鏈霉蛋白酶消化時長對氣液相培養(yǎng)原代小鼠氣道上皮細胞的影響

高璇 徐菲 許先榮

氣道上皮是呼吸系統(tǒng)的一部分，與外界環(huán)境直接接觸，是機體與外界環(huán)境的屏障，能保護機體免受各種吸入性損害，如化學(xué)因子、污染性微粒、病原體等[1]。體外培養(yǎng)原代小鼠氣道上皮細胞（mouse tracheal epithelium cell，MTEC）建立體外模型，在呼吸系統(tǒng)疾病研究中具有重要意義。相關(guān)實驗證明，氣液相（ALI）方法能培養(yǎng)出正?；?、高質(zhì)量、具有黏膜纖毛分化能力的不同物種的原代氣道上皮細胞，包括MTEC[1-2]。培養(yǎng)MTEC對氣道上皮細胞生長、分化過程的觀察，以氣道上皮細胞為基礎(chǔ)的研究等具有重要意義。因此，建立高效、可靠的MTEC培養(yǎng)方法十分重要[3]。目前比較成熟的方法是利用消化酶鏈霉蛋白酶將氣道上皮細胞從小鼠氣管內(nèi)皮消化分離，并在富含特殊生長因子（如胰島素、表皮生長因子等）的培養(yǎng)基中增殖，最終在ALI分化成為MTEC[4-7]。消化酶消化時長會影響目標(biāo)細胞的產(chǎn)量、細胞活力、雜質(zhì)細胞數(shù)量等，因此選擇合適的消化時長很有必要。本文將介紹一種培養(yǎng)原代MTEC的方法，并通過一系列實驗確定合適的消化酶消化時長，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 周齡5～8周的無特定病原體（SPF）級雄性小鼠32只，購自上海斯萊克實驗動物公司。所有小鼠在SPF級條件下養(yǎng)育，所有實驗步驟遵守中國動物研究委員會關(guān)于實驗動物的倫理規(guī)定。

1.2 培養(yǎng)基 （1）采集培養(yǎng)基：含有左旋谷酰胺（LGlutamine，E15-817，美國 PAA公司）的 Ham’s F-12培養(yǎng)基，添加青霉素 100IU/ml、鏈霉素 100IU/ml。（2）消化培養(yǎng)基：采集培養(yǎng)基加入10U/ml鏈霉蛋白酶（P5147，美國 Sigma-Aldrich 公司）、0.01mol/L CaCl2、0.5mg/ml粗胰腺DNA酶Ⅰ（DN25，美國Sigma-Aldrich公司）、10mg/ml牛血清白蛋白（中國BIOSHARP公司）。（3）孵育培養(yǎng)基：含有左旋谷氨酰胺的 DMEM/Ham’s F-12（1∶1）培養(yǎng)基，添加青霉素 100IU/ml、鏈霉素 100IU/ml、10%FBS（美國PAA公司）。（4）基礎(chǔ)培養(yǎng)基：由BEBM基礎(chǔ)培養(yǎng)基（LONZA,Switzerland）與高糖左旋谷酰胺DMEM按1∶1比例配置，并添加青霉素100IU/ml、鏈霉素100IU/ml、5%FBS，每500ml混合培養(yǎng)基中加入一份SingleQuotsTMKit（瑞士LONZA公司）。（5）分化培養(yǎng)基：不添加FBS的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

1.3 包被半滲透基底膜 將Ⅳ型人胎盤膠原（美國Sigma-Aldrich公司）溶于蒸餾水制備的0.2%冰乙酸溶液中，配制成膠原濃度1mg/ml的混合液；再以蒸餾水稀釋至50μg/ml?；诪榘霛B透膜的細胞培養(yǎng)嵌入小室（24孔板，孔徑0.4μm，透明PET膜，美國BD公司）置入24孔細胞培養(yǎng)板中，每個小室加入100μl膠原混合液進行包被。將細胞培養(yǎng)板放入孵育箱中過夜，棄去殘余液體，紫外線照射至少30min滅菌，使用前用無菌PBS溶液沖洗3次。

1.4 分離原代MTEC 將小鼠分成4組，均予過量戊巴比妥鈉處死，浸泡在75%乙醇溶液中10min，置于無菌操作臺上。在無菌條件下，剪開小鼠胸部皮膚，充分暴露頸部。輕柔地去除周圍組織，將氣管分離完全。分別在主氣管至支氣管分叉處、甲狀軟骨上端剪斷氣管，取得氣管。將氣管置于冷的無菌采集培養(yǎng)基中[3，8-9]。再將氣管轉(zhuǎn)移至冷的無菌PBS溶液中，仔細去除氣管上附著的其他組織，置于新的、冷的無菌采集培養(yǎng)基中。將氣管縱向剪開，轉(zhuǎn)移至含有新鮮配置的消化培養(yǎng)基的試管中（6～10支試管/2ml培養(yǎng)基）。輕柔地上下顛倒試管數(shù)次，確保氣管中的氣體被完全排出。將試管保持豎直，置于4℃條件下進行消化；根據(jù)分組不同，分別消化 6、12、18、24h。

1.5 采集MTEC 將試管輕柔地上下顛倒10次，使氣管分散；加入占總體積10%的FBS后，再次輕柔地上下顛倒15次，以分散氣道上皮細胞。將混合液收集至一支新的試管中，再向裝有氣管的試管中加入8ml含10%FBS的采集培養(yǎng)基，再次輕柔地顛倒試管20～30次，以獲得更多氣道上皮細胞，同時再次收集該混合液。重復(fù)上述步驟2次后，將所有混合液收集至同一個試管中，棄去氣管。將混合液在500g、4℃的條件下離心10min，小心棄去上清液，將底部細胞團以2ml孵育培養(yǎng)基重懸。將細胞懸液移至6cm組織培養(yǎng)皿中，在37℃孵育箱中孵育2h以去除非上皮細胞。輕柔地旋轉(zhuǎn)、晃動培養(yǎng)皿數(shù)次，收集上清液至新的試管中。在500g、4℃的條件下再次離心5min，小心去除上清液，將底部細胞團以100μl/支氣管的基礎(chǔ)培養(yǎng)基重懸，使用細胞計數(shù)器對4組獲得的細胞數(shù)進行計數(shù)。以上實驗步驟重復(fù)2次。

1.6 流式細胞術(shù)檢測 4組小鼠獲得的細胞分別用洗滌緩沖液（美國BD公司）洗滌，7-AAD生存力染色液（美國eBioscience公司）染色5min，再使用流式細胞儀（美國BD公司）進行細胞信號通路分析，以上實驗步驟重復(fù)2次。陽性標(biāo)記通常表示細胞處于已死亡或無存活力的狀態(tài)，細胞存活率=陰性細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%。

1.7 MTEC孵育 將分離的細胞配制成密度為每150μl基礎(chǔ)培養(yǎng)基1×105個細胞的細胞懸液，加入已包被好的嵌入小室中；小室外的培養(yǎng)板底部加入600μl基礎(chǔ)培養(yǎng)基。將細胞在37℃、5%CO2的孵育箱中孵育72h。小心吸棄小室內(nèi)外舊的培養(yǎng)基、未貼壁的細胞及其他殘片，更換新的培養(yǎng)基，以后每2d更換1次培養(yǎng)基。

1.8 ALI條件下誘導(dǎo)MTEC分化 第4～5天，細胞增殖且相互貼合。此時使用上皮伏歐表（EVOM2，美國WPI公司）測量Rt值，判斷細胞是否貼合。若Rt值＞1000Ωcm2，表示細胞已貼合，可建立ALI培養(yǎng)環(huán)境[10]。將小室內(nèi)外舊的培養(yǎng)基吸棄，僅在小室外側(cè)加入新鮮的分化培養(yǎng)基，同時保持細胞層表面干燥。每2d更換1次新的分化培養(yǎng)基，并用溫的PBS輕柔地沖洗上層細胞層表面。在建立ALI培養(yǎng)條件的7～10d，細胞將呈現(xiàn)出鵝卵石樣外觀。

1.9 免疫組化染色 在建立ALI培養(yǎng)條件后第14天，采用免疫組化染色技術(shù)對MTEC分化情況進行分析。利用胰蛋白酶/乙二胺四乙酸將細胞從小室基底膜上消化、分離，經(jīng)PBS洗滌后，稀釋至特定濃度，在蓋玻片上鋪板。待蓋玻片干燥后，4%多聚甲醛固定細胞，用封閉液封閉細胞上的非特異性抗體，再以抗細胞角蛋白抗體Cytokeratin 18 RabMAb（美國EPITOMICS公司）標(biāo)記細胞；孵育二抗后，先后用DAB、蘇木精染色，在顯微鏡下觀察，細胞質(zhì)棕色、細胞核紫色的細胞為陽性細胞，細胞質(zhì)及細胞核未被染色的細胞為陰性細胞。

1.10 氣道上皮細胞的鑒定 小鼠近端氣道上皮細胞主要由纖毛上皮細胞構(gòu)成，還包括杯狀細胞、基底細胞等，上皮下存在的主要細胞為成纖維細胞等[11]。上皮細胞能特定表達角蛋白，而成纖維細胞中不含有角蛋白，不能被抗細胞角蛋白抗體標(biāo)記[12]。通過抗細胞角蛋白抗體標(biāo)記的免疫組化對細胞進行鑒定，陽性細胞鑒定為上皮細胞，陰性細胞為非上皮細胞[13]。將染色細胞置于顯微鏡下進行觀察并計數(shù)，隨機并獨立選取至少20個顯微鏡下視野，分別計數(shù)陽性及陰性細胞數(shù)，細胞純度=陽性細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%。

1.11 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件。計量資料用表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 鏈霉蛋白酶消化不同時長獲得的細胞數(shù) 鏈霉蛋白酶消化 6、12、18、24h，分別獲得細胞（0.57±0.03）、（1.05±0.22）、（1.13±0.22）、（1.28±0.39）×105個，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 鏈霉蛋白酶消化不同時長細胞存活率比較 鏈霉蛋白酶消化 6、12、18、24h，細胞存活率分別為（97.65±2.26）%、（96.83±0.76）%、（93.46±2.32）%、（91.56±2.99）%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；進一步兩兩比較，6h組與12h組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），但均明顯高于 18h組、24h組（均P＜0.05），見圖 1。

圖1 MTEC經(jīng)鏈霉蛋白酶消化6、12、18、24h后的流式細胞圖

圖2 鏈霉蛋白酶消化6、12、18、24h細胞免疫組化染色結(jié)果（×200）

2.2 鏈霉蛋白酶消化不同時長細胞純度比較 經(jīng)抗細胞角蛋白抗體標(biāo)記后，表現(xiàn)為特殊染色的細胞，即上皮細胞，見圖 2（插頁）。鏈霉蛋白酶消化 6、12、18、24h，細胞純度分別為（69.6±22.6）%、（90.4±5.1）%、（90.3±2.7）%、（88.7±1.9）%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；進一步兩兩比較，12h組、18h組細胞純度均＞90%（滿足實驗要求[14]），兩組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），但均明顯高于6h組、24h組（均P＜0.05）。

3 討論

氣道上皮為假復(fù)層纖毛柱狀上皮，主要由纖毛細胞、分泌黏液的杯狀細胞、無纖毛和分泌功能的未分化柱狀細胞和基底細胞等構(gòu)成，且僅有一層細胞[15-16]。由于培養(yǎng)原代氣道上皮細胞存在取材繁瑣、細胞量少、成活率低、細胞純度低、耗時長、易污染等問題，因此對于原代氣道上皮細胞培養(yǎng)的方法仍處于探索階段。

目前氣道上皮細胞主要的培養(yǎng)方法有組織塊貼壁法、機械刮刷法及酶消化法[15，17]。組織塊貼壁法在國內(nèi)應(yīng)用較多，但其對于組織塊的形狀、貼壁契合度以及培養(yǎng)孔中水分的要求都較高，大大降低了細胞培養(yǎng)的效率。機械刮刷法源自于臨床實踐中，即對患者行纖支鏡操作時取材，但此方法收集到的多為衰老、易脫落的氣道上皮細胞，且不適用于體型較小的實驗動物，目前應(yīng)用較少。目前國內(nèi)外比較推崇的是蛋白酶低溫消化法，這一方法對組織塊的形狀要求不高，對操作者培養(yǎng)過程中的操作熟練度、精細程度的要求較低，培養(yǎng)過程中所要求的酶濃度、消化時長等關(guān)鍵因素都是客觀可控的，當(dāng)掌握關(guān)鍵要素后，短期內(nèi)可大大提高培養(yǎng)效率。蛋白酶主要作用于氣道上皮下的基底膜，使上皮細胞從基底膜上脫落下來，但是低溫酶消化法對消化時長要求較高，若消化時長過短，脫落的上皮細胞數(shù)量過少；若消化時長過長，一方面會增加上皮細胞下成纖維細胞的脫落數(shù)量，另一方面蛋白酶會作用于已脫落的上皮細胞的細胞膜，造成細胞活性降低，減少上皮細胞存活率[18]。因此，確定一個合適的消化時長對能否成功培養(yǎng)原代MTEC具有重要作用。

本實驗在You等[7]操作指南的基礎(chǔ)上進行了修改，同時通過一系列實驗明確最合適的消化時長。本實驗結(jié)果顯示，鏈霉蛋白酶消化12、18h能達到較好的初始細胞數(shù)量和最終細胞純度，其中12h組的細胞活性更強，且實驗所需時間更短。因此，ALI培養(yǎng)原代MTEC時，鏈霉蛋白酶消化12h是最佳選擇。