fā)射狹縫分別為5、3 nm。熒光掃描速度1200 nm/min,掃描范圍分別300～500 nm。實驗過程中用電子循環(huán)水浴控制樣品溫度。

1.2.4.6 同步熒光光譜 參照前人[14-15]的方法稍作修改,固定SC濃度為0.5 mg/mL,按EGCG∶SC(摩爾比)為0∶1、1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、6∶1、12∶1、15∶1的比例分別制備SC-EGCG復(fù)合物、SC-EGCG-GA納米粒復(fù)合物(GA濃度為0.5 mg/mL),在298 K溫度下進行測定。當激發(fā)和發(fā)射波長差(Δλ)設(shè)為60 nm時,固定激發(fā)波長λex=265 nm,激發(fā)和發(fā)射狹縫均為2.5 nm,掃描范圍為205～550 nm;當Δλ設(shè)為15 nm時,熒光激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度分別為5、2.5 nm,測定體系在250～550 nm范圍內(nèi)的同步熒光光譜。實驗過程中用電子循環(huán)水浴控制樣品溫度。

1.2.4.7 圓二色譜分析 參照Ayah[13]的方法稍作修改,固定SC濃度為0.125 mg/mL,按 EGCG:SC(摩爾比)為0∶1、1∶1、2∶1、4∶1的比例分別制備SC-EGCG復(fù)合物、SC-EGCG-GA納米粒復(fù)合物(GA濃度為0.125 mg/mL)。以去離子水作為空白對照,測定190～260 nm波長范圍內(nèi)樣品的圓二色譜,測定溫度25 ℃,比色皿光徑0.1 cm,步進1.0 nm,帶寬1.0 nm,響應(yīng)時間0.5 s。使用CDNN軟件計算樣品中蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)(α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲)的含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)采用Origin 9.0軟件作圖,SPSS Statistics 17.0.1軟件進行方差分析,所有實驗均重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 SC-EGCG-GA納米粒的制備

2.1.1 EGCG和SC濃度比對SC-EGCG-GA納米粒物理性質(zhì)的影響 不同EGCG和SC濃度比對SC-EGCG-GA納米粒物理性質(zhì)的影響如表1所示。由表1可知,隨著EGCG和SC濃度比的增大,納米粒的粒徑均逐漸增大直至濃度比達到1∶2時,體系產(chǎn)生沉淀,可能是因為SC是一種富含脯氨酸的蛋白質(zhì),與EGCG具有較強的親和力[16],SC和GA濃度一定,隨著EGCG濃度的增大,與SC結(jié)合的EGCG分子越多,形成的復(fù)合物粒徑逐漸增大,但當EGCG濃度增加到一定范圍,隨著EGCG濃度的繼續(xù)增大,EGCG作為多齒狀配基,繼續(xù)與復(fù)合物發(fā)生橋連形成二聚體或多聚體[17],所以體系出現(xiàn)沉淀。在體系未出現(xiàn)沉淀的比例范圍內(nèi),各組的粒徑均小于200 nm。

表1 EGCG和SC濃度比對SC-EGCG-GA納米粒物理性質(zhì)的影響Table 1 Effects of concentration ratio of EGCG to SC on the physical properties of SC-EGCG-GA nanoparticles

隨著EGCG和SC濃度比的增大,Zeta電位的絕對值先減小后增大,主要原因在于SC與GA粒子表面的電荷與EGCG的表面電荷相反,當EGCG濃度較低時發(fā)生電中和,當EGCG濃度較高時EGCG表面的電荷得不到中和,體系顯示和EGCG一樣的電性且數(shù)值增大[18]。其中在EGCG和SC濃度比為2∶5時,Zeta絕對值達到最大(超過15 mV),與其他組具有顯著性差異(p<0.05)。

各濃度比下PDI均小于0.2,表明體系納米粒粒徑分布均勻,在濃度比2∶5時達到最小,與其他組具有顯著性差異(p<0.05)。EGCG包封率隨著EGCG和SC濃度比的增大逐漸減小(p<0.05),載藥量逐漸增大(p<0.05),這與Tang等[19]在研究聚谷氨酸與EGCG濃度比對聚谷氨酸-EGCG-殼聚糖納米粒中EGCG包封率和載藥量影響得到的結(jié)論一致。此外,在EGCG和SC濃度比為2∶5時,納米粒載藥量達到最大(338.49 μg/mg)。綜合以上各個指標,為了得到載藥量高、穩(wěn)定性好的納米粒,確定EGCG與SC的濃度比為2∶5。

2.1.2 SC和GA總濃度對SC-EGCG-GA納米粒物理性質(zhì)的影響 不同SC和GA總濃度對SC-EGCG-GA納米粒物理性質(zhì)的影響見表2。由表2可知,納米粒的粒徑隨著SC和GA總濃度的增加而增大,當總濃度達到1.8 mg/mL時,體系即有沉淀產(chǎn)生,研究表明只有當體系中兩種聚電解質(zhì)(如研究中的SC和GA)總濃度小于某一濃度時,才可以形成納米粒,在此濃度范圍內(nèi),納米粒的粒徑隨著總濃度的增加而增加,而當總濃度超過這一臨界濃度時,體系會發(fā)生相分離而產(chǎn)生沉淀[20]。各濃度體系下的PDI均小于0.2,在總濃度1.5 mg/mL時達到最小,與其他各組間差異性顯著(p<0.05)。此外,隨著SC和GA總濃度的增加,Zeta電位的絕對值逐漸增大(p<0.05),在總濃度為1.5 mg/mL時達到最大(大于15 mV),這是因為在體系不發(fā)生相變產(chǎn)生沉淀的濃度范圍內(nèi),隨著SC和GA總濃度的增大,SC和GA各自的有效電荷密度增大,所以形成納米粒的Zeta電位絕對值增大[21];納米粒的包封率和載藥量也逐漸增大,當 SC和GA濃度比一定,隨著SC和GA總濃度的增大,SC濃度也相應(yīng)增大,結(jié)合EGCG的能力增強,所以表現(xiàn)為包封率和載藥量增大,且在SC和GA總濃度為1.5 mg/mL時達到最大。

表2 SC和GA總濃度對SC-EGCG-GA納米粒物理性質(zhì)的影響Table 2 Effects of concentration of SC and GA on the physical properties of SC-EGCG-GA nanoparticles

綜上所述,要形成穩(wěn)定的納米粒,體系中SC和GA的總濃度不能太高(小于1.8 mg/mL),其中在總濃度為1.5 mg/mL時,納米粒粒徑小于200 nm,PDI小于0.2,Zeta電位絕對值大于15 mV,且包封率和載藥量均達到最大。結(jié)合2.1.1結(jié)果,在SC和GA濃度比為1∶1、pH為4.2及NaCl濃度為10 mmol/L的條件下,選擇EGCG與SC濃度比為2∶5、SC與GA總濃度為1.5 mg/mL制備納米粒。

2.2 SC-EGCG-GA納米粒微觀形貌分析

在EGCG、SC和GA三者濃度比為2∶5∶5、SC和GA總濃度為1.5 mg/mL、pH4.2、NaCl濃度10 mmol/L的條件下制備SC-EGCG-GA納米粒,通過TEM觀測納米粒在干態(tài)的形貌,如圖1所示。TEM結(jié)果顯示干態(tài)納米粒子呈球形,分散均勻,粒徑平均分布在180 nm左右,接近于激光粒度儀測得的平均粒徑。

圖1 SC-EGCG-GA納米粒透射電鏡圖Fig.1 Transmission electron micrographs of SC-EGCG-GA nanoparticles

2.3 SC-EGCG-GA納米粒貯藏穩(wěn)定性研究

SC-EGCG-GA納米粒貯藏穩(wěn)定性結(jié)果如圖2 所示。在貯藏15 d時粒徑和電位無顯著性差異(p>0.05),貯藏30 d時粒徑增大(p<0.05),Zeta電位絕對值降低(p<0.05),EGCG保留率逐漸降低(p<0.05),但在30 d時保留率仍在80%以上,表明納米粒對EGCG具有良好的保護作用。此外在30 d的貯藏時間段內(nèi),納米粒處于穩(wěn)定的范圍,粒徑均在200 nm以內(nèi),PDI均小于0.2,Zeta電位絕對值均大于15 mV,說明制備的SC-EGCG-GA納米顆粒在溶液中具有很強的穩(wěn)定性,EGCG滲出率小,納米粒不易解離和聚集。

圖2 貯藏時間對SC-EGCG-GA納米粒物理性質(zhì)的影響Fig.2 Effects of storage time on the physical properties of SC-EGCG-GA nanoparticles注:圖中不同的字母表示不同貯藏 時間內(nèi)具有顯著性差異(p<0.05)。

2.4 SC-EGCG-GA納米粒形成機制研究

2.4.1 紅外光譜分析 為了表征EGCG、SC和GA相互作用前后表面基團的變化,以探討SC-EGCG-GA納米粒形成的機制,對EGCG、SC、GA、SC和GA兩者的混合物、SC-GA納米粒、三者的混合物和SC-EGCG-GA納米粒的紅外光譜進行考察(見圖3)。EGCG的紅外光譜(a)顯示EGCG有很多特征吸收峰,如3556,3478,3356和3274 cm-1處酚-OH的伸縮振動,1691和1615 cm-1處沒食子酸-C=O的伸縮振動,SC、EGCG、GA物理混合物(f)同時包含有SC、EGCG和GA的特征吸收峰,而SC-EGCG-GA納米粒(g)中EGCG的特征吸收峰消失,表明EGCG可能被包裹在了納米粒的內(nèi)部,或者EGCG基團與SC和GA作用導(dǎo)致紅外峰發(fā)生位移。此外,SC在2962和2872 cm-1處-CH3的反對稱和對稱伸縮振動可以用于研究SC-EGCG-GA納米粒中疏水相互作用的存在與否[22]。由圖中(g)可知,SC-EGCG-GA納米粒在兩處的吸收峰沒有位移,說明在形成納米粒時,疏水相互作用不是主要驅(qū)動力。

圖3 不同樣品的紅外光譜圖Fig.3 FTIR spectra of different samples注:a:EGCG,b:SC,c:GA,d:SC和GA混合物, e:SC-GA空載納米粒,f:EGCG、SC和 GA混合物,g:SC-EGCG-GA納米粒。

2.4.2 熒光光譜分析

2.4.2.1 熒光發(fā)射光譜 蛋白質(zhì)是具有熒光特性的大分子,因色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸等氨基酸殘基具有苯環(huán)結(jié)構(gòu),是蛋白質(zhì)內(nèi)源熒光的主要來源。SC的熒光主要來自于色氨酸和酪氨酸,且熒光強度均在波長280 nm附近激發(fā)[23]。因此可以通過色氨酸和酪氨酸的SC自身熒光的猝滅研究EGCG與SC、GA之間的相互作用,從而探討三者形成納米粒的機制。圖4a、4b和4c、4d分別顯示了激發(fā)波長280 nm時,不同溫度、不同濃度EGCG對SC-EGCG復(fù)合物和SC-EGCG-GA納米粒復(fù)合物熒光發(fā)射光譜的影響。從圖中可以看出發(fā)射波長在364 nm左右出現(xiàn)峰值,此時激發(fā)波長為280 nm;相同溫度,SC中色氨酸和酪氨酸發(fā)射峰的熒光強度隨EGCG濃度增加而降低,表明EGCG與SC的相互作用使SC內(nèi)源熒光規(guī)律性猝滅;當EGCG濃度和溫度都固定時,SC-EGCG-GA納米粒復(fù)合物的熒光強度高于SC-EGCG復(fù)合物,說明GA的加入使EGCG對SC的熒光猝滅作用減弱,這可能是因為GA與EGCG競爭性的結(jié)合SC,在一定程度上抑制了SC與EGCG的結(jié)合所致[23]。Liang等[24]在研究花青素、溶菌酶和GA三者相互作用時也得到類似的結(jié)論。

圖4 SC-EGCG復(fù)合物和SC-EGCG-GA納米粒復(fù)合物熒光發(fā)射光譜Fig.4 Fluorescence emission spectra of SC-EGCG complexes and complexes of SC-EGCG-GA nanoparticles 注:a、b:298、308 K下SC-EGCG復(fù)合物;c、d:298、308 K下SC-EGCG-GA納米粒復(fù)合物; 1～8:EGCG∶SC(摩爾比)為0∶1、1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、6∶1、12∶1、15∶1。

根據(jù) Stern-Volmer 方程可以判斷熒光猝滅類型為動態(tài)猝滅或靜態(tài)猝滅[25]。

式(4)

其中,F0表示加入猝滅劑時體系的熒光強度,F表示不加入猝滅劑時體系的熒光強度;[Q]為猝滅劑濃度(mol/L),Ksv為Stern-Volmer 猝滅常數(shù)(L/mol),Kq為雙分子猝滅速率常數(shù)(L·mol-1·s-1),各類熒光猝滅劑對生物大分子的最大猝滅常數(shù)約為2.0×1010 L·mol-1·s-1,τ0為無猝滅劑時熒光大分子的平均壽命,一般約為10-8s。

根據(jù)Stern-Volmer方程,以[Q]為自變量,F0/F為因變量,通過線性擬合得到不同溫度下SC-EGCG復(fù)合物和SC-EGCG-GA納米粒復(fù)合物的Stern-Volmer曲線擬合方程、Ksv和Kq,結(jié)果見表3。由表3可知,Ksv隨著溫度的升高而減小,表明EGCG對SC的熒光猝滅為靜態(tài)猝滅[26]。而不同溫度下GA對SC的熒光猝滅速率常數(shù)Kq均大于猝滅劑對生物大分子的最大猝滅速率常數(shù)2×1010L·mol-1·s-1,進一步說明EGCG對SC的熒光猝滅為靜態(tài)猝滅,這與其他小分子與SC相互作用的現(xiàn)象一致[27]。

表3 不同溫度下SC-EGCG復(fù)合物和SC-EGCG-GA納米粒復(fù)合物的Stern-Volmer方程常數(shù)和曲線擬合方程Table 3 Stern-Volmer quenching constants and curves fitted equation of SC-EGCG complexes and complexes of SC-EGCG-GA nanoparticles at different temperatures

根據(jù)以下雙對數(shù)方程可以得到靜態(tài)猝滅過程中分子之間的表觀結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點數(shù)[28]:

式(5)

其中,F0表示加入GA時體系的熒光強度,F表示不加入GA時體系的熒光強度;[Q]為GA濃度(mol/L);Ka為表觀結(jié)合常數(shù);n為結(jié)合位點數(shù);[Q]為猝滅劑的濃度(mol/L)。

表4 不同溫度下SC-EGCG復(fù)合物和SC-EGCG-GA納米粒復(fù)合物的表觀結(jié)合常數(shù)和曲線擬合方程Table 4 Binding constants and curves fitted equation of SC-EGCG complexes and complexes of SC-EGCG-GA nanoparticles at different temperatures

可根據(jù)以下Lineweaver-Burk雙倒數(shù)函數(shù)關(guān)系式求得小分子對SC靜態(tài)猝滅結(jié)合常數(shù)[30-31]:

式(6)

ΔG=-RTlnK

式(7)

ln(K2/K1)=(1/T1-1/T2)ΔH/R

式(8)

ΔG=ΔH-TΔS

式(9)

多酚和蛋白質(zhì)之間可能存在的相互作用力包括氫鍵、疏水相互作用、靜電相互作用和范德華力等,利用相互作用的熱力學(xué)參數(shù)可以推斷EGCG與SC相互作用的機制。其中疏水相互作用使體系ΔH>0,ΔS>0;范德華力和氫鍵使體系ΔH<0,ΔS<0;靜電相互作用使體系ΔH≈0,ΔS>0[32]。

經(jīng)線性擬合得到不同溫度下SC-EGCG復(fù)合物和SC-EGCG-GA納米粒復(fù)合物的Lineweaver-Burk雙倒數(shù)函數(shù)關(guān)系式,并計算得到熱力學(xué)參數(shù)見表5。由表5可知ΔG<0,說明EGCG與SC的結(jié)合過程是自發(fā)的;ΔH<0,說明結(jié)合過程會釋放熱量,升高溫度不利于EGCG和SC的結(jié)合;ΔH和ΔS都為負值,證明EGCG與SC之間結(jié)合的作用力包括氫鍵和范德華力。鑒于范德華力相比于氫鍵強度很弱,所以EGCG與SC結(jié)合的主要作用力為氫鍵。此外比較ΔH的絕對值可以得到,EGCG與SC結(jié)合的氫鍵數(shù)目較納米粒多,說明在SC中加入GA可以抑制SC與EGCG結(jié)合發(fā)生聚集,提高體系的穩(wěn)定性[27]。

表5 不同溫度下SC-EGCG復(fù)合物和SC-EGCG-GA納米粒復(fù)合物的 Lineweaver-Burk猝滅常數(shù)、曲線擬合方程和相關(guān)熱力學(xué)參數(shù)Table 5 Lineweaver-Burk quenching constants,curves fitted equation and thermodynamic parameters of SC-EGCG complexes and complexes of SC-EGCG-GA nanoparticles at different temperatures

2.4.2.2 同步熒光光譜 具有熒光特性的氨基酸殘基所處環(huán)境極性的改變可通過同步熒光光譜反映,氨基酸最大發(fā)射波長的變化可以用來推斷蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化。固定激發(fā)波長差Δλex=15 nm和Δλex=60 nm得到的同步熒光光譜分別代表酪氨酸和色氨酸殘基的特征光譜。氨基酸最大發(fā)射波長若發(fā)生藍移,表明蛋白質(zhì)微環(huán)境的疏水性增強,肽鏈折疊的程度增加;若發(fā)生紅移,表明蛋白質(zhì)微環(huán)境的疏水性降低,肽鏈伸展的程度增加[33]。

圖5a、5b、5c、5d分別顯示了SC-EGCG復(fù)合物和SC-EGCG-GA納米粒復(fù)合物酪氨酸和色氨酸的同步熒光光譜。從圖中可以看出隨著EGCG濃度的增加,SC-EGCG和SC-EGCG-GA納米粒中酪氨酸和色氨酸殘基的熒光強度均顯著降低。此外,酪氨酸和色氨酸的最大發(fā)射波長均發(fā)生紅移,說明EGCG與SC的結(jié)合使SC構(gòu)象發(fā)生了改變,SC中的酪氨酸、色氨酸殘基所處的微環(huán)境疏水性下降,親水性增加,肽鏈更趨向于伸展狀態(tài),而且色氨酸的紅移程度更大,證明SC的熒光主要源于色氨酸殘基,EGCG與SC的結(jié)合位點更靠近于色氨酸殘基[34]。

圖5 SC-EGCG復(fù)合物和SC-EGCG-GA納米粒復(fù)合物同步熒光光譜酪氨酸Fig.5 Synchronous fluorescence spectra of SC-EGCG complexes and complexes of SC-EGCG-GA nanoparticles注:a、b:Δλ=15 nm;c、d:Δλ=60 nm;1～8:EGCG∶SC(摩爾比)為0∶1、1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、6∶1、12∶1、15∶1。

2.4.3 圓二色譜分析 EGCG濃度對SC-EGCG復(fù)合物和SC-EGCG-GA納米粒復(fù)合物二級結(jié)構(gòu)的影響見圖6a、6b。根據(jù)圖譜信息利用CDNN軟件計算樣品SC中各種二級結(jié)構(gòu)(α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲)的含量,結(jié)果見表6。由圖6可知SC有明顯的負峰的波長范圍為在200～235 nm,可以得到其二級結(jié)構(gòu)中含其二級結(jié)構(gòu)含α-螺旋和β-折疊,且隨著EGCG濃度的增大,208 nm處的負峰值不斷增大,說明α-螺旋含量降低;經(jīng)過CDNN軟件計算得到β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲含量增加。以上變化表明EGCG與SC之間的相互作用會對SC的二級結(jié)構(gòu)造成影響,EGCG與SC之間分子間氫鍵的形成使SC分子內(nèi)部氫鍵含量減少,α-螺旋含量降低,從而導(dǎo)致SC中多肽鏈的構(gòu)象更加趨向于折疊、伸展化[34]。此外,未加入EGCG時,SC與SC-GA納米粒復(fù)合物相比,α-螺旋含量增加,無規(guī)則卷曲含量降低,這可能是因為GA與SC的靜電斥力大于靜電引力,同時存在于GA中的空間位阻可以起到穩(wěn)定SC的作用,從而使SC處于有序狀態(tài)[35]。由于GA的加入,使得SC-EGCG-GA納米粒α-螺旋含量降低的程度低于單純的SC,說明加入GA后,GA與SC的靜電相互作用在一定程度上抑制了EGCG與SC的結(jié)合,有利于維持SC構(gòu)象的穩(wěn)定,這與熒光光譜得到的結(jié)論相一致。

表6 SC-EGCG復(fù)合物和SC-EGCG-GA納米粒復(fù)合物各種二級結(jié)構(gòu)的含量Table 6 The percentage of secondary structure of SC-EGCG complexes and complexes of SC-EGCG-GA nanoparticles

圖6 SC-EGCG復(fù)合物及SC-EGCG-GA納米粒復(fù)合物的圓二色譜Fig.6 CD spectra of SC-EGCG complexes and complexes of SC-EGCG-GA nanoparticles 注:a:SC-EGCG復(fù)合物;b:SC-EGCG-GA納米粒復(fù)合物; 1～4:EGCG∶SC(摩爾比)為0∶1、1∶1、2∶1、4∶1。

2.4.4 SC-EGCG-GA納米粒形成機制探討 結(jié)合粒度表征、熒光光譜和圓二色譜結(jié)果得到GA的加入會在一定程度上抑制SC與EGCG聚集產(chǎn)生沉淀,針對多糖抑制蛋白質(zhì)和多酚的形成聚集體目前存在著兩種可能的機制:①多糖可以和蛋白質(zhì)、多酚形成三者復(fù)合物,多糖可以提高復(fù)合物的水溶性,進而抑制蛋白質(zhì)與多酚發(fā)生聚集;②多糖與蛋白質(zhì)競爭性的結(jié)合多酚,通過對多酚進行包埋進而達到抑制其與蛋白質(zhì)聚集的效果[36]。前期實驗通過對GA與EGCG二元體系的濁度表征發(fā)現(xiàn)不管體系中兩者的比例、總濃度如何變化,二者形成的混合體系濁度接近于零,體系狀態(tài)都表現(xiàn)為澄清透明的狀態(tài),而濁度可以有效的表征兩種物質(zhì)復(fù)合凝聚的過程,它在一定程度上可以反應(yīng)分散質(zhì)的大小,濁度越大,說明體系中大分子顆粒物的數(shù)量越多[37],所以初步推斷GA與EGCG之間的相互作用不明顯或GA分子鏈中的氧原子與EGCG中的羥基可能發(fā)生結(jié)合形成氫鍵,但這個結(jié)合過程是可逆的[38]。綜上,GA抑制SC和EGCG發(fā)生聚集的機制屬于第一種。

3 結(jié)論

SC、EGCG和GA三者自組裝形成穩(wěn)定的SC-EGCG-GA納米粒的條件為EGCG/SC/GA濃度比2∶5∶5、SC和GA總濃度1.5 mg/mL、pH4.2、NaCl濃度10 mmol/L,此時形成的納米粒粒徑約為173.52 nm,Zeta電位約為-19.94 mV,包封率約為62.82%,載藥量達到338.49 μg/mg,于4 ℃貯藏30 d后穩(wěn)定性好。TEM結(jié)果顯示納米粒呈球形,根據(jù)FTIR、熒光光譜和CD結(jié)果,推測納米粒可能的形成機制為首先SC與EGCG通過氫鍵結(jié)合,GA加入后SC中的NH3和GA中的COO-通過靜電相互作用結(jié)合,在一定程度上可以抑制SC與EGCG的過度結(jié)合與聚集,起到穩(wěn)定三者復(fù)合物的作用,三者通過以上非共價作用自組裝形成納米粒。本研究首次通過SC、EGCG和GA三者自組裝構(gòu)建納米粒并對納米粒的形成機制進行研究,為蛋白質(zhì)/多酚/多糖自組裝構(gòu)建納米粒的理論體系提供有意義的補充。