基于雙向溫度梯度系統(tǒng)的檳榔萌發(fā)及生理響應(yīng)

黃麗云 李東霞 陳君 劉立云 周煥起

摘 ?要 ?本研究以‘熱研1號(hào)檳榔種子為供試材料，借助雙向溫度梯度系統(tǒng)控制面板設(shè)置49個(gè)晝夜溫度處理（最高溫區(qū)48?℃，最低溫區(qū)20?℃），研究其對(duì)種子萌發(fā)率、生長(zhǎng)狀況及生理響應(yīng)的影響。結(jié)果表明：檳榔種子萌發(fā)最佳晝夜溫度組合為29/25?℃，萌發(fā)率100%，生長(zhǎng)態(tài)勢(shì)最佳;20/20?℃條件下檳榔種子有萌發(fā)，但發(fā)芽率為80%，種子長(zhǎng)勢(shì)一般;48/48?℃條件下種子不萌發(fā)。根據(jù)長(zhǎng)勢(shì)狀況，以及酶活（SOD、POD、GR）測(cè)定，明確了最適于種子萌發(fā)及生長(zhǎng)的溫度范圍為25/20～34/25?℃。另外種子萌發(fā)所需日積溫560～744?℃?h為宜，萌發(fā)總積溫不宜超過24 864?℃?h。實(shí)驗(yàn)還證實(shí)了檳榔種子變溫處理比常溫萌發(fā)效果更好。

關(guān)鍵詞 ?雙向溫度梯度系統(tǒng);檳榔;萌發(fā);生理生化

中圖分類號(hào) ?S543.2 ?????文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 ?A

Abstract ?The effect of germination rate， growth conditions， physiological response of Arecanut was studied using the 2-way grants thermogradient plate which allows 49 temperature combinations （regimes） （20?℃ to 48?℃） of single temperature and alternating temperature combination over a time continuum. Under the best temperature combination 29/25?℃， the seed germination rate was 100% and the growth potential was the best. When temperature was 20/20?℃， the germination rate was 80%， and the growth was general. The 48/48?℃ treatment did not have any effect. According to the germination rate， growth conditions and physiological response （SOD， POD， GR）， the most suitable temperature range was 25/2034/25?℃. In addition， the optimum reaction accumulated temperature was 560744?℃?h， and the total germination temperature should not exceed 24?864?℃?h. The experiment also supported that the alternate temperature treatment was better than the normal temperature treatment for the seed germination rate and growth of Arecanut.

Keywords ?2-way grants thermogradient plate; areca; germination; physiological response

DOI ?10.3969/j.issn.1000-2561.2019.08.007

檳榔（Areca catechu L.）是棕櫚科檳榔屬多年生經(jīng)濟(jì)作物，目前已成為海南第一大農(nóng)業(yè)支柱產(chǎn)業(yè)。檳榔是我國(guó)四大南藥之一，種子、果皮、花等均可入藥，檳榔中含有的檳榔堿、兒茶素、多糖、膽堿等具有殺蟲、消積、下氣、行水等功效。另外，檳榔嫩果（授粉受精后140～160 d采摘的未成熟果）作為咀嚼嗜好品供不應(yīng)求[1]，目前全球約有10億人咀嚼檳榔，是檳榔的主要消費(fèi)方式。

不同種類植物種子的萌發(fā)溫度要求不同，這是由植物本身特性所決定，也是植物長(zhǎng)期適應(yīng)環(huán)境的結(jié)果。檳榔屬頑拗性種子，具有對(duì)溫度、干旱等外界環(huán)境較為敏感的特性。檳榔生長(zhǎng)于熱帶及南北回歸線以內(nèi)的亞熱帶邊緣地區(qū)，種果成熟月份集中在4—5月，恰逢海南高溫季節(jié)，如何控制合適的溫度進(jìn)行種果萌發(fā)處理，避免因溫度過高造成大批量種果失活是最為關(guān)鍵的一步。由于種植的局域性與研究滯后的現(xiàn)狀，針對(duì)檳榔種果萌發(fā)的研究報(bào)道較少。董志國(guó)等[2]研究了不同濃度NaCl脅迫對(duì)檳榔種果發(fā)芽的影響;陳思婷等[3]實(shí)驗(yàn)證明剝殼與切頭處理對(duì)檳榔種果發(fā)芽有顯著的促進(jìn)作用。但探討種果最適宜發(fā)芽溫度研究尚未見報(bào)道，本文利用雙向溫度梯度系統(tǒng)，在廣泛的溫度范圍內(nèi)對(duì)種果進(jìn)行發(fā)芽測(cè)試，探討最佳發(fā)芽溫度及生長(zhǎng)效應(yīng)，比較不同溫度處理的生理生化差異，精準(zhǔn)確定檳榔種果的最佳發(fā)芽溫度，界定發(fā)芽的極限溫度，為檳榔規(guī)?；缣峁├碚撘罁?jù)。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

試材為中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院椰子研究所國(guó)審品種‘熱研1號(hào)檳榔（熱品審2014011）[4]同串種果，種子均勻一致，無病蟲害。采回種果人工剝?nèi)ス猓孟礉嵕珜⒎N子上附著的果肉清洗干凈，然后用2.5%次氯酸鈉溶液將種子滅菌5 min，再用滅菌純水將種子清洗3遍。實(shí)驗(yàn)儀器為溫度梯度種子系統(tǒng)（GRD1 Gradient Plate 40674-A）。

1.2 ?方法

1.2.1 ?實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) ?設(shè)置了7×7矩陣共49個(gè)溫度組合（20～48?℃），如表1所示，高溫端為48/48?℃（白天/黑夜溫度），低溫端20/20?℃，第1梯度在黑暗中由左向右移動(dòng)，每8 h交替一次，第2次由前向后隨光而變（光照強(qiáng)度4000 lx），每16 h交替一次。每個(gè)實(shí)驗(yàn)格放置15個(gè)種果（去皮洗凈），每個(gè)處理3次重復(fù)。

1.2.2 ?測(cè)定指標(biāo)及方法 ?生長(zhǎng)指標(biāo)觀測(cè)：以觀察到種子胚根、胚芽伸出種皮并發(fā)育到一定程度視為發(fā)芽;定期觀測(cè)種子發(fā)芽率、胚芽、胚根及發(fā)

根數(shù)的生長(zhǎng)動(dòng)態(tài);發(fā)芽率=n/N×100%（式中，n為實(shí)驗(yàn)結(jié)束后發(fā)芽粒數(shù);N為供試種子總數(shù)）;積溫T=TN?Nt+TD?Dt（式中，T為積溫值，TD、TN分別為晝周期和夜周期對(duì)應(yīng)的平均溫度;Dt、Nt為種子萌發(fā)對(duì)應(yīng)的晝夜小時(shí)數(shù)）。生理生化指標(biāo)測(cè)定：取樣點(diǎn)為播種28 d后距離萌發(fā)孔基部0.8～1.5 cm的胚芽部位。蛋白（Pro）、超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化物酶（POD）、谷胱甘肽還原酶（GR）等按照南京建成生物工程研究所提供的試劑盒進(jìn)行測(cè)定，SOD和POD酶活性按每毫克蛋白中的酶活力單位數(shù)計(jì)算（U/mg）。每個(gè)指標(biāo)重復(fù)測(cè)定3次取平均值。

1.3 ?數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 19.0軟件與office Excel軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?溫度處理對(duì)種子萌發(fā)的影響

2018年4月20日將種子置于溫度板上，4月28日開始萌發(fā)，最早是B2、B3、B4、C2、C3等溫度組合出現(xiàn)萌發(fā)現(xiàn)象。種子發(fā)芽周期約28 d（5月18日）。結(jié)合表1，由圖1可見，交替溫度條件下，在25～43?℃（夜）和25～38?℃（日）范圍內(nèi)種子萌發(fā)速度最快，效果好，發(fā)芽率達(dá)100%。另外，可萌發(fā)的邊緣區(qū)域溫度組合為D5、F4、G1、G2發(fā)芽率分別為93.3%、80%、33.3%、20%。恒溫條件下，A1（20/20?℃）、B2（25/25?℃）、C3（29/29?℃）、D4（34/34?℃）、E5（38/38?℃）、F6（43/43?℃）、G7（48/48?℃）處于面板中軸斜線的位置，發(fā)芽率分別為80%、100%、100%、66.7%、0、0、0，發(fā)芽率呈“低-高-低”的拋物線形。

2.2 ?積溫對(duì)種子萌發(fā)的影響

從表2可見，49個(gè)溫度組合中25個(gè)萌發(fā)率達(dá)80%以上，占比51%。其中A3、A4、B2、B3、B4、C1、D1、D2共8個(gè)溫度組合種子萌發(fā)率達(dá)80%僅需13 d，日積溫范圍為552～744?℃?h，總萌發(fā)積溫范圍為7176～9672?℃?h。17 d時(shí)種子萌發(fā)率達(dá)80%的有10個(gè)溫度組合，日積溫范圍為520～808?℃?h，總萌發(fā)積溫范圍為7 140～13 736?℃?h，涵蓋了13 d萌發(fā)率達(dá)80%的日積溫及總積溫范圍。在28 d方可達(dá)到80%發(fā)芽率的溫度組合20/20、34/43?℃中，日積溫分別為480、888?℃?h，是處理組合達(dá)80%以上的最低值和最高值。

2.3 ?溫度處理對(duì)種子生長(zhǎng)勢(shì)的影響

從圖1可見，檳榔種子發(fā)芽溫度范圍較廣，25～38?℃均可正常發(fā)芽，但在相同發(fā)芽率情況下種子生長(zhǎng)狀況差異較大。如圖2所示，檳榔長(zhǎng)勢(shì)最佳溫區(qū)為A2～A4、B2～B4、C2～C3、D1～D3、E1～E2;其次為A1、B1、C1、E3、F1;A6～G6、A7～G7、G1～G7為不萌發(fā)狀態(tài)。根據(jù)種子萌發(fā)生長(zhǎng)的表征，選取發(fā)芽率為100%的3個(gè)溫度處理B3（29/25?℃）、C1（20/29?℃）、D4（34/34?℃），在不同的發(fā)育時(shí)期（5月8日，5月18日，5月28日）進(jìn)行測(cè)量。從圖3、圖4和圖5可見，無論是胚芽、胚根和發(fā)根數(shù)，B3處理均顯著高于C1和D4，生長(zhǎng)態(tài)勢(shì)由高至低為B3（29/25?℃）>C1（20/29?℃）>D4（34/ 34?℃），由此可見，合適的積溫條件下，相同發(fā)芽率情況下，合適的積溫條件種子長(zhǎng)勢(shì)有顯著差異。

2.4 ?種子萌發(fā)的生理生化響應(yīng)

以B3、C1、D4代表3個(gè)不同生長(zhǎng)勢(shì)區(qū)間材料，開展其生理生化研究。結(jié)果如圖6、圖7和圖8所示。不同溫度組合條件下對(duì)種子萌發(fā)過程中SOD、POD、GR活性影響不同，3種溫度組合種子萌發(fā)過程中3種酶活性規(guī)律一致，由高到低為B3（29/25?℃）>C1（20/29?℃）>D4（34/34?℃）。其中抗氧化物酶SOD、POD活性在三者之間差異達(dá)顯著水平（P<0.05）。B3處理的SOD值為80 U/mg，比C1和D4處理顯著高出40.79%和79.70%;POD的表現(xiàn)變化與SOD的較為一致，亦是B3處理POD值最大，比C1與D4分別高出60.04%和82.78%。

3 ?討論

本研究所用儀器雙向溫度梯度系統(tǒng)是高效性的溫度循環(huán)系統(tǒng)，是在鋁板平面一側(cè)加熱同時(shí)另一側(cè)制冷，從而在板面形成溫度梯度，通過梯度板再次旋轉(zhuǎn)90°，即可形成多孔溫差條件。該系統(tǒng)可同時(shí)模擬196個(gè)不同的溫差條件，可快速模擬和摸索培養(yǎng)最佳溫度條件，一次性得出大量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，替代了光照培養(yǎng)箱溫度條件單一的缺陷。特別是用于探索種植地域優(yōu)化篩選、種子最佳溫度條件、種子活性鑒定等效果顯著，可在保證準(zhǔn)確性的條件下節(jié)省大量時(shí)間和實(shí)驗(yàn)測(cè)試，Joseph 等[5]和Asomaning等[6]均運(yùn)用該儀器進(jìn)行了艷麗欖仁、白卡雅楝種子的變溫處理實(shí)驗(yàn)。

種子萌發(fā)溫度具有最高溫與最低溫的范圍需求，超出范圍都會(huì)使酶失去催化能力，從而使種子失去萌發(fā)力。種子萌發(fā)是植物生長(zhǎng)周期的重要階段，此期間萌發(fā)生長(zhǎng)極易受溫度等環(huán)境的影 ?響[7]。理想條件下，種子生長(zhǎng)勢(shì)旺盛，酶活力強(qiáng)，催化能力亦強(qiáng)。本研究中最低溫設(shè)置為20?℃，是因?yàn)闄壚茷榧傻蜏氐拿舾行苑N子，加之檳榔發(fā)芽季平均溫度為25～30?℃;最高溫設(shè)置為48?℃，筆者在種果檳榔采摘后進(jìn)行裝袋堆漚（一般海南農(nóng)戶的種子處理方法），測(cè)定袋內(nèi)溫度，可高達(dá)50?℃左右。溫度高的原因主要是種子的呼吸作用、氣候因素以及微生物發(fā)酵升溫等，當(dāng)種子貯藏置放不當(dāng)極易引起高溫?fù)p傷[8]。

在種子萌發(fā)方面，20?℃常溫處理檳榔種子有萌發(fā)，但發(fā)芽率為80%，種子長(zhǎng)勢(shì)一般;50?℃處理種子萌發(fā)率為0;極限高溫處理組合為34/43?℃（日均溫為37?℃），發(fā)芽率為66.7%，種子長(zhǎng)勢(shì)差;最適于種子萌發(fā)及生長(zhǎng)的溫度范圍為25/20～34/25?℃（日均溫為23.3～31?℃），最佳的溫度組合為29/25?℃，這與棕櫚種子萌發(fā)溫度（30/20?℃）較為接近[9]。由此計(jì)算出最佳萌發(fā)日積溫范圍為560～744?℃?h，總萌發(fā)積溫為7280～9672?℃?h。

另外本研究還發(fā)現(xiàn)，檳榔種子溫度交替變化處理比常溫條件發(fā)芽效果好。實(shí)驗(yàn)中29/29和34/34?℃日積溫與25/34和38/25?℃相似，但80%種子萌發(fā)率時(shí)間與生長(zhǎng)勢(shì)明顯差別。類似的研究多見報(bào)道，恒溫不利于羊草種子發(fā)芽[10]，變溫能顯著提高種子萌發(fā)率[11-14]，這可能是棕櫚科大多數(shù)植物長(zhǎng)期適應(yīng)原生境的結(jié)果。關(guān)于變溫促進(jìn)種子發(fā)芽的機(jī)理目前尚未認(rèn)識(shí)清楚，據(jù)分析可能與不同溫度滿足種子萌發(fā)不同生理過程有關(guān)。

POD、SOD和GR是植物體內(nèi)清除自由基的重要保護(hù)酶。通常情況下，正常植株體內(nèi)保護(hù)酶都具有較高的活性，可有效地清除細(xì)胞內(nèi)的各種活性氧自由基。本研究中，SOD、POD、GR等酶協(xié)調(diào)一致，維持在一個(gè)相對(duì)高的穩(wěn)定水平，從而防止生物自由基對(duì)細(xì)胞的毒害。本研究中種子萌發(fā)長(zhǎng)勢(shì)越好，酶活越強(qiáng)，反映了長(zhǎng)勢(shì)旺盛的種苗具有良好的防御系統(tǒng)。另外溫梯度板的種子培養(yǎng)屬于微逆境環(huán)境，無濕度控制，靠人為手動(dòng)控濕，種子萌發(fā)相關(guān)酶活性也會(huì)隨著環(huán)境條件而變化，曹紅星等[15]、孫程旭等[16]、黃麗云等[17]和李佳等[18]以檳榔幼苗為試材開展低溫、干旱、耐旱等抗逆性研究，表明在逆境條件下，隨著脅迫程度的增加，抗氧化物酶活性均有不同程度的提高。本研究種子萌發(fā)過程會(huì)受濕度變化的影響，導(dǎo)致酶活變化，反映出不同溫度處理種子自身生長(zhǎng)調(diào)控的能力。

本研究探討了溫度對(duì)檳榔種子萌發(fā)的影響，明確了檳榔種子的最佳晝夜溫度組合為29/25?℃，最佳萌發(fā)恒溫為23.3～31.0?℃，日積溫560～744?℃?h，萌發(fā)積溫不宜超過24 864?℃?h。另外證實(shí)了檳榔種子變溫交替處理比常溫處理萌發(fā)效果好。

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