止血祛瘀明目片在非缺血型視網(wǎng)膜靜脈阻塞中的作用機(jī)制研究

韓治華 ，吳沂旎 ，王芳 ，吳雪梅 ，冀璐 ，楊淑煥

中國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為視網(wǎng)膜靜脈阻塞（retinal vein occlusion，RVO）屬“絡(luò)損暴盲”“血癥”范疇，臨床表現(xiàn)為突然出現(xiàn)不同程度的視物障礙，眼底表現(xiàn)為血管周圍片狀的出血，重者可致盲。中醫(yī)對(duì)RVO的研究多認(rèn)為“血瘀”“血虛”“痰瘀”是其主要證候。西醫(yī)認(rèn)為RVO是以視網(wǎng)膜血管閉塞，進(jìn)而引發(fā)視網(wǎng)膜缺血缺氧及網(wǎng)膜無(wú)灌注的一種缺血性視網(wǎng)膜疾病。目前認(rèn)為炎癥在其致病中的作用越來(lái)越明顯。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF)是目前公認(rèn)的血管生成因子及血管通透性分子。其在RVO中的作用尚不清楚。止血祛瘀明目片是由約15種中草藥組成的一種中藥制劑，其中黃苓、牡丹皮、夏枯草具有清肝明目、清熱解毒等作用。已有研究提示止血祛瘀明目片在RVO中可改善視網(wǎng)膜血管閉塞及缺血情況，且治療后房水中炎性因子水平顯著降低[1]。但止血祛瘀明目片如何發(fā)揮作用及其分子信號(hào)通路目前尚不清楚。本研究對(duì)RVO患者采用止血祛瘀明目片聯(lián)合卵磷脂絡(luò)合碘進(jìn)行治療，深入探討其作用機(jī)制具有重要的臨床意義。

1 對(duì)象與方法

1.1 一般資料

收集2014年9月—2018年5月陜西省中醫(yī)醫(yī)院眼科收治的92例非缺血型視網(wǎng)膜靜脈阻塞患者，因失訪脫落7例，最終納入85例符合納排標(biāo)準(zhǔn)的患者，男 39例，女 46例；年齡 40～80歲，平均（61.9±9.5）歲；病程 3～35 d，平均（10.6±4.7） d。隨機(jī)方法分為2組，治療組最終45人（45只眼），其中男 20例，女25例；年齡43～82歲，平均年齡（61.9±9.5）歲；對(duì)照組最終納入40例（40只眼），其中男19例，女 21例；年齡 25～73 歲，平均年齡（61.4±9.7）歲。病程3～35 d。兩組患者一般臨床資料間差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)[2-4]（1）主要癥狀及體征：①視力不同程度下降，多為單眼發(fā)??；②眼底檢查示視網(wǎng)膜靜脈迂曲擴(kuò)張，沿病變靜脈區(qū)有視網(wǎng)膜出血、滲出及水腫等，可伴有視乳頭水腫充血、邊緣模糊；③眼底熒光血管造影可見靜脈充盈時(shí)間延遲，病變區(qū)熒光滲漏，毛細(xì)血管迂曲擴(kuò)張，可出現(xiàn)無(wú)灌注區(qū)及新生血管。（2）根據(jù)阻塞程度可分為缺血型和非缺血型（表 1）。

表1 視網(wǎng)膜靜脈阻塞分型標(biāo)準(zhǔn)

1.2.2 瘀血傷絡(luò)，陰虛內(nèi)熱證中醫(yī)辨證依據(jù)[2,5]（1）瘀血傷絡(luò)，陰虛內(nèi)熱證：主癥，視物不清；次癥，目睛干澀，視物變形、頭暈耳鳴，口咽干燥；舌脈，舌暗紅，少苔，脈弦細(xì)。主癥視物不清必備，次癥2項(xiàng)或以上，參考舌脈即可診斷。（2）中醫(yī)癥狀評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表2。

1.3 納入標(biāo)準(zhǔn)

（1）符合非缺血型視網(wǎng)膜中央靜脈阻塞西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)者，且伴有黃斑水腫的患者；（2）符合中醫(yī)證候瘀血傷絡(luò)，陰虛內(nèi)熱證辨證標(biāo)準(zhǔn)者；（3）發(fā)病在3個(gè)月以內(nèi)的患者 （不含3個(gè)月）；（4）年齡35～75歲。

表2 中醫(yī)癥狀評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)表

1.4 排除標(biāo)準(zhǔn)

（1）伴有角膜混濁、角膜散光等對(duì)視力有影響的眼部疾病者；（2）既往有眼部手術(shù)史及前房淺、房角窄者；（3）合并嚴(yán)重肝、腎功能不全者；（4）妊娠及哺乳期婦女；（5）過(guò)敏體質(zhì)患者；（6）未簽署知情協(xié)議書者。

1.5 研究方法

1.5.1 用藥方法及所用試劑 止血祛瘀明目片(由陜西摩美得氣血和制藥有限公司生產(chǎn)），薄膜衣每片重0.3 g。卵磷脂絡(luò)合碘片（由日本第一藥品產(chǎn)業(yè)株式會(huì)社生產(chǎn)）1.5 mg/片。 兔抗人多克隆抗體 NF-κB（1:5000）及兔抗人單克隆抗體 VCAM-1（1:1000）均購(gòu)自英國(guó)abcam公司。

1.5.2 治療方法 兩組所有患者均給予靜滴注射用血栓通300 mg/d，及神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)劑（小牛血清去蛋白注射液）0.8 g/次，1次/d，作為基礎(chǔ)治療。對(duì)照組患者口服卵磷脂絡(luò)合碘片，1.5 mg/次，3次/d。治療組患者在對(duì)照組基礎(chǔ)上口服止血祛瘀明目片，每次5篇，每日3次。兩組患者均連續(xù)治療12周。

1.6 觀察指標(biāo)

1.6.1 視力檢查 采用國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)視力表檢查患者治療前后最佳矯正視力，以小數(shù)記錄,治療期每4周記錄1次。

1.6.2 眼底出血面積的改善 散瞳后行眼底鏡檢查及眼底照相，記錄出血部位及面積，折合成視盤直徑（PD)計(jì)算，觀察精確度至1/5 PD,治療期每4周記錄1次。比較兩組患者在治療前后變化情況。

1.6.3 中醫(yī)證候 采集患者中醫(yī)證候材料，分別于治療前、試驗(yàn)4周、試驗(yàn)8周、試驗(yàn)12周進(jìn)行采集。

1.6.4 血清VEGF、IL-6和IL8水平 采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)法檢測(cè)兩組患者治療前后血清中VEGF、IL-6和IL-8水平。分別在治療前和治療12周時(shí)抽取兩組患者血清，用雙抗夾心ELISA法檢測(cè)血清中VEGF、IL-6和IL-8的含量。

1.6.5 NF-κB及VCAM-1的蛋白表達(dá) 采用Western blot檢測(cè)，分別于治療前和治療12周時(shí)抽取兩組患者血清，用血清總蛋白提取試劑盒提取總蛋白，用BCA法測(cè)定總蛋白濃度，通過(guò)SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜、封閉抗體ECL化學(xué)發(fā)光，用β-actin的表達(dá)作為內(nèi)參照進(jìn)行比較，測(cè)定目的蛋白條帶密度灰度值與內(nèi)參蛋白條帶密度灰度值的比值，即為目的蛋白相對(duì)灰度值。

1.7 療效指標(biāo)

1.7.1 視力改善情況 顯效：視力提高4行及以上或達(dá)到1.0；有效：視力提高2行；無(wú)效：視力無(wú)變化或下降。注：雙眼發(fā)病者評(píng)價(jià)右眼。按照國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)視力表1分制進(jìn)行記錄；0.1以下視力增加檔次按以下方法計(jì)算：無(wú)光感、光感、手動(dòng)、數(shù)指/33 cm、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1.增加 2行為有效；增加 4行及以上為顯效。

1.7.2 眼底出血療效 臨床治愈：視力恢復(fù)1.0以上，或恢復(fù)至發(fā)病前視力，眼底出血基本吸收，眼底血管熒光造影基本正常；顯效：視力提高4行以上，眼底出血量大部分吸收（1/2～2/3面積），眼底血光熒光造影明顯改善；有效：視力提高2～3行以上，眼底出血量大部分吸收（1/3～1/2面積），眼底血光熒光造影有所改善；無(wú)效：視力無(wú)變化或下降，眼底出血無(wú)變化或增多，眼底血光熒光造影無(wú)變化或惡化[6]。

1.7.3 中醫(yī)證候總積分評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[6]臨床痊愈：中醫(yī)證候積分減少≥95%；顯效：中醫(yī)證候積分減少≥70%；有效：中醫(yī)證候積分減少≥30%；無(wú)效：中醫(yī)證候積分減少不足30%。療效指數(shù)n=[（療前總積分-療后總積分）/療前總積分]×100%。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，計(jì)量資料將采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（xˉ±s）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本 t檢驗(yàn)，組內(nèi)治療前后比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)。兩組間等級(jí)定性資料采用Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)。統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)均采用雙側(cè)檢驗(yàn)，P＜0.05為檢驗(yàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者不同時(shí)間點(diǎn)視力比較

兩組患者視力水平發(fā)現(xiàn)治療后均比治療前顯著提高，治療組隨治療時(shí)間的延長(zhǎng)視力逐步恢復(fù)，且治療8周后視力提高顯著，對(duì)照組視力變化趨勢(shì)同治療組，但同一時(shí)間兩組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（表 3）

表3 兩組患者治療前后視力比較（xˉ±s）

2.2 眼底出血面積

眼底出血面積消退，總療效分析，治療組總有效率為80.0%，對(duì)照組總有效率為52.5%，兩組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.370，P=0.037）。 （表 4）

表4 兩組眼底出血總療效[例數(shù)（%）]

2.3 中醫(yī)證候療效

中醫(yī)證候療效分析，治療組總有效率為84.4%，對(duì)照組總有效率為55.0%，兩組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=6.403，P=0.011）。 （表 5）

表5 兩組中醫(yī)證候療效分析

2.4 兩組血清VEGF、IL-6和IL-8水平比較

兩組患者血清中VEGF、IL-6和IL-8水平檢測(cè)發(fā)現(xiàn)治療后均比治療前顯著降低，兩組治療前后相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且各個(gè)指標(biāo)治療組的效果顯著優(yōu)于對(duì)照組，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（表 6）

表6 兩組血清學(xué)指標(biāo)比較（xˉ±s）

2.5 兩組蛋白水平比較

兩組患者血漿中NF-κB及VCAM-1蛋白水平檢測(cè)發(fā)現(xiàn)治療后二者的蛋白水平顯著下調(diào)，與治療前相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且各個(gè)指標(biāo)治療組的效果顯著優(yōu)于對(duì)照組，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。 （圖 1、表 7）

圖1 治療組和對(duì)照組NF-κB和VCAM-1蛋白水平治療前后比較。CG對(duì)照組；EG治療組

3 討論

血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF)是目前公認(rèn)的血管生成因子及血管通透性分子。其主要功能是內(nèi)皮細(xì)胞增生、遷移及血管腔的形成，是一種慢性炎癥過(guò)程。Jung、Fonollosa及艾華等發(fā)現(xiàn)在RVO患者的房水及玻璃體中發(fā)現(xiàn)VEGF的明顯增高，且炎性相關(guān)因子如TNF-α、IL-6等水平也相應(yīng)升高，且RVO的嚴(yán)重程度與其濃度顯著相關(guān)，因此推測(cè)炎癥可能參與VEGF誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜新生血管的發(fā)生[7-9]。我們的研究發(fā)現(xiàn)RVO患者治療前血漿中的VEGF的水平顯著升高，治療后明顯下調(diào)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)炎性相關(guān)因子IL-6及IL-8水平在治療后水平也明顯下降，說(shuō)明VEGF及炎癥均參與了RVO的發(fā)病，同以往研究結(jié)果一致。

止血祛瘀明目片是由陜西摩美得氣血和制藥有限公司生產(chǎn)，該方中赤芍、墨旱蓮、大黃具有清熱、涼血止血；丹參、茺蔚子、三七具有活血通絡(luò)，祛瘀散血、消癰等作用；黃芩（酒炙）、牡丹皮、毛冬青和夏枯草具有抗炎作用，研究發(fā)現(xiàn)黃芩苷可顯著抑制大鼠腹腔白細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)白三烯B4、白三烯C4的生物合成，還可顯著抑制人工三肽(fMLP)激發(fā)的白細(xì)胞內(nèi)Ca2+升高，并促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)cAMP水平提高，表明黃芩苷顯著影響白細(xì)胞的多種功能并揭示了其抗炎的作用機(jī)理［10］。唐健青等[1]、宋麗君等[11]研究發(fā)現(xiàn)在 RVO中治療組 （口服止血祛瘀明目片+卵磷脂絡(luò)合碘）3個(gè)月后患者視力較對(duì)照組（口服卵磷脂絡(luò)合碘）明顯提高，且FFA顯示視網(wǎng)膜循環(huán)狀態(tài)恢復(fù)正常，視網(wǎng)膜出血顯著吸收，提示患者視網(wǎng)膜血管閉塞及缺血情況改善，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)治療組房水中VEGF水平較治療前顯著降低，優(yōu)于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。我們的研究發(fā)現(xiàn)RVO患者治療后血漿中的VEGF和炎性相關(guān)因子IL-6及IL-8水平的水平顯著下降，且同治療前相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，同以往研究結(jié)果一致。然而止血祛瘀明目片如何下調(diào)VEGF、IL-6及IL-8因子其抗炎的作用機(jī)制是那些呢？

NF-κB是一個(gè)多效的轉(zhuǎn)錄因子，其受氧化應(yīng)激、細(xì)胞因子等多種刺激而激活，能調(diào)控炎癥性細(xì)胞因子、轉(zhuǎn)錄因子及粘附因子，進(jìn)而參與微循環(huán)障礙的發(fā)生發(fā)展。血管內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子(Ascular cell adhesion molecule 1，VCAM-1)主要表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞,通過(guò)白細(xì)胞粘附、跨膜運(yùn)動(dòng)參與血管內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂導(dǎo)致血瘀癥相關(guān)疾病的發(fā)生。因此我們進(jìn)一步檢測(cè)了NF-κB及VCAM-1蛋白水平，明確在RVO的發(fā)病機(jī)制及止血祛瘀明目片的作用機(jī)制。我們的研究發(fā)現(xiàn)，治療前NF-κB及VCAM-1的蛋白表達(dá)水平明顯增高，兩組間沒有顯著差異，而治療后NF-κB的VCAM-1蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，且與治療前相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示我們止血祛瘀明目片發(fā)揮作用是通過(guò)下調(diào)NF-κB，進(jìn)一步調(diào)控炎癥因子IL-6/IL-8的水平，最終影響VCAM-1的表達(dá)，進(jìn)而在RVO中發(fā)揮作用的。即明確了VEGF/NF-κB/IL-6/IL-8/VCAM-1信號(hào)通路。細(xì)菌脂多糖刺激人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞后 4 h、8 h 發(fā)現(xiàn),炎性因子 NF-κB,TNF-α,IL-6,ICAM-1,VCAM-1均顯著增加,提示細(xì)菌脂多糖通過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)炎性細(xì)胞因子,進(jìn)而導(dǎo)致膿毒癥中的炎癥反應(yīng)[12]，這與我們的研究結(jié)果一致。

綜上所述，止血祛瘀明目片對(duì)非缺血型視網(wǎng)膜靜脈阻塞具有突出療效，有擴(kuò)張血管、增加血流量，改善微循環(huán)的作用，能促進(jìn)側(cè)支循環(huán)的建立，有利于視功能恢復(fù)。