商陸皂苷甲對(duì)IL-17誘導(dǎo)腎小球系膜細(xì)胞增殖的影響*

湯杰印，張 薇，張祥貴，徐麗君

遵義醫(yī)科大學(xué)第五附屬(珠海)醫(yī)院腎內(nèi)科(珠海519100)

腎小球系膜細(xì)胞(Glomerular mesangial cells,GMC)是腎小球內(nèi)固有細(xì)胞之一，GMC大量增殖及其細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular matrix,ECM)分泌增多是各種增殖性腎炎的重要病理基礎(chǔ)[1-2]。白介素-17(Interleukin-17,IL-17)細(xì)胞主要是由輔助性Th17(T helper cell 17,Th17)合成并分泌的促炎因子，研究證實(shí)Th17及其分泌的IL-17參與多種腎臟疾病，尤其在增殖性腎炎的發(fā)生、發(fā)展中起著重要的作用[3-5]。IL-17可刺激GMC增殖合成并分泌纖連蛋白(Fibronectin,FN)，加速腎小球硬化的進(jìn)展[6]。商陸皂苷甲(Esculentoside A,EsA)具有顯著的抗炎癥、抗腫瘤，調(diào)節(jié)免疫，抑制細(xì)胞增殖和促凋亡的作用[7-9]，具有重要研究?jī)r(jià)值。我們課題組前期通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，EsA可下調(diào)狼瘡模型小鼠外周血TNF-α、IL-6的表達(dá)，抑制腎臟組織Bcl-2、PCNA表達(dá)并誘導(dǎo)Fas、FasL及Caspase-3的表達(dá)，促進(jìn)了腎固有細(xì)胞的凋亡，抑制了腎組織的增生，改善了蛋白尿及腎臟的病理狀況[10-13]；體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)EsA可直接抑制GMC增殖、CDK2的表達(dá)及ERK1/2-AP1通路活化，上調(diào)了P27表達(dá)，抑制GMC細(xì)胞周期進(jìn)程[14-18]，EsA還抑制了CD4+T分化Th17減少了IL-17分泌?？紤]EsA可能是通過腎臟固有細(xì)胞(GMC等)及淋巴系統(tǒng)(CD4+T等)途徑來(lái)達(dá)到治療系膜細(xì)胞增殖性腎炎的作用，對(duì)于EsA在組織中的具體作用機(jī)制究竟是間接通過淋巴系統(tǒng)還是直接作用于腎臟GMC等固有細(xì)胞或是兩者皆有之來(lái)實(shí)現(xiàn)的，目前并不清楚。本研究觀察EsA對(duì)IL-17誘導(dǎo)的GMC增殖及其細(xì)胞外基質(zhì)FN表達(dá)影響，探討EsA治療系膜細(xì)胞增殖性腎炎的可能機(jī)制。

材料和方法

1 材 料 rGMC株(HBZY-1)由CCTCC提供。商陸皂苷甲(上海源葉生物科技有限公司)，生產(chǎn)批號(hào)：KM0521CA14。IL-17(Prospec公司)，DMEM培養(yǎng)液、優(yōu)級(jí)胎牛血清(Thermo公司)，胰酶溶液(碧云天生物技術(shù)研究所)，噻唑藍(lán)、二甲基亞砜(Aladdin試劑)，磷酸鹽緩沖液(1×)(Thermo公司)，大鼠纖連蛋白酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)試劑盒。

2 方法與分組

2.1 GMC培養(yǎng)：GMC株購(gòu)回后，細(xì)胞培養(yǎng)液透明、清亮，倒置顯微鏡下見細(xì)胞單層鋪滿瓶底，呈梭形，適應(yīng)性培養(yǎng)4 h后，吸棄上清液，用磷酸鹽緩沖液清洗細(xì)胞2次，胰酶消化細(xì)胞，見細(xì)胞收縮變圓，片狀脫落時(shí)，加入10%FBS 的DMEM，終止消化，吹打成單細(xì)胞懸液，移入離心管里，800 次/min，5 min離心后，棄上清，將含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液3 ml加入離心管重懸細(xì)胞，分裝3個(gè)25 mm2培養(yǎng)瓶，即1∶3方式傳代，每瓶培養(yǎng)液加至5 ml并吹打均勻后放入37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，每48 h更換培養(yǎng)液，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)迅速，每72 h予以傳代。本實(shí)驗(yàn)選用6～9代rGMC。

2.2 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分組：在檢測(cè)IL-17對(duì)GMC增殖影響中，根據(jù)IL-17濃度分為：對(duì)照組(不加藥物干預(yù))，IL-17(5 ng/ml)組，IL-17(10 ng/ml)組，IL-17(20 ng/ml)組，IL-17(50 ng/ml)組，IL-17(100 ng/ml)組共六組；在檢測(cè)EsA對(duì)IL-17誘導(dǎo)的rGMC增殖及其對(duì)FN表達(dá)影響中分為：對(duì)照組(加入IL-17)、干預(yù)組(加入IL-17、終濃度為5mg/L EsA)共兩組。

2.3 MTT法檢IL-17對(duì)GMC增殖的影響：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期GMC接種于96 孔板，先培養(yǎng)箱孵育24 h后使GMC同步化于G0期。對(duì)照組為加入5%FBS的DMEM，其余各組加入5%FBS的DMEM及相應(yīng)濃度的IL-17，上述各組分別培養(yǎng)至24、48 及72 h時(shí)，換取新鮮培養(yǎng)液，每孔加入0.5%MTT 20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后結(jié)束培養(yǎng)，吸棄舊培養(yǎng)液，各孔加入150 μl DMSO，室溫振蕩10 min，充分溶解結(jié)晶顆粒，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀OD490值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。

2.4 EsA對(duì)IL-17誘導(dǎo)的GMC增殖及其對(duì)FN表達(dá)的影響：按照上述方法，對(duì)照組加入IL-17及5%FBS的DMEM、干預(yù)組加入IL-17、終濃度為5 mg/LEsA及5%FBS的DMEM，培養(yǎng)各組細(xì)胞至24、48、72 h，仔細(xì)收集各組細(xì)胞上清液后室溫下備用，MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞OD490值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。FN的表達(dá)采用ELISA試劑盒檢測(cè)收集的各組細(xì)胞上清液，具體步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行檢測(cè)。

結(jié) 果

1 GMC生長(zhǎng)形態(tài)的觀察 經(jīng)傳代24 h后GMC伸張貼壁生長(zhǎng)，2～3 d可鋪滿瓶底。倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞多呈梭形，胞核居中呈卵圓形，生長(zhǎng)密集時(shí)細(xì)胞間縫隙縮小甚至消失(圖1)。

圖1 正常GMC形態(tài)(×40)

2 MTT法檢測(cè)IL-17對(duì)GMC增殖的影響 與對(duì)照組相比較，IL-17各濃度組明顯促進(jìn)了GMC增殖(P<0.05)，在各檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)，IL-17各濃度組對(duì)GMC增殖的影響無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，見表1。

表1 不同濃度IL-17對(duì)GMC增殖的比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05

3 EsA對(duì)IL-17誘導(dǎo)的GMC增殖及其分泌纖連蛋白的影響 與對(duì)照組比較，干預(yù)組抑制了GMC增殖(P<0.05)，并明顯減少了FN表達(dá)(P<0.05)，見表2、3。

表2 商陸皂苷甲對(duì)IL-17誘導(dǎo)的GMC增殖的比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05

表3 商陸皂苷甲對(duì)IL-17誘導(dǎo)的GMC分泌FN水平的比較(ng/ml)

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05

討 論

IL-17主要是由Th17細(xì)胞合成、分泌的細(xì)胞因子，在體內(nèi)其與其受體結(jié)合后，可促進(jìn)多種細(xì)胞分泌多種生長(zhǎng)因子和趨化因子(如IL-1、IL-6、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子-α、單核細(xì)胞趨化蛋白-1等)；IL-17與IL-6等細(xì)胞因子協(xié)同作用后，放大局部炎癥效應(yīng)；IL-17還具有強(qiáng)大募集炎性細(xì)胞(中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞等)的作用，并刺激炎性細(xì)胞產(chǎn)生IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α和PGE2等炎癥因子，從而增強(qiáng)局部炎癥并引起免疫損傷[19]，參與了炎癥反應(yīng)及自身免疫反應(yīng)[20]，目前認(rèn)為IL-17是一種重要的促進(jìn)炎癥的細(xì)胞因子。研究發(fā)現(xiàn)IL-17可通過激活中性粒細(xì)胞及巨噬細(xì)胞來(lái)直接參與腎臟的炎癥反應(yīng)，尤其在增生性腎小球腎炎中，IL-17A起著十分重要的作用[21]。Ig A腎病患者存在過量的IL-17，IL-17激活單核細(xì)胞釋放一系列細(xì)胞因子，如TNF-α、IL-1β，而TNF-α、IL-1β是重要的致炎因子，提示IL-17可能參與IgA腎病腎臟炎癥反應(yīng)[22]，與非IgA腎病患者相比，IgA腎病患者外周血IL-17及TGF-β1表達(dá)上調(diào)，且與新月體形成相關(guān)[23]。因此，IL-17在系膜細(xì)胞增殖性腎炎中起著十分重要的作用。GMC是位于腎小球毛細(xì)血管袢之間的一種固有細(xì)胞，與系膜基質(zhì)構(gòu)成腎小球系膜，在多種刺激后出現(xiàn)增殖失控，分泌大量ECM(主要為FN)及炎癥因子，后者又可進(jìn)一步促進(jìn)GMC增殖以及ECM的分泌增多，形成惡性循環(huán)加重了腎小球損害是各種系膜細(xì)胞增殖性腎病的重要病理基礎(chǔ)[1]。IL-17可以刺激GMC增殖及基質(zhì)彌漫增生[24]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比較，IL-17各濃度組均明顯促進(jìn)了rGMC增殖(P<0.05)，與既往研究相符[6]，提示IL-17誘導(dǎo)GMC增殖的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ统晒?。但本?shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)IL-17對(duì)GMC增殖影響未見濃度、時(shí)間的依賴性，可能與IL-17實(shí)驗(yàn)濃度篩選或檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)等因素有關(guān)，有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。

EsA是從中藥商陸的塊根中提純而得到的一種三萜類皂苷化合物。既往研究顯示EsA具有調(diào)節(jié)免疫、抗炎、抑制細(xì)胞增殖和促進(jìn)凋亡等作用。小劑量EsA可降低巨噬細(xì)胞的吞噬能力，并抑制其釋放IL-1、PGE2等[25]，但大劑量的EsA有明顯的肝、腎毒副作用[26]。我們課題組既往通過體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)證實(shí)了EsA可明顯改善狼瘡模型小鼠的尿蛋白及腎臟的炎癥，EsA可抑制GMC增殖，從而改善了狼瘡模型小鼠病情。FN是GMC外主要基質(zhì)，是GMC纖維化標(biāo)志性指標(biāo)，有研究顯示IL-17可刺激GMC合成并分泌FN，且IL-17與FN呈劑量依賴性，從而加速腎小球硬化的發(fā)展[6]，HMCL均不表達(dá)IL-17，但I(xiàn)L-17可促進(jìn)HMCL分泌IL-1β，且隨著IL-17濃度及時(shí)間呈依賴性[27]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：干預(yù)組明顯抑制了GMC增殖(P<0.05)并降低了細(xì)胞外基質(zhì)FN表達(dá)(P<0.01)，從而證實(shí)了EsA可抑制IL-17誘導(dǎo)的GMC增殖，并減少ECM的分泌。其可能的作用機(jī)制是：IL-17的受體幾乎表達(dá)于所有的細(xì)胞表面，IL-17與其受體結(jié)合后，主要信號(hào)傳導(dǎo)途徑有3條，首先可通過活化NF-KB，促使NF-KB速易位入核，啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄及蛋白的合成[28]；其次，IL-17可通過蛋白激酶MApK信號(hào)傳導(dǎo)通路發(fā)揮調(diào)控細(xì)胞周期等生理作用[29]；最后一條傳導(dǎo)信號(hào)途徑是JAKS/ STATs[30]，而EsA能通過刺激分泌干擾素以及抑制NF-KB和絲裂原等來(lái)發(fā)揮抗炎作用。結(jié)合我們既往的研究結(jié)果，EsA可抑制CD4+轉(zhuǎn)化Th17并抑制了其分泌的IL-17誘導(dǎo)的GMC增殖并下調(diào)了FN表達(dá)，從而改善了系膜細(xì)胞增殖性腎炎的病情，因此，EsA既可直接抑制GMC增殖也可通過淋巴系統(tǒng)(Th17，IL-17)間接作用于GMC，表明了EsA對(duì)系膜細(xì)胞增殖性腎炎的治療作用是多途徑多效應(yīng)的，具體機(jī)制有待今后進(jìn)一步研究。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，EsA可抑制IL-17對(duì)GMC的增殖，并減少FN的分泌，為EsA治療系膜細(xì)胞增殖性腎炎研究奠定了新基礎(chǔ)。