滋水涵木通絡(luò)法治療肝腎不足型斑禿療效及Th17/Treg相關(guān)機制研究

李津津，張雪竹

（天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚科，天津 300193）

斑禿是皮膚科常見病，表現(xiàn)為突然發(fā)生的局限性毛發(fā)脫落。在中醫(yī)古籍中，斑禿常被稱為“油風(fēng)”，由肝腎不足、氣血虧虛等原因引起，肝腎不足是其主要病因。西醫(yī)認(rèn)為該病與精神因素、免疫功能、遺傳原因等有關(guān)[1]。近期研究提示，斑禿是T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的器官特異性自身免疫性疾病，患處可見T細(xì)胞浸潤及炎癥因子的釋放，導(dǎo)致毛囊破壞、毛發(fā)脫落[2]。輔助 T 細(xì)胞 17（Th17）及調(diào)節(jié) T 細(xì)胞（Treg）均為新近發(fā)現(xiàn)的CD4+T細(xì)胞亞群。兩者起源相同，但功能卻相互拮抗。Th17促進(jìn)炎癥反應(yīng)，通過分泌白介素（IL）-17、IL-6、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等炎癥因子在炎癥和自身免疫性疾病中發(fā)揮重要作用[3]。而Treg能抑制炎癥反應(yīng)，通過控制免疫應(yīng)答的強度，防止過度免疫所致的組織損傷來維持機體的免疫穩(wěn)態(tài)[4]。Th17和Treg之間功能的失衡與多種自身免疫性疾病密切相關(guān)。

筆者采用滋水涵木通絡(luò)法治療肝腎不足型斑禿，臨床效果良好。本文擬從Th17/Treg功能角度，探討滋水涵木通絡(luò)法治療肝腎不足型斑禿的機制，為促進(jìn)中藥療法進(jìn)一步推廣應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 總RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（All-in-one First-Strand cDNA Synthesis Kit）、熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）反應(yīng)試劑盒均購自北京康為世紀(jì)有限公司。酶聯(lián)反應(yīng)吸附（ELISA）試劑盒購自德國IBL公司。所用儀器為ABI7500型熒光定量PCR儀、MD酶標(biāo)儀等。

1.2 一般資料 66例研究病例均來自天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚科門診。其中男30例，女36例，年齡18~55歲，平均年齡38.61歲。

1.3 診斷標(biāo)準(zhǔn) 西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)：參照《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》“中藥新藥治療禿發(fā)癥的臨床研究指導(dǎo)原則”，標(biāo)準(zhǔn)如下：1）突然或短期內(nèi)頭發(fā)片狀脫落，單發(fā)或多發(fā)。2）脫發(fā)區(qū)皮色正常，無明顯炎癥反應(yīng)。3）脫發(fā)區(qū)皮膚未見萎縮及瘢痕。中醫(yī)證型診斷標(biāo)準(zhǔn)：參照《中醫(yī)外科學(xué)》中的辨證分型標(biāo)準(zhǔn)[5]。肝腎不足證：患者平日毛發(fā)質(zhì)量偏黃或偏白，突然成片狀脫發(fā)，以中青年患者為主，常伴有心情抑郁，煩躁，工作生活緊張，易怒，腰膝酸軟，眩暈耳鳴，易疲勞，舌紅苔薄白，脈弦細(xì)。

1.4 納入標(biāo)準(zhǔn) 1）年齡在18~60周歲，性別不限。2）符合診斷標(biāo)準(zhǔn)。3）自愿接受本治療方案并簽署知情同意書。

1.5 排除標(biāo)準(zhǔn) 1）不符合納入標(biāo)準(zhǔn)的患者。2）真菌性脫發(fā)、化療性脫發(fā)、藥物性脫發(fā)、女性產(chǎn)后脫發(fā)、癥狀性脫發(fā)、內(nèi)分泌性脫發(fā)（如甲狀腺功能亢進(jìn)、甲狀腺功能低下、性腺功能減退、甲狀旁腺功能低下、垂體功能低下、糖尿病等）。3）合并心腦血管病、血液系統(tǒng)疾病、肝臟腎臟疾病、免疫性疾病、惡性腫瘤及精神疾病等基礎(chǔ)疾病。4）不按規(guī)定時間服藥及復(fù)診者，影響療效或安全性判斷者，資料不全或無法判定療效者。5）哺乳期或妊娠期婦女。

1.6 剔除標(biāo)準(zhǔn) 1）依從性差，無法正常完成臨床觀察者。2）不按時服用藥物者。3）不按時復(fù)診者。4）私自服用或外用其他藥物影響療效判斷者。5）突發(fā)其他疾病必須終止治療者。6）自動停止治療或因故失訪者。

1.7 研究方法 將符合納入標(biāo)準(zhǔn)的66例受試者，給予口服本院自擬滋水涵木通絡(luò)湯劑（熟地黃30 g，山茱萸10 g，制何首烏30 g，菟絲子10 g，杜仲10 g，黃精 10 g，五味子 10 g，枸杞子 15 g，雞血藤 30 g，女貞子 10 g，墨旱蓮 10 g，桑椹 10 g，天麻 10 g，葛根10 g，桑寄生 10 g，丹參 15 g，柴胡 10 g，郁金 10 g，珍珠母 20 g，澤瀉 10 g，甘草 6 g），每日 1 劑，水煎服，持續(xù)12周，期間不給予任何外用藥物治療。用藥前及服藥12周后采集靜脈血，并進(jìn)行療效評價。同時采集30名年齡、性別匹配的正常人外周血，作為正常對照，以評價用藥前后患者外周血相關(guān)指標(biāo)的變化。

1.8 療效評定標(biāo)準(zhǔn) 參照衛(wèi)生部1997年發(fā)布的《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》中關(guān)于脫發(fā)的療效判定標(biāo)準(zhǔn)[6]。

1.8.1 主要觀察項目 觀察患者毛發(fā)的密度、粗細(xì)、色澤、油膩、再生情況以及拉發(fā)試驗。1）脫發(fā)區(qū)新生毛發(fā)密度與健發(fā)區(qū)無差別0分；稍較健發(fā)區(qū)稀疏1分，較健發(fā)區(qū)稀疏2分，明顯較健發(fā)區(qū)稀疏3分。2）脫發(fā)區(qū)新生毛發(fā)粗細(xì)與健發(fā)區(qū)無差別0分，稍較健發(fā)區(qū)細(xì)軟1分，較健發(fā)區(qū)細(xì)軟2分，明顯較健發(fā)區(qū)細(xì)軟3分。3）脫發(fā)區(qū)新生毛發(fā)色澤色黑0分，色褐1分，色灰或黃2分，色白3分。4）脫發(fā)區(qū)新生毛發(fā)再生情況100%，不脫0分；大于70%且小于95%，不脫1分；大于30%且小于70%，不脫2分；小于30%或仍脫落3分。輕拉發(fā)試驗，陰性0分，陽性1分。

1.8.2 療效評價 臨床痊愈：毛發(fā)停止脫落，脫發(fā)區(qū)毛發(fā)全部長出，其分布密度、粗細(xì)、色澤與健發(fā)區(qū)相同，療效指數(shù)>90%；顯效：毛發(fā)停止脫落，脫發(fā)區(qū)毛發(fā)再生率達(dá)70%以上，其密度、粗細(xì)及色澤均接近健發(fā)區(qū)，60%<療效指數(shù)≤90%；有效：毛發(fā)停止脫落，脫發(fā)區(qū)毛發(fā)再生率達(dá)30%以上，包括毳毛及白發(fā)長出，30%<療效指數(shù)≤60%；無效：脫發(fā)再生不足30%或仍繼續(xù)脫落，療效指數(shù)≤30%。

1.9 PCR法測定血中維甲酸相關(guān)核孤兒受體γt（RORγt）和叉頭框蛋白（Foxp3）mRNA的水平 取健康人及患者新鮮血液1.5 mL，依試劑盒說明書提取總RNA，將2μL總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。將cDNA加入到含有上下游引物、熒光染料的反應(yīng)體系中，進(jìn)行擴增和檢測。引物由上海生工合成。Foxp3的引物序列為 5’-CACCCAGGAAAGACAGCAACC-3’和5’-GCAAGAGCTCTTGTCCATTGA-3’；RORγt的引物 序 列 為 5’-ACCTCCACTGCCAGCTGTGTGCTGTC-3 和 5’TCATTTCTGCACTTCTGCATGTAGACTGTCCC-3’；GAPDH 引物 序列為 5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’和 5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’。PCR擴增條件為：95℃預(yù)變性 5 min；95 ℃ 10 s、50 ℃ 20 s、72 ℃ 20 s，進(jìn)行40個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束，2-△△CT法分析結(jié)果，計算目的基因相對于參比基因GAPDH的表達(dá)情況。

1.10 酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法測定細(xì)胞因子水平依試劑盒說明書，檢測血清中Th17相關(guān)細(xì)胞因子IL-17A和Treg相關(guān)細(xì)胞因子轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）的水平。

1.11 統(tǒng)計方法 使用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組內(nèi)比較采用配對樣本t檢驗；組間比較采用獨立樣本t檢驗。計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者治療前后積分比較 健康人及患者年齡、性別無統(tǒng)計學(xué)差異，組間具有可比性，見表1。所有患者均完成12周的臨床試驗觀察，治療前后的積分分別為（11.85±2.08）分和（3.30±0.94）分，兩者比較有顯著性（P<0.01）。提示滋水涵木通絡(luò)湯劑能有效治療斑禿。

2.2 有效率分析 經(jīng)治療，多數(shù)患者脫發(fā)區(qū)長出新生毛發(fā)，色澤棕黑，較為致密?；颊咧杏?4例痊愈，32例顯效，18例有效，2例無效，總有效率為96.97%。

表1 基線情況Tab.1 Baseline characteristics

2.3 患者治療前后RORγt和Foxp3 mRNA水平的變化 與健康人相比，患者治療前RORγt mRNA水平明顯升高（P<0.01）；而Foxp3 mRNA水平明顯降低（P<0.001）。經(jīng)過治療，患者RORγt和Foxp3 mRNA水平均改善，與治療前相比有顯著性差異（P<0.01），見表 2。

表2 治療前后血中RORγt和Foxp3 mRNA的水平（x±s）Tab.2 Levels of RORγt and Foxp3 mRNA in the blood before and after treatment（x±s）

2.4 患者治療前后細(xì)胞因子水平的變化 與正常人相比，患者血清中IL-17A水平顯著升高（P<0.01）；而TGF-β1水平明顯下降（P<0.01）。經(jīng)過治療，患者血清中IL-17A和TGF-β1水平均有顯著性差異，與治療前相比有顯著性差異（P<0.01），見表3。

表3 治療前后細(xì)胞因子的水平（x±s）Tab.3 Cytokine levels in the serum before and after treatmen（tx±s）pg/mL

3 討論

斑禿在中醫(yī)學(xué)屬于“油風(fēng)脫發(fā)”范疇，可發(fā)生于任何年齡，但以青壯年居多，可逐漸自愈，亦能反復(fù)發(fā)作，隨長隨落，經(jīng)久不愈。臨床上針對斑禿的病因病機（肝腎不足、血熱風(fēng)燥、氣滯血瘀、氣血虧虛等），治以滋補肝腎、益氣補血、活血祛風(fēng)等法。此外，也有針灸治療斑禿的報道。斑禿是中醫(yī)優(yōu)勢病種，中藥治療不良反應(yīng)小，成本低，安全性好，長期治療患者易于接受。但是外用藥容易揮發(fā)，針刺治療需要病人每日前來就診，患者依從性差。因此，采用方劑口服治療是較為合適的治療方法。

臨床斑禿患者多數(shù)表現(xiàn)出平素頭發(fā)焦黃或花白，發(fā)病時呈大片均勻脫落，伴頭昏耳鳴，目眩，腰膝酸軟，舌淡，苔薄白，脈細(xì)數(shù)等肝腎不足的現(xiàn)象。腎藏精，腎中精氣的盛衰是機體生、長、壯、老、已的根本，機體齒、骨、發(fā)的生長狀態(tài)是觀察腎中精氣的外候。腎精化生元氣，元氣可外達(dá)肌腠皮毛，具有溫煦和激發(fā)皮膚毛發(fā)生長的功能。肝主疏泄，當(dāng)肝失疏泄，氣機郁結(jié)時，導(dǎo)致全身氣血運行不暢，毛發(fā)營養(yǎng)的供應(yīng)受阻。血營養(yǎng)全身組織和器官，同樣對毛發(fā)起營養(yǎng)作用，血的運行，必須要在氣的推動下，上注于肺，行于經(jīng)脈之中，均勻布散于全身?！鞍l(fā)為血之余”，血氣旺盛，則毛發(fā)也旺盛，因此在臨床采用滋水涵木通絡(luò)法對斑禿加以治療?！白趟奔囱a益腎精，“涵木”即寓補肝于補腎之中。主在補腎，協(xié)調(diào)在肝腎。經(jīng)絡(luò)是人體氣血運行的通路，能將營養(yǎng)物質(zhì)輸布到全身各個組織器官。方中熟地黃、制何首烏、雞血藤為君藥，旨在滋補腎精，濡養(yǎng)肝血，疏通脈絡(luò)。山茱萸、菟絲子、杜仲、黃精、枸杞子、女貞子、墨旱蓮、桑椹、桑寄生、丹參為臣藥，共同輔助君藥，增強其滋腎養(yǎng)肝通絡(luò)之功效。五味子、珍珠母、澤瀉、柴胡、郁金為佐藥。天麻、葛根、甘草為使藥。因肝腎不足容易導(dǎo)致肝陽偏亢，肝腎不足也會影響心脾導(dǎo)致血脈運行差，因此方中添加了平肝通絡(luò)之品，在注重補益肝腎的同時，還側(cè)重平肝陽、通經(jīng)絡(luò)，臨床應(yīng)用取得良好療效。

近年研究顯示，斑禿是T細(xì)胞介導(dǎo)的器官特異性自身免疫性疾病，患處可見T細(xì)胞浸潤及炎癥因子的釋放，導(dǎo)致毛囊破壞、毛發(fā)脫落[2]。Th17和Treg細(xì)胞均為新近發(fā)現(xiàn)的CD4+T細(xì)胞亞群。兩者起源相同，但功能卻相互拮抗。Th17促進(jìn)炎癥反應(yīng)，通過分泌IL-17、IL-6、TNFα等炎癥因子在炎癥和自身免疫性疾病中發(fā)揮重要作用[3]。其中IL-17最為重要，機體適應(yīng)性免疫系統(tǒng)通過IL-17和先天免疫系統(tǒng)相聯(lián)系，促進(jìn)炎癥反應(yīng)過程。IL-17能誘導(dǎo)IL-6、TNF-α等炎癥因子大量釋放，引起組織浸潤和破壞；并與IL-6、TNF-α等產(chǎn)生協(xié)同作用，放大炎癥效應(yīng)。RORγt是Th17重要的轉(zhuǎn)錄因子，能促進(jìn)Th17增殖分化并調(diào)節(jié)Th17的功能。而Treg能抑制炎癥反應(yīng)，通過控制免疫應(yīng)答的強度，防止過度免疫所致的組織損傷來維持機體的免疫穩(wěn)態(tài)[4]。Treg不僅直接抑制效應(yīng)T細(xì)胞的活化增殖及IL-2、γ干擾素（IFNγ）等炎癥因子的分泌；還通過表達(dá)TGF-β等抗炎因子來抑制效應(yīng)T細(xì)胞的活性。Foxp3是Treg細(xì)胞的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，對Treg功能的維持有重要作用。Th17和Treg兩者之間功能的失衡是多種自身免疫性疾病及炎性疾病發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵原因。研究顯示，斑禿患者血清Th17水平較高，而Treg水平較低[7]；脫發(fā)處毛囊周圍有Th17細(xì)胞浸潤[8]；而Treg細(xì)胞明顯減少[9]。本研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，患者血液中RORγt mRNA表達(dá)和致炎因子IL-17A的濃度較正常人升高，而Foxp3 mRNA和抗炎因子TGF-β1水平下降。提示患者體內(nèi)Th17細(xì)胞功能增強，而Treg細(xì)胞功能下降，體內(nèi)環(huán)境處于免疫調(diào)節(jié)失衡狀態(tài)。經(jīng)藥物治療后，上述情況得以好轉(zhuǎn)。說明滋水涵木通絡(luò)法治療斑禿能降低患者體內(nèi)過度活化的免疫反應(yīng)，減輕局部炎癥損傷，起到保護(hù)毛囊、抑制脫發(fā)的作用。

綜上，斑禿的發(fā)病可能與Th17/Treg細(xì)胞間功能失衡有關(guān)，滋水涵木通絡(luò)法通過調(diào)節(jié)患者體內(nèi)Th17/Treg細(xì)胞的免疫功能及與兩者相關(guān)的致炎與抗炎因子水平，來抑制過度活化的免疫炎癥反應(yīng)，進(jìn)而促進(jìn)毛發(fā)生長。