YEATS域含蛋白質(zhì)4在胰腺癌組織中的表達(dá)及預(yù)后意義

陳吉祥，章俊亞，黨勝春，錢小寶，崔磊

（1． 江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院 普通外科，江蘇 鎮(zhèn)江 212001；2． 江蘇大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013）

胰腺癌是全球癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一，其發(fā)病率逐年增加[1]。胰腺癌是一種生存率極低的高度侵襲性惡性腫瘤，預(yù)后極差，總體5年生存率低于5%[2]。由于胰腺癌患者缺乏特異性癥狀，使得早期診斷困難，通常診斷時(shí)已經(jīng)處于發(fā)生局部浸潤(rùn)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的疾病晚期，從而延誤了手術(shù)切除時(shí)機(jī)[3-6]?；煾纳屏嗽S多癌癥的預(yù)后，但其對(duì)胰腺癌的治療效果非常有限，正是由于胰腺癌對(duì)化療藥物具有高度的抗性[7]。目前胰腺癌的發(fā)病機(jī)制仍不清楚，因此迫切需要確定胰腺癌的治療靶點(diǎn)、預(yù)后標(biāo)記物和新的治療策略，以對(duì)胰腺癌患者的生存提供有意義的影響。

YEATS域含蛋白質(zhì)4（YEATS domaincontaining protein 4，YEATS4）是一種高度保守的核蛋白，屬于YEATS家族結(jié)構(gòu)域蛋白，最初在人腦膠質(zhì)瘤中被發(fā)現(xiàn)[8]。而YEATS結(jié)構(gòu)域由5種YEATS家族結(jié)構(gòu)域蛋白YAF、ENL、AF9、TAF14、SAS5首字母命名[9]。相關(guān)報(bào)道證實(shí)ENL的YEATS結(jié)構(gòu)域通過識(shí)別結(jié)合組蛋白H3尾部的乙?；揎椩鰪?qiáng)白血病相關(guān)基因的表達(dá)，導(dǎo)致急性白血病發(fā)生[10]。目前，YEATS4已被發(fā)現(xiàn)參與了致癌過程。YEATS4基因擴(kuò)增于非小細(xì)胞肺癌，抑制p53通路促進(jìn)肺癌細(xì)胞增殖并抑制細(xì)胞凋亡[11]。據(jù)報(bào)道[12]，YEATS4作為一種轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，與卵巢癌細(xì)胞的耐藥性密切相關(guān)。此外，敲低YEATS4蛋白表達(dá)可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[13]。然而，YEATS4在胰腺癌中的功能尚不清楚。本研究利用組織芯片技術(shù)及免疫組化方法檢測(cè)YEATS4在80例胰腺癌組織及相應(yīng)癌旁組織的表達(dá)，分析YEATS4在胰腺癌中的表達(dá)與臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料來源

YEATS4抗體購(gòu)自于臺(tái)灣Abnova公司，收集了2011年3月—2017年8月于江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院行手術(shù)切除以及經(jīng)病理確診的80例胰腺導(dǎo)管細(xì)胞癌（pancreatic ductal carcinoma，PDAC）患者的臨床資料及組織樣本。本研究已經(jīng)通過倫理委員會(huì)批準(zhǔn)及患者本人知情同意。所有患者術(shù)前均未接受任何治療，樣本包括胰腺癌組織及相應(yīng)癌旁組織。其中男42例，女38例；年齡36～83歲，中位年齡為68歲。

1.2 構(gòu)建組織芯片

選取80例胰腺癌患者的組織標(biāo)本，每例標(biāo)本包含2個(gè)位點(diǎn)（胰腺癌組織及相應(yīng)癌旁組織），共計(jì)160個(gè)位點(diǎn)，制作我們所需要的組織芯片微陣列。同時(shí)充分記錄了患者的臨床病理信息，包括患者的性別、年齡、腫瘤部位、病理分級(jí)、腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、神經(jīng)轉(zhuǎn)移、脈管侵犯和隨訪數(shù)據(jù)（截至2018年5月）。

1.3 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)YEATS4的表達(dá)

胰腺癌組織和正常胰腺組織經(jīng)10%的福爾馬林固定脫水，常規(guī)石蠟包埋后，4 μm連續(xù)石蠟切片。采用ABC法進(jìn)行免疫組織化學(xué)的檢測(cè)，蘇木精復(fù)染核。IgG代替YEATS4做一抗，檢測(cè)YEATS4的特異性。陽性定位于胰腺癌細(xì)胞胞核，細(xì)顆粒狀。

1.4 結(jié)果判定

兩位病理醫(yī)師在對(duì)臨床數(shù)據(jù)不知情的情況下，對(duì)染色結(jié)果進(jìn)行評(píng)分。染色強(qiáng)度分為：0，無染色；1+，淡黃；2+，黃色；和3+，棕黃。陽性腫瘤細(xì)胞的比例分為3個(gè)水平：0分（＜10%），1分（20%～24%），2分（25%～50%），3分（＞50%）。染色指數(shù)（SI）計(jì)算為染色強(qiáng)度評(píng)分與陽性評(píng)分的乘積。 最佳截?cái)嘀当淮_定如下：SI得分＞ 3為陽性表達(dá)；SI得分≤3為陰性表達(dá)[14]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，通過χ2檢驗(yàn)分析YEATS4表達(dá)與臨床病理特征之間的關(guān)系。Kaplan-Meier法計(jì)算生存率，并且繪制生存曲線。運(yùn)用Log-rank檢驗(yàn)，取α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 臨床病理特征

本組80例胰腺癌患者詳細(xì)臨床數(shù)據(jù)資料。男性52.5%（42例），女性47.5%（38例）；中位年齡68（36～83）歲；低分化者26.25%（21例），中分化者48.75%（39例），高分化者25%（20例）；TNM分期為I/II期者46.25%（37例），III/IV期者53.75%（43例）；有神經(jīng)轉(zhuǎn)移者50例，無神經(jīng)轉(zhuǎn)移者30例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者40例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者 40例；有脈管侵犯者33例，無脈管侵犯者47例。

2.2 YEATS4蛋白在胰腺癌組織及胰腺癌旁組織的表達(dá)

YEATS4蛋白在胰腺癌組織及胰腺癌旁組織的表達(dá)主要在細(xì)胞核。YEATS4在胰腺癌組織中的表達(dá)明顯高于與其對(duì)應(yīng)癌旁組織中的表達(dá)（P＜0.05）（圖1）。胰腺癌組織中YEATS4陽性表達(dá)者45例（56.25%），在癌旁組織中陽性表達(dá)者為21例（26.25%），胰腺癌組織高表達(dá)率高于在胰腺癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1 免疫組化法檢測(cè)YEATS4蛋白表達(dá)（×200）Figure 1 Immunohistochemical staining for YEATS4 protein expression (×200)

2.3 YEATS4的表達(dá)與臨床病理特征之間的關(guān)系

分析結(jié)果顯示，YEATS4蛋白表達(dá)與胰腺癌患者的性別、TMN分期、神經(jīng)轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及脈管侵犯均有明顯關(guān)系（均P＜0.05）（表1）。

表1 YEATS4蛋白表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系[n（%）]Table 1 Relationship between YEATS4 protein expression and clinicopathologic features of patients [n (%)]

2.4 YEATS4的表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系

經(jīng)Kaplan-Meier生存分析及Log-rank檢驗(yàn)顯示，YEATS4陽性表達(dá)組的中位生存時(shí)間為15.44個(gè)月，陰性表達(dá)組的中位生存時(shí)間為26.10個(gè)月，YEATS4的陽性表達(dá)組的預(yù)后較陰性表達(dá)組差，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=7.593，P=0.0059）（圖2）。分別分析YEATS4在TMN分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、神經(jīng)轉(zhuǎn)移和脈管侵犯患者中的表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系，結(jié)果顯示，YEATS4陽性表達(dá)的胰腺癌患者的不良預(yù)后與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、神經(jīng)轉(zhuǎn)移及腫瘤臨床分期相關(guān)（圖3）。單因素分析提示，YEATS4蛋白表達(dá)、TMN分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與患者生存預(yù)后緊密相關(guān)（均P＜0.05），多元Cox回歸模型分析結(jié)果證實(shí)，YEATS4蛋白表達(dá)可以作為胰腺癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（HR=2.1，95% CI=1.1～4.2，P=0.026）（表2）。

圖2 YEATS4陽性與陰性胰腺癌患者生存曲線Figure 2 Survival curves of pancreatic cancer patients with positive and negative YEATS4 expression

圖3 不同臨床病理因素胰腺癌患者中YEATS4表達(dá)與生存率的關(guān)系Figure 3 Relationship between YEATS4 and prognosis in pancreatic cancer patients with different clinicopathologic features

表2 胰腺癌患者預(yù)后因素分析Table 2 Analysis of prognostic factors for pancreatic cancer patients

3 討 論

YEATS4位于人類染色體區(qū)域12q13-15，其蛋白含有227個(gè)氨基酸，分子量為26.7 kD。YEATS4在C-末端具有帶負(fù)電荷的α-螺旋結(jié)構(gòu)，這是真核轉(zhuǎn)錄因子激活域的典型特征，也是蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用區(qū)域[8]。N端結(jié)構(gòu)域是由YEATS蛋白家族中高度保守的tf2f結(jié)構(gòu)域組成[15]。Ding等[16]報(bào)道YEATS4可以作為轉(zhuǎn)錄共激活劑用于AP-2β以增強(qiáng)其DNA結(jié)合活性。先前研究指出YEATS4與人類MLLT1和MLLT3蛋白具有高度的序列同源性，表明編碼的蛋白可能代表某種轉(zhuǎn)錄因子，可以通過 C末端激活域與髓細(xì)胞-淋巴細(xì)胞白血?。╩yeloid-lymphoid leukemia，MLL）編碼蛋白AF10相互作用，參與白血病的發(fā)生和發(fā)展[17]。YEATS4通過與一般轉(zhuǎn)錄因子TFIIF相互作用，在RNA轉(zhuǎn)錄過程中起著重要作用[18]。最近研究[19]表明，YEATS4是一個(gè)關(guān)鍵的RNA干擾（RNA interference，RNAi）組分，可使細(xì)胞核中RNAi過程正常進(jìn)行。以上研究表明YEATS4在RNA轉(zhuǎn)錄過程中的重要性，參與了細(xì)胞增殖、分化和致癌等過程。

本次研究結(jié)合應(yīng)用了免疫組化技術(shù)和臨床數(shù)據(jù)資料分析揭示YEATS4在胰腺癌組織中的異常表達(dá)及預(yù)后意義。研究結(jié)果顯示，YEATS4在胰腺癌組織中的表達(dá)顯著高于正常組織及癌旁組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。同時(shí)，YEATS4表達(dá)與性別、TMN分期、神經(jīng)轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管侵犯有關(guān)（P＜0.05），而與年齡、腫瘤部位、分化程度無關(guān)。這說明胰腺癌的發(fā)生是一種漸進(jìn)逐步發(fā)展的過程，YEATS4可能參與了胰腺癌的發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程。生存分析表明YEATS4蛋白陰性表達(dá)組與陽性表達(dá)組相比具有生存優(yōu)勢(shì)，生存期相對(duì)延長(zhǎng)。此外，發(fā)現(xiàn)在YEATS4高表達(dá)的胰腺癌患者中臨床分期較晚（III～I(xiàn)V）、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及神經(jīng)轉(zhuǎn)移的預(yù)后相對(duì)較差。單因素及多因素回歸分析結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了YEATS4蛋白表達(dá)可作為胰腺癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

多數(shù)研究表明，多種類型腫瘤具有沿神經(jīng)侵襲的生物學(xué)特性，是影響腫瘤患者術(shù)后生存質(zhì)量的重要因素。胰腺癌細(xì)胞可直接浸潤(rùn)神經(jīng)束膜或束膜周圍的脈管，侵犯神經(jīng)，形成新的轉(zhuǎn)移灶，是造成胰腺癌患者嚴(yán)重背痛和術(shù)后復(fù)發(fā)的原因。Ji等[20]發(fā)現(xiàn)YEATS4調(diào)節(jié)細(xì)胞核和細(xì)胞裂解液中β-鏈接蛋白（β-catenin）的表達(dá)和磷酸化，同時(shí)，YEATS4直接調(diào)控β-catenin的轉(zhuǎn)錄表達(dá)并調(diào)控β-catenin啟動(dòng)子區(qū)的乙?；?。胞質(zhì)β-catenin的磷酸化/降解過程調(diào)節(jié)著Wnt經(jīng)典信號(hào)通路，Wnt/β-catenin通路是誘導(dǎo)上皮組織上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）產(chǎn)生的關(guān)鍵信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[21]。Schmalhofer等[22]證實(shí)EMT發(fā)生后，腫瘤細(xì)胞的侵襲能力將明顯增強(qiáng)。由此推測(cè)YEATS4可能通過間接調(diào)控Wnt/β-catenin通路來誘導(dǎo)胰腺癌上皮EMT的發(fā)生，從而引起癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，有待后續(xù)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)一步驗(yàn)證。

本次研究應(yīng)用了組織芯片技術(shù)，進(jìn)一步證實(shí)了YEATS4在胰腺癌組織中的高表達(dá)與預(yù)后價(jià)值，將對(duì)胰腺癌靶向藥物治療的研發(fā)及胰腺癌患者的術(shù)后評(píng)估提供重要的理論依據(jù)和臨床指導(dǎo)。