巨噬細胞p38絲裂原活化蛋白激酶信號通路促進抗結核菌感染作用

盛青 鄒威鳳 周強 周曉婷 黎希

廣州市胸科醫(yī)院呼吸內科（廣州510095）

【關鍵字】 p38 絲裂原活化蛋白激酶；結核分枝桿菌；結核??；菌落形成單位；骨髓來源的巨噬細胞

固有免疫反應除了作為保護宿主免受病原體感染的第一道防線，在抗病原菌感染中發(fā)揮重要作用之外，還可通過產生各種特異性細胞因子和趨化因子來激活宿主的適應性免疫反應［1］。其中巨噬細胞可利用其細胞表面或胞內的模式識別受體（pattern recognition receptor，PRRs）識別病原體相關分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs），激活細胞內一系列信號分子，如絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK），其中包括p38 MAPK、胞外調節(jié)蛋白激酶和c-Jun 氨基末端激酶等信號分子，這些信號分子可促進細胞因子和趨化因子的表達，并進一步促進機體的適應性免疫反應，從而在抗病原菌感染中發(fā)揮重要作用。雖然許多干預措施側重于調節(jié)適應性免疫系統，但固有免疫反應對于宿主保護也是至關重要的［2］。研究發(fā)現在結核菌感染巨噬細胞過程中，p38 MAPK 信號通路可促進感染細胞內吞噬體的成熟［3］和細胞凋亡進程［4］，另外也介導巨噬細胞內TNF-α和IL-6 的表達［1］，這些發(fā)現提示巨噬細胞內p38 MAPK 信號通路在抗結核菌感染過程中具有重要作用，然而，p38 MAPK信號通路是否能夠抑制巨噬細胞內結核菌的存活尚不可知。因此，本文將研究巨噬細胞內p38 MAPK 信號通路在抗結核菌感染中的具體作用和分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 SPF 級8～10 周齡雄性C57BL/6 小鼠10 只，體質量（18 ± 0.5）g，由深圳第三人民醫(yī)院肝病研究所提供。

1.1.2 主要儀器和試劑 ACK LYSING BUFFER（Invitrogen），重組小鼠M-CSF（peprotech），DMEM培養(yǎng)基（Gibco），胎牛血清（Gibco），結核菌H37Ra（上海楚瑞生物有限公司），Phospho-p38 MAPK（Thr180/Tyr182）（28B10）Human mAb（APC）（eBioscience），Phospho-p38 MAPK（Thr180/Tyr182）（D3F9）XP?Rabbit mAb（CST），Lyse/Fix Buffer（5x）（BD），Perm Buffer Ⅲ（BD），實時定量PCR 儀（Roche），紫外分光光度儀（DeNovix），普通PCR儀（ABI），高速離心機（Eppendorf），流式細胞儀（BD FACSCantoⅡ）。

1.2 方法

1.2.1 肺結核小鼠的構建 隨機將8～10 周齡雄性C57BL/6 小鼠分成兩組，每組各5 只，分別通過氣溶膠霧化吸入大約150 CFUs H37Ra 和等體積的PBS 液體［5］，1 個月后處死小鼠，取其肺臟，分離肺組織淋巴細胞。

1.2.2 p38 MAPK的磷酸化檢測 20倍體積的預熱1x Lyse/Fix Buffe 立即固定細胞，37 ℃孵育10 min，5 000 r/min離心5 min，去上清；振蕩片刻，加入1 mL預冷Perm BufferⅢ，冰上破膜30 min；FACS buffer洗兩次，染色（p-p38 APC 1∶100），常溫孵育30 min；FACS buffer 洗兩次，并在流式細胞儀上檢測p38 MAPK 的磷酸化水平。

1.2.3 分離與培養(yǎng)小鼠骨髓來源的巨噬細胞 從小鼠脛骨和股骨中分離骨髓細胞，單細胞懸于DMEM 培養(yǎng)基中，其中DMEM 培養(yǎng)基中加有10%FBS 和20 ng/mL M-CSF，放置37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d，收集巨噬細胞。

1.2.4 蛋白印跡檢測 提取細胞蛋白后，將蛋白定量后平均加入12%聚丙烯酰胺凝膠中，蛋白被分離后轉入硝酸纖維素膜中，隨后用特異性一抗p-p38 MAPK 孵育過夜，次日孵育二抗，加入適當發(fā)光液曝光檢測。

1.2.5 qRT-PCR 檢測 根據Total RNA Kit I 說明書抽提總RNA；RNA 濃度和A260/280 比率由紫外分光光度儀檢測；通過PrimeScript?RT kit 反轉錄成cDNA；qPCR 由SYBR Green PCR Master Mix 按照標準步驟操作；所有基因的mRNA 與管家基因GAPDH 以2-ΔΔCT函數值進行計算。

1.2.6 CFU 計數 結核菌H37Ra 以MOI=5 感染巨噬細胞，分別孵育4 h 與72 h 后，用無菌PBS 清洗2 遍，隨后用0.1%SDS 裂解細胞，裂解物被依次稀釋成3 個梯度，分別接種于7H11 Middlebrook 瓊脂培養(yǎng)板上，在5% CO2和37 ℃的條件下培養(yǎng)，3～4 周后計數各平板菌落數量。

1.3 統計學方法 采用GraphPad Prism 5.0 軟件進行統計分析，以H37Ra 霧化小鼠的結核組和PBS 的對照組肺組織p38 MAPK 的磷酸化水平、不同組間細胞內結核菌吞噬率和存活率以及不同組間細胞IL-6、TNF-α及IL-1β mRNA的相對水平為計數資料，以表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用方差分析，以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 不同小鼠肺組織中p38 MAPK磷酸化水平的比較 如圖1所示，H37Ra霧化組肺組織中p38 MAPK的磷酸化水平（2.115 ± 0.2960）%顯著高于PBS 霧化組（0.4250 ± 0.1075）%，兩者間差異具有統計學意義（t=5.493，P=0.000 6）。

圖1 PBS 和H37Ra 霧化的小鼠肺組織中p38 MAPK 的磷酸化水平Fig.1 Phosphorylation level of p38 MAPK in lung homogenate of mice atomized with PBS and H37Ra

2.2 H37Ra 感染小鼠巨噬細胞前后p38 MAPK 磷酸化水平的比較 接著檢測巨噬細胞中p38 MAPK信號通路與結核菌感染的關系，如圖2所示，與空白對照相比，結核菌H37Ra 感染巨噬細胞15、30、45 以及60 min 后，其胞內p38 MAPK 的磷酸化水平逐漸增加。

圖2 蛋白印跡法檢測H37Ra 在不同時間點感染巨噬細胞后p38 MAPK 的磷酸化水平Fig.2 Western Blot analysis of phosphorylation level of p38 MAPK after H37Ra infection of macrophages at indicated time points

2.3 p38 MAPK 信號通路對巨噬細胞控制結核菌感染的影響 為了進一步研究巨噬細胞中p38 MAPK 信號通路在結核菌感染中的作用，筆者利用SB203580 抑制細胞內p38 MAPK 活性后，檢測巨噬細胞內結核菌吞噬率和存活率的變化。如圖3A 所示，空白對照組細胞內H37Ra 吞噬率為（80.00 ± 5.774）%，SB203580 抑制組細胞內H37Ra吞噬率為（75.00 ± 2.887）%，兩者間差異沒有統計學意義（t=0.774 6，P=0.481 8）；如圖3B所示，空白對照組細胞內H37Ra 存活率為（100.0 ± 5.774）%，SB203580 抑制組細胞內H37Ra 存活率為（130.0 ±5.774）%，SB203580 抑制組細胞內H37Ra 存活率顯著高于空白對照組，兩者間差異具有統計學意義（t=3.674，P=0.021 3）。

圖3 p38 MAPK 信號通路對巨噬細胞吞噬H37Ra 和殺菌活性的影響Fig.3 Effect of p38 MAPK signaling pathway on uptake of H37Ra and bactericidal activity of macrophages

2.4 p38 MAPK 信號通路對結核菌誘導巨噬細胞內細胞因子表達的影響 由于巨噬細胞主要通過炎癥因子發(fā)揮抗感染作用，因此筆者檢測p38 MAPK 信號通路對結核菌誘導巨噬細胞內細胞因子表達有影響，結果如圖4A所示，H37Ra+SB203580感染組IL-6 mRNA 表達水平（70.005.774）顯著低于H37Ra 感染組（150.0 ± 5.774），兩者間差異具有統計學意義（t=9.789，P=0.000 6）；如圖4B 所示，H37Ra+SB203580 感染組TNF-α mRNA 表達水平（7.667 ± 0.881 9）顯著低于H37Ra 感染組（16.00±1.155），兩者間差異具有統計學意義（t=5.735，P=0.004 6）；如圖4C 所示，H37Ra+SB203580 感染組IL-1β mRNA 表達水平（8.000 ± 0.577 4）顯著低于H37Ra 感染組（25.00 ± 1.732），兩者間差異具有統計學意義（t=9.311，P=0.000 7）。

圖4 p38 MAPK 信號通路對H37Ra 誘導巨噬細胞內細胞因子表達的影響Fig.4 Effect of p38 MAPK signaling pathway on H37Ra-induced cytokine expression in macrophages

3 討論

研究宿主對結核菌感染的抗性或易感性的關鍵調節(jié)機制或信號分子對于開發(fā)新的結核病控制策略非常重要［6］。尤其對常規(guī)抗結核治療具有耐受性的耐多藥和廣泛耐藥結核菌株更為重要。最近，已經鑒定出幾種宿主分子可作為潛在的宿主定向治療（host-direct therapy，HDT）靶點［7］。在這項研究中，筆者首次發(fā)現p38 MAPK 可以抑制巨噬細胞內結核菌的存活，提示p38 MAPK 可能是HDT抗結核病的新靶點。在肺結核小鼠模型中筆者發(fā)現，肺組織中p38 MAPK 的磷酸化活性顯著增加，表明p38 MAPK 信號通路參與了小鼠肺結核的發(fā)生發(fā)展過程，但具體發(fā)揮怎樣的作用仍未清楚。

結核菌主要通過呼吸道感染宿主，起初被肺泡巨噬細胞吞噬，在巨噬細胞表面含有大量的PRRs，可識別結核菌中的PAMPs，如脂多糖等，激活細胞內一系列重要的信號通路，參與各種細胞反應［8］，并激活T 細胞介導的適應性免疫應答［9］。其中p38 MAPK 信號通路是細胞內重要的活化通路之一［8］。在結核菌感染巨噬細胞過程中，p38 MAPK信號通路可促進感染細胞內吞噬體的成熟［3］和細胞凋亡進程［4］。且有研究［10］發(fā)現，劇毒結核菌株可通過去磷酸化作用抑制巨噬細胞內p38 MAPK 的磷酸化活性，而減毒結核菌株誘導的p38 MAPK 磷酸化活性明顯更高，這些發(fā)現與筆者的結果一致，但p38 MAPK 信號通路是否能抑制巨噬細胞內結核菌的存活有待進一步論證。接著筆者發(fā)現在結核菌感染巨噬細胞的過程中，p38 MAPK信號活性逐漸增加，同時抑制其活性后，巨噬細胞內結核菌的存活率增加，表明p38 MAPK 信號通路確實能夠抑制巨噬細胞內結核菌的存活。

上述發(fā)現表明p38 MAPK 信號通路的激活可以增強巨噬細胞的抗結核菌感染的作用，因此，筆者初步分析p38 MAPK 信號通路增強巨噬細胞內抗結核菌感染的分子機制。筆者發(fā)現在結核菌感染巨噬細胞過程中，抑制p38 MAPK 活性后，巨噬細胞內結核菌誘導的細胞因子表達水平顯著下降，包括IL-6、TNF-α及IL-1β等，表明p38 MAPK 信號通路可能通過調控細胞內炎癥因子的表達水平參與抗結核菌感染的過程，而TNF-α在結核病的早期和長期控制中起著至關重要的作用［11］，如巨噬細胞在識別結核菌細胞壁PAMPs后分泌TNF-α，隨后激活巨噬細胞，將其遷移到感染部位，參與肉芽腫的形成［12］。另外，TNF-α可上調一氧化氮合酶2 的表達，并進一步誘導巨噬細胞內活性氮中間體的產生，介導胞內殺滅結核菌的過程［13］。另外有研究發(fā)現由于IL-6 缺陷型小鼠在結核菌感染后病理反應加重，提示筆者IL-6 在保護宿主免受結核菌感染中也起著至關重要的作用［13］。因此，筆者初步認為，在結核菌感染巨噬細胞過程中，p38 MAPK 信號通路可能通過調控細胞因子的表達水平參與各種宿主防御反應，如細胞自噬、凋亡或應激等?？傊?，宿主細胞中p38 MAPK 的活性與抗結核菌感染過程密切相關，對清除巨噬細胞中結核菌具有重要的作用，這一成果為p38 MAPK 潛在的臨床應用提供了理論依據，可能作為HDT 抗結核病治療的新靶點。