LASS2基因對惡性腫瘤作用機制研究進展

王僑 欒婷 王劍松 王海峰

昆明醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院泌尿外科/云南省泌尿外科研究所（昆明650101）

相關調查［1］發(fā)現(xiàn)，2018年全球將新增病例1 810 萬，癌癥死亡960 萬例，其中有一半的癌癥死亡病例將發(fā)生在亞洲。癌癥成為亟待解決的問題。抵抗細胞死亡和持續(xù)增殖被認為是癌癥的基本特征。細胞周期進程的失調破壞了細胞增殖和細胞死亡的動態(tài)平衡，從而導致癌癥的發(fā)生。在對腫瘤的研究中逐漸發(fā)現(xiàn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中部分基因發(fā)生了改變，因此最近幾年通過基因治療癌癥成為了研究熱點。新發(fā)現(xiàn)的腫瘤轉移抑制基因—人源性長壽保障基因Ⅱ型（homo sapiens longevity assurance homologue2，LASS2）又名腫瘤轉移抑制基因-1（tumor metastasis suppressor gene-1，TMSG1），在肝癌［2］、肺癌［3］、膀胱癌［4］、乳腺癌［5］、胃癌［6］、前列腺癌［7］等多種腫瘤中LASS2 均呈低表達，進一步研究證實其可以抑制以上多種腫瘤的增殖能力和轉移能力。本文就LASS2 對各種腫瘤的作用及其機制作一綜述。

1 LASS2

LASS2 基因是由劉宇欣等［7］于1999年引用mRNA 差異顯示技術從前列腺癌不同轉移潛能亞系中克隆出來得到的一種新的cDNA 序列，在GenBank 中的登錄記號為AFl89062。其后PAN 等［8］于2001年從人肝cDNA 文庫中克隆出一種與酵母長壽保障基因LAGl 高度同源的新基因，命名為LASS2 基因。因其與TMSG1 高度同源，所以TMSG1 基 因也叫做LASS2 基因。ZOU 等［9］于2008年研究發(fā)現(xiàn)LASS2/TMSGl 具有利用長鏈脂肪酰輔酶A 合成神經(jīng)酰胺的功能，故將其更名為神經(jīng)酰胺合成酶2（ceramidesynthase 2，CerS2）。LASS2 是一種廣泛分布于多種組織的管家基因，其中在肝、腎中高表達，LASS2 定位于1q11，含10 個外顯子。陳玉錦等［10］研究發(fā)現(xiàn)膀胱癌細胞中LASS2 的rs8444 區(qū)的C 等位基因和CC 基因型明顯低于正常組織，推測以上兩種基因型可減少膀胱癌發(fā)病風險。LASS2 編碼的蛋白定位于細胞膜和細胞質中，具有HOX 和TLC 兩個功能域。HOX 是一種序列特異性DNA 結合轉錄調節(jié)因子，對基因的轉錄調控起著不可忽視的作用，同時能誘導神經(jīng)酰胺合成酶的活性。根據(jù)目前的研究TLC 功能域可能參與神經(jīng)酰胺的合成后，參與細胞功能。

2 LASS2 作用機制

2.1 LASS2 與液泡型ATP 酶 液泡型ATP 酶（vacuolar ATPase，V-ATPase）廣泛分布于真核細胞中，在細胞膜、溶酶體、分泌泡上均有分布，在高轉移潛能的腫瘤細胞中高表達。V-ATPase 通過跨膜將細胞內的H+排出胞外，使細胞外pH 降低［11］。細胞外H+增多時可以促進腫瘤細胞分泌的基質金屬蛋白酶-2（MMP2）與MMP9 等酶激活、破壞腫瘤細胞周圍的細胞外基質，為腫瘤細胞的遷移開辟道路［12］。V-ATP 的C 亞基又稱VTP6L，是將H+排出胞外的關鍵部分，實驗證實LASS2 能直接與VTP6L 結合，從而抑制腫瘤細胞的轉移、擴散［13］。腫瘤細胞主要以糖酵解的形式產(chǎn)生能量，這使得腫瘤細胞內H+濃度較 高［14］。LASS2 與VTP6L 結 合后可抑 制V-ATPase 向 細胞外泵H+能力，細胞外H+濃度降低，細胞內的H+濃度升高可以使細胞處于應激狀態(tài)，激活JNK 信號通路釋放線粒體中的細胞色素C，當細胞色素C 進入細胞質內時使caspase-3 被激活產(chǎn)生線粒體途徑凋亡。因此LASS2 可以促進腫瘤細胞的凋亡抑制其生長［15］。綜上，LASS2 可以通過與液泡型ATP 酶結合促進腫瘤細胞的凋亡并抑制其轉移。

2.2 LASS2 與神經(jīng)酰胺 神經(jīng)酰胺是可以調節(jié)細胞生長、分化和凋亡的生物活性物質，它能通過多條途徑使線粒體內的細胞色素C 釋放入胞質內進而激活caspase引發(fā)線粒體凋亡。而LASS2 能誘導神經(jīng)酰胺合成酶的活性，增加神經(jīng)酰胺的合成，更多的神經(jīng)酰胺的下游分子如磷酸化的c-jun、bcl-2 家族和JNK 等進入線粒體內，線粒體內外膜之間的巨大滲透性通道PT 孔開放釋放細胞色素C，細胞色素C 進入細胞質后與Apaf1 結合形成寡聚體再與procaspase9 相互作用激活caspase3 進而激活下游caspases 引發(fā)細胞凋亡［2］。因此LASS2 可以通過神經(jīng)酰胺途徑誘導腫瘤細胞的凋亡。上述反應概括見圖1。

圖1 LASS2通過神經(jīng)酰胺途徑誘導腫瘤細胞凋亡示意圖Fig.1 Schematic diagram of LASS2 inducing tumor cell apoptosis through the ceramide pathway

2.3 LASS2 與細胞周期 細胞周期是由復雜的周期蛋白和周期蛋白依賴性激酶組成的蛋白激酶系統(tǒng)控制。在G1階段d 型細胞周期蛋白與CDK4 和CDK6 結合通過關鍵檢查點控制細胞的轉變，之后細胞周期可以自主進行［16］。既往研究發(fā)現(xiàn)轉錄因子細胞腫瘤抗原p53 調控細胞周期中涉及眾多基因的表達，并誘導細胞周期阻滯［17-19］。P21 是一種通用的G1 期細胞周期抑制劑，是第一個p53 效應基因［20］。ZENG 等［21］證明LASS2 導致細胞 周期蛋白D1 和CDK4 下調，誘導p21 表達，增加p-p53 表達，但未明顯影響p53 的表達。綜上，這些結果表明LASS2 過表達通過p53依賴途徑造成G0/G1 細胞阻滯。然而p21 也被認為由p53獨立的信號通路調控。磷脂合成過程中，二?；视秃土字?-磷酸的生成是細胞周期G1-S 轉變的必要條件。鞘磷脂途徑調節(jié)著NF-κB 的活性。NICOLAE 等［22］已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一種新的不依賴p53 的NF-κB 調控P21 的活性。既往研究表明NF-κB 通 過 細 胞 周 期 蛋 白D1 調控 細 胞 周 期［23-24］。SCHUMM 等［25］發(fā)現(xiàn)NF-κb 刺激細胞周期蛋白D1 的表達抑制p21 的表達，揭示了NF-κB 是細胞周期調控物質。因此，可能不僅p53 而且NF-κB 也調和這些監(jiān)管效果。LASS2 過表達是否可以通過NF-κB 途徑調控細胞周期，還是僅通過p53 途徑調控細胞周期仍待進一步研究。

2.4 其他 LASS2 可以阻止ERK 的磷酸化，而激活的ERK能磷酸化Drp1。Drp1 的磷酸化程度決定了線粒體的動態(tài)變化，決定線粒體是融合還是分裂［26］。LASS2 過表達時減少線粒體的分裂增加線粒體融合，導致線粒體外形狹長［27］。線粒體分裂時可以增加腫瘤細胞的轉移和浸潤能力［28］。因此LASS2 可以通過控制ERK/Drp1 途徑?jīng)Q定線粒體的動態(tài)變化從而抑制腫瘤細胞的轉移、浸潤［21］。

3 影響LASS2 基因表達的因素

微小RNA（microRNAs，miRNAs）是一類在真核生物中普遍存在含19～25 個堿基的非編碼性小RNA 分子，它能與mRNA 的3′-非編碼區(qū)結合而調控其表達。因此miRNA 在細胞的增殖、分化、凋亡、代謝和腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中有舉足輕重的作用。WANG 等［29］研究發(fā)現(xiàn)miRNA-9 在膀胱癌組織中的表達水平高于正常組織，模仿轉染miRNA-9 的細胞中LASS2 基因的表達水平下降，同時通過熒光素酶報告基因實驗發(fā)現(xiàn)miRNA-9 可以與LASS2的3′-UTR直接結合從而抑制LASS2基因的表達。后續(xù)實驗相繼證明miRNA-20a［30］、miRNA-3658［31］、miRNA-3622a［32］、miRNA-93［33］均可與LASS2 的3′-UTR 直接結合，抑 制 腫瘤細胞內的LASS2 基因表達從而增加腫瘤細胞的增殖、擴散和轉移能力。FAN 等［34］通過RTCA 增殖實驗發(fā)現(xiàn)LASS2 基因表達下調的AGPAT9 轉染細胞和AGPAT9 轉染細胞相比細胞的增殖能力明顯增強，RTCA 遷徙實驗表明LASS2 基因表達下調的AGPAT9 轉染細胞和AGPAT9 轉染細胞相比細胞的遷徙能力明顯增強。實時定量RT-PCR檢測和免疫印跡分析均顯示上調AGPAT9 的表達將導致KLF4 和LASS2 的表達增加。綜上推測，AGPAT9 可通過上調LASS2 基因的表達抑制腫瘤細胞的增殖和遷移能力。ZOU 等［9］利用實時RT-PCR 和蛋白印跡實驗均發(fā)現(xiàn)轉染siRNA ATP6V0C 的細胞和對照組相比LASS2 的表達明顯受到抑制，進一步利用激光共聚焦顯微鏡觀察LASS2 蛋白和ATP6V0C 的共定位信號明顯減弱。從而據(jù)此推測下調ATP6V0C 表達后抑制LASS2 基因表達是通過某種途徑激活了與LASS2 上游抑制性調控區(qū)域結合的轉錄因子，但其具體轉錄調控機制尚不清楚，有待進一步實驗研究。GU 等［35］ASGR1 在肝癌細胞中低表達，而上調ASGR1 的表達能抑制肝癌細胞降低V-ATP 酶的活性同時能抑制肝癌細胞轉移、侵襲的能力。下調ASGR1 高表達的肝癌細胞的LASS2 基因能減少上述影響，進一步實驗證實ASGR1 能直接與LASS2 基因反應，據(jù)此推測ASGR1能調控LASS2 的表達。

4 LASS2 對不同腫瘤的作用

4.1 LASS2 與前列腺癌 MA 等［7］通過mRNA 差異顯示技術發(fā)現(xiàn)高轉移潛能的前列腺癌細胞系中LASS2 表達程度下降，而在無轉移潛能的前列腺癌細胞系中LASS2 表達程度升高。這種差異性的表達說明前列腺癌細胞的轉移潛能與LASS2 的表達程度有關。研究［36-37］證實運用shRNA靶向沉默LASS2 的表達能增加V-ATPase 的活性而增加前列腺癌細胞的轉移、增殖能力。YU 等［38］構建了4 種含有不同功能域LASS2/TMSG1 的變異體，并將其穩(wěn)定轉染到具有高轉移潛能的人前列腺癌細胞系PC-3M-1E8 細胞中，運用免疫沉淀、免疫熒光和免疫電鏡顯示LASS2/TMSG1 的同源域能與ATP6L 直接相互作用。結果證實LASS2 可以直接和V-ATPase 的C 亞基直接相互作用調節(jié)V-ATPase 酶的活性，在前列腺腫瘤細胞增殖、轉移的過程中發(fā)揮重要作用。

4.2 LASS2 與肝癌 游海燕等［39］研究發(fā)現(xiàn)高轉移潛能的肝癌細胞系HCCLM3 高表達LASS2 后其細胞的遷移能力受到明顯的抑制。唐寧等［40］利用構建好的pCMV-HA2-LASS2 質粒轉染入HCCLM3 細胞中，結果測得細胞的生長受抑制且細胞的凋亡率明顯高于空白對照組，證實LASS2能抑制腫瘤細胞的增長。LU 等［41］研究發(fā)現(xiàn)敲除LASS2 的小鼠更容易被誘導形成肝癌，并發(fā)現(xiàn)在LASS2 缺失的小鼠體內miR-694 下調和靶基因Tnfaip3 上調，推導其與肝癌發(fā)生的高風險有關。RUAN 等［42］研究發(fā)現(xiàn)LASS2 和TGF-β1低表達促進肝腫瘤細胞的侵略性和不良預后，可能可以作為一種新的肝癌病人預后生物標記物。

4.3 LASS2 與膀胱癌 WANG 等［43］對80 例膀胱腫瘤樣本通過免疫組織化學染色和實時定量PCR 方法檢測發(fā)現(xiàn)LASS2 的表達水平和膀胱癌的臨床和組織病理學參數(shù)有關，LASS2 基因表達的缺失與膀胱腫瘤的增殖和轉移和顯著的相關性。通過對這80 例患者的生存狀態(tài)信息的收集發(fā)現(xiàn)LASS2 陰性組的生存率明顯低于LASS2 陽性組。同時發(fā)現(xiàn)LASS2 在晚期膀胱癌中表達下調且與膀胱癌的分期有關，且在腫瘤浸潤深度和腫瘤復發(fā)方面，差異有統(tǒng)計學意義。在Ⅰ、Ⅱ級病人中LASS2 陽性組的存活率明顯高于LASS2 陰性組。WANG 等［15］認為LASS2 是膀胱癌患者的潛在預后因素，尤其是早期膀胱癌病人。同時該研究發(fā)現(xiàn)在RT4 細胞中利用siRNA 沉默LASS2 基因的表達能明顯上調V-ATP 酶的活性，同時細胞外H+將顯著升高。因此推測沉默LASS2 可以通過上調V-ATP 酶的活性促進膀胱癌活動。同時通過流式細胞檢測分析發(fā)現(xiàn)阿霉素能誘導RT4 細胞的凋亡，但是轉染si-LASS2 的RT4 細胞凋亡明顯受到抑制，據(jù)此推測LASS2 基因能增加膀胱癌細胞的化療敏感性。有研究［44］發(fā)現(xiàn)敲除LASS2 的人膀胱細胞癌EJM3 細胞系在裸鼠中的生長情況明顯好于對照組。敲除LASS2 后細胞表現(xiàn)出明顯的多態(tài)性且MMP2、MMP9 的活性顯著增高，因此推測出敲除LASS2 更有利于膀胱腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。HUANG 等［27］通過基底膜基質侵入實驗發(fā)現(xiàn)LASS2 過表達的BIU87 膀胱癌細胞系和J82 膀胱癌細胞系侵襲能力下降，而LASS2 沉默的5637 膀胱癌細胞系侵襲能力增強。通過CCK-8 分析發(fā)現(xiàn)過表達LASS2 后將損傷膀胱癌細胞在阿霉素治療后的生存能力，沉默LASS2 基因后將提升膀胱癌細胞在阿霉素治療后的生存能力。同時采用流式細胞術進行JC-1 染色發(fā)現(xiàn)LASS2 是線粒體膜電位負性調控因素，進一步實驗發(fā)現(xiàn)過表達LASS2 基因可以下調線粒體分裂蛋白p-Drp1、Drp、Fis1 等的表達。綜上，HUANG 等［27］推測LASS2 能通過調控ERK-Drp1 途徑誘導線粒體動態(tài)變化抑制膀胱腫瘤細胞的浸潤和化療耐受。目前許多研究證實LASS2 是miRNA-20a［29］、miRNA-3658［30］、miRNA-3622a［31］、miRNA-93［32］、miRNA-9［21］等miRNA 的靶基因，這些miRNA 可以通過調控LASS2 的表達影響膀胱腫瘤細胞的發(fā)生、發(fā)展。

4.4 LASS2 與乳腺癌 FAN 等［34］研究發(fā)現(xiàn)LASS2 的表達在藥物耐受的乳腺癌細胞MCF-7/ADR 中明顯低于藥物敏感的乳腺癌細胞MCF-7。上調MCF-7/ADR 細胞LASS2 基因的表達可增加其對包括阿霉素在內的多種藥物的敏感性，下調MCF-7 細胞LASS2 基因的表達可降低其化療敏感性。進一步研究證實LASS2 過表達可以通過顯著增加細胞外pH 和溶酶體的pH 使更多的阿霉素進入細胞并停留在細胞核內，而增加乳腺腫瘤細胞對DOX 細胞毒性的敏感性。LASS2 表達下調可能預測化療耐受。MEI 等［44］通過lipofectin 轉染方法將構建好的LASS2 過表達質粒轉染入人乳腺癌細胞系MCF-7 中，通過將其與對照組比較發(fā)現(xiàn)，MCF-7 細胞中的V-ATP 酶活性明顯下降，細胞外H+濃度顯著降低，MMP-2 的活性下降。因此推測LASS2可以通過降低V-ATPase 活性和細胞外氫離子濃度，使分泌的MMP-2 失活，從而抑制乳腺癌細胞體外的生長和侵襲?？赡転槿橄侔┺D移的診斷和治療提供了一個新的靶點。

4.5 LASS2 與肺癌 徐海芹等［3］研究發(fā)現(xiàn)高轉移潛能、增值能力強的肺癌亞系95D 中LASS2 的表達顯著低于低轉移潛能、增殖能力弱的肺癌亞系95C。因此，認為LASS2基因可能參與抑制肺癌細胞的增殖、侵襲及轉移過程。徐曉燕等［45］將構建好的PcDNA3-TMSG-1 質粒轉染如95D 細胞中發(fā)現(xiàn)LASS2 的表達上調，VATP6L 的表達水平下降，其V-ATPase 活性下降及細胞外H+濃度下降。推測出LASS2可通過與ATP6L 結合抑制V-ATPase 活性進而改變肺癌細胞體外侵襲能力。

4.6 LASS2 與甲狀腺癌 甲狀腺癌是內分泌系統(tǒng)的常見病和多發(fā)病，研究證實大部分甲狀腺癌存在至少一種分子遺傳學改變，這些分子遺傳學改變可作為潛在的分子標志物［46］。ZENG 等［21］研究發(fā)現(xiàn)LASS2 基因在乳頭狀甲狀腺癌的表達程度比相鄰甲狀腺組織或結節(jié)性甲狀腺腫組織中相對較低。實驗中還發(fā)現(xiàn)LASS2 的過表達顯著增加了p21的表達，抑制了cyclin D1 和cyclin 依賴性激酶4 的表達，增加了p-p53 的表達。據(jù)此，推測LASS2 的過表達通過p53依賴通路導致G0/G1 細胞周期阻滯抑制PTC 細胞增殖，促進細胞凋亡。因此，LASS2 可以作為乳頭狀甲狀腺癌中的一種新的生物標志物。

5 結語

綜上所述，LASS2 在多種腫瘤組織中表達下調，被認為是一種新的腫瘤轉移抑制基因，同時具有促進惡性腫瘤細胞凋亡和抑制轉移的作用。LASS2 在腫瘤中的低表達使其具有成為新型腫瘤標記物的潛能，但在腫瘤的早期LASS2 不易被檢測，用其作為腫瘤的早期診斷具有敏感性較低的缺點。后續(xù)研究提升該篩查的敏感性有望幫助早期診斷改善患者預后。原發(fā)性腫瘤可以通過手術和放射治療，但轉移是惡性腫瘤的基本生物學特征，對于已經(jīng)播散的腫瘤往往難以通過上述方法獲得令人滿意的治療效果。腫瘤的轉移是個復雜的多步驟的過程，關于LASS2 靶向治療干預腫瘤進展的研究逐漸成為新的研究熱點。目前有大量研究確定LASS2 在多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。但對于LASS2 發(fā)揮其生物效應的具體分子機制和其上游事件任不明確，仍需要投入更多精力做進一步的探索研究。隨著探索研究的深入，LASS2 有望為多種腫瘤的診斷、治療和評估預后提供新的思路，提高患者的生存率和生存質量。