內(nèi)臟脂肪素在大鼠結(jié)腸平滑肌收縮障礙中的作用及其機(jī)制研究*

張 靈 俞 汀 湯玉蓉 丁 雨 王 艷 林 琳

南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科(210029)

研究發(fā)現(xiàn)肥胖與多種功能性胃腸病相關(guān)，肥胖者常存在胃腸動(dòng)力障礙，可出現(xiàn)消化不良、便秘、腹脹等癥狀[1-4]，生活質(zhì)量受到嚴(yán)重影響。胃腸道運(yùn)動(dòng)主要通過(guò)腸神經(jīng)元、Cajal間質(zhì)細(xì)胞與平滑肌細(xì)胞間的相互作用控制和調(diào)節(jié)，然而關(guān)于肥胖通過(guò)何種機(jī)制改變這些細(xì)胞間的相互作用，目前知之尚少。

脂肪組織的代謝和內(nèi)分泌/旁分泌產(chǎn)物可發(fā)揮多種生物學(xué)效應(yīng)，包括影響平滑肌的收縮性，如脂肪組織分泌的瘦素可抑制胃排空[5]，并能抑制血管[6]、子宮[7]平滑肌收縮。內(nèi)臟脂肪素(visfatin, VF)是一種由內(nèi)臟脂肪分泌的脂肪細(xì)胞因子，既往研究發(fā)現(xiàn)其可抑制子宮平滑肌收縮，作用強(qiáng)于瘦素，從而造成肥胖/代謝綜合征孕婦宮縮無(wú)力[7]；此外，VF還可誘導(dǎo)主動(dòng)脈平滑肌松弛[8]。然而，目前尚無(wú)研究報(bào)道VF對(duì)結(jié)腸平滑肌收縮的影響。肥胖患者血清VF水平顯著高于正常人[9]，且常伴有結(jié)腸動(dòng)力障礙[2]，因此推測(cè)VF可能在肥胖患者的結(jié)腸動(dòng)力障礙中發(fā)揮一定作用。本研究旨在探討VF對(duì)大鼠結(jié)腸平滑肌收縮的影響及其可能機(jī)制。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑和儀器

8周齡SPF級(jí)雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠6只、12～14 日齡雄性SD乳大鼠60只(南京醫(yī)科大學(xué)醫(yī)藥實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)。

VF、鈣通道蛋白Cav1.2(α1亞基)抗體(OmnimAbs)；α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)抗體(Abcam plc.)；磷酸化和總肌球蛋白輕鏈(p-MLC、t-MLC)抗體(Cell Signaling Technology, Inc.)；FITC標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(Bioworld Technology, Inc.)；GAPDH抗體、HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)、HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(H+L)、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(碧云天生物技術(shù));鈣離子熒光探針Fluo-3 AM(Thermo Fisher Scientific)；乙酰膽堿(ACh)(Sigma-Aldrich Co.)。ALC-M離體組織器官實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)、MPA2000多道生物信號(hào)分析系統(tǒng)(上海奧爾科特生物科技有限公司)；LSM 5 PASCAL激光共聚焦顯微鏡(德國(guó)蔡司)。

二、方法

1. 肌條收縮實(shí)驗(yàn)：以頸椎脫臼法處死SD大鼠，迅速剪取一段遠(yuǎn)端結(jié)腸(距肛門(mén)5～6 cm)[10]，制備成 0.3 cm×0.8 cm的肌條。將肌條浸沒(méi)于37 ℃ Kreb’s緩沖液器官浴中，一端固定，另一端與離體組織器官實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的張力傳感器相連，持續(xù)供給95% O2、5% CO2。每根肌條給予1 g預(yù)張力，平衡30 min，待肌條穩(wěn)定，出現(xiàn)規(guī)律的自發(fā)收縮波后，使用多道生物信號(hào)分析系統(tǒng)記錄加入溶劑(PBS)或VF(200 ng/mL)對(duì)肌條收縮活動(dòng)的影響[11]。實(shí)驗(yàn)使用不同大鼠肌條重復(fù)6次。

2. 細(xì)胞培養(yǎng)和干預(yù)：12～14 日齡雄性SD乳大鼠處死后取遠(yuǎn)端結(jié)腸組織，以PBS反復(fù)沖洗，去除黏膜層和漿膜層，剪碎肌層組織，加入Ⅱ型膠原酶消化，經(jīng)離心、重懸、過(guò)篩，將結(jié)腸平滑肌細(xì)胞均勻接種于培養(yǎng)皿中，于37 ℃、95% O2、5% CO2條件下以DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、青霉素100 U/mL、鏈霉素100 μg/mL)培養(yǎng)。采用免疫熒光法進(jìn)行細(xì)胞鑒定，α-SMA標(biāo)記超過(guò)95%的細(xì)胞為平滑肌細(xì)胞[10]。待平滑肌細(xì)胞長(zhǎng)至致密單層時(shí)進(jìn)行傳代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的2～3代平滑肌細(xì)胞，以無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)12 h后隨機(jī)分為不同濃度VF處理組(50、100、200、300 ng/mL VF干預(yù)24 h)和不同時(shí)間處理組(200 ng/mL VF分別干預(yù)6、12、24、48 h)，同時(shí)設(shè)置不予任何處理的正常對(duì)照組和予溶劑(PBS)處理的溶劑對(duì)照組。

3. 蛋白質(zhì)印跡法：各組平滑肌細(xì)胞以4 ℃預(yù)冷PBS洗滌2～3次，裂解液冰上裂解30 min，4 ℃ 12 000 r/min離心20 min，取上清液，BCA法測(cè)定蛋白濃度。將上清液移至1.5 mL EP管中，加入上樣緩沖液混合均勻，沸水浴10 min變性。蛋白樣品經(jīng)10% SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，5%脫脂牛奶封閉2 h，分別加入p-MLC抗體(1∶500)、t-MLC抗體(1∶1 000)、Cav1.2(α1亞基)抗體(1∶1 000)、GAPDH抗體(1∶1 000)，4 ℃孵育過(guò)夜，TBST洗滌3次，加入HRP標(biāo)記的二抗，37 ℃孵育1 h，ECL顯影，凝膠成像系統(tǒng)拍照、分析。蛋白質(zhì)條帶灰度值以GAPDH為基準(zhǔn)進(jìn)行校正。

4. 平滑肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度測(cè)定：各組平滑肌細(xì)胞加入Fluo-3 AM探針(5 μmol/L)，37 ℃孵育30 min，PBS洗滌2次，再孵育30 min以確保Fluo-3 AM在細(xì)胞內(nèi)完全轉(zhuǎn)變?yōu)镕luo-3。棄去PBS，加入無(wú)鈣 HBSS基礎(chǔ)緩沖液或含鈣 HBSS 緩沖液1 mL，立即于激光共聚焦顯微鏡下觀察Ca2+負(fù)載情況，與Ca2+結(jié)合的Fluo-3激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為530 nm。選擇合適的視野，滴入ACh(1×10-4mol/L)，動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度200 s。以加入ACh前后熒光強(qiáng)度的變化衡量胞內(nèi)游離Ca2+濃度變化[12]。實(shí)驗(yàn)使用不同結(jié)腸平滑肌細(xì)胞重復(fù)3次。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、VF干預(yù)對(duì)正常大鼠結(jié)腸平滑肌肌條收縮的影響

肌條收縮實(shí)驗(yàn)顯示，加入溶劑后的SD大鼠結(jié)腸平滑肌肌條收縮張力與正常情況下無(wú)明顯差異[(1.80±0.29) g對(duì)(1.97±0.45) g,P>0.05]，而經(jīng)200 ng/mL VF干預(yù)的結(jié)腸平滑肌肌條收縮張力較溶劑對(duì)照組明顯減弱，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[(0.87±0.26) g對(duì)(1.80±0.29) g,P<0.05](圖1)，提示VF可抑制結(jié)腸平滑肌收縮。

二、VF干預(yù)對(duì)結(jié)腸平滑肌細(xì)胞內(nèi)MLC磷酸化水平的影響

圖1 VF干預(yù)對(duì)正常大鼠結(jié)腸平滑肌肌條收縮的影響

蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)顯示，正常對(duì)照組和溶劑對(duì)照組p-MLC表達(dá)水平相似(P>0.05)；與溶劑對(duì)照組相比，100、200、300 ng/mL VF干預(yù)24 h均可顯著下調(diào)p-MLC表達(dá)(P均<0.05)，以200 ng/mL組下調(diào)最為明顯(P<0.01)(圖2A)，故200 ng/mL為最適干預(yù)濃度；與溶劑對(duì)照組相比，200 ng/mL VF干預(yù)6、12、24、48 h均可顯著下調(diào)p-MLC表達(dá)(P均<0.05)，以24 h組和48 h組下調(diào)最為明顯(P<0.001)，且兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖2B)，故24 h為最適干預(yù)時(shí)間。

三、VF干預(yù)對(duì)結(jié)腸平滑肌細(xì)胞內(nèi) Ca2+濃度的影響

激光共聚焦顯微鏡觀察顯示，在細(xì)胞外有Ca2+的情況下，ACh刺激后正常對(duì)照組和溶劑對(duì)照組結(jié)腸平滑肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度上升幅度無(wú)明顯差異(P>0.05)，而經(jīng)200 ng/mL VF干預(yù)的細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度上升幅度明顯低于溶劑對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(圖3A、表1)，提示VF可抑制結(jié)腸平滑肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高。在細(xì)胞外無(wú)Ca2+，即模擬阻斷胞外Ca2+內(nèi)流途徑的情況下，ACh刺激后正常對(duì)照組Ca2+濃度上升幅度明顯低于胞外有Ca2+時(shí)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但正常對(duì)照組、溶劑對(duì)照組和VF干預(yù)組間胞內(nèi)Ca2+濃度上升幅度無(wú)明顯差異(P>0.05)(圖3B、表1)，提示VF直接抑制胞內(nèi)Ca2+釋放的作用并不明顯，而可能主要通過(guò)減少胞外Ca2+內(nèi)流抑制結(jié)腸平滑肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高。

1 Da=0.992 1 u

A 細(xì)胞外有Ca2+

B 細(xì)胞外無(wú)Ca2+

圖3 VF干預(yù)對(duì)結(jié)腸平滑肌細(xì)胞內(nèi) Ca2+濃度的影響

組別相對(duì)熒光強(qiáng)度峰值細(xì)胞外有Ca2+細(xì)胞外無(wú)Ca2+正常對(duì)照組1.65±0.171.42±0.05#溶劑對(duì)照組1.76±0.091.35±0.16VF干預(yù)組1.21±0.07**1.38±0.05

**與溶劑對(duì)照組比較，P<0.01；#與同組細(xì)胞外有Ca2+比較，P<0.05(實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次)

四、VF干預(yù)對(duì)結(jié)腸平滑肌細(xì)胞Cav1.2通道表達(dá)的影響

蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)顯示，正常對(duì)照組和溶劑對(duì)照組結(jié)腸平滑肌細(xì)胞Cav1.2(α1亞基)通道表達(dá)水平相似(P>0.05)；VF干預(yù)可呈劑量依賴性地抑制Cav1.2通道表達(dá)(P均<0.05)(圖4)，提示VF抑制胞外Ca2+內(nèi)流的作用與下調(diào)Cav1.2通道表達(dá)有關(guān)。

討 論

VF是一個(gè)由473個(gè)氨基酸殘基組成、相對(duì)分子質(zhì)量為52 kDa的多肽，主要分布于脂肪組織中，同時(shí)也廣泛存在于肝臟、肌肉、腦等部位，在人體中發(fā)揮多種生物學(xué)效應(yīng)[13]。肥胖患者血清VF水平顯著升高，且常伴有結(jié)腸動(dòng)力障礙。既往研究表明VF可抑制子宮、血管平滑肌收縮[7-8]，關(guān)于其是否通過(guò)影響結(jié)腸平滑肌收縮參與肥胖狀態(tài)下的結(jié)腸動(dòng)力障礙，目前尚不清楚。本研究探討了VF對(duì)結(jié)腸平滑肌收縮的影響，發(fā)現(xiàn)其可顯著抑制正常SD大鼠結(jié)腸平滑肌肌條收縮，同時(shí)明顯降低結(jié)腸平滑肌細(xì)胞內(nèi)MLC磷酸化水平，提示VF系直接作用于結(jié)腸平滑肌細(xì)胞，抑制結(jié)腸平滑肌收縮。

目前關(guān)于VF抑制平滑肌收縮機(jī)制的研究很少。Yamawaki等[8]認(rèn)為VF誘導(dǎo)血管平滑肌松弛的作用是內(nèi)皮依賴性的，可能與內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)和Akt磷酸化的改變有關(guān)。平滑肌細(xì)胞收縮與胞內(nèi)Ca2+活動(dòng)密切相關(guān)，ACh與M受體結(jié)合后，通過(guò)G蛋白耦聯(lián)開(kāi)放Ca2+通道，從而促使細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流，同時(shí)也可激活細(xì)胞內(nèi)貯存的Ca2+釋放，兩者共同作用使胞內(nèi)Ca2+濃度升高，進(jìn)而通過(guò)鈣調(diào)蛋白激活肌球蛋白輕鏈激酶，催化MLC磷酸化并引發(fā)平滑肌細(xì)胞收縮[14]。鑒于Ca2+在平滑肌細(xì)胞收縮中起至關(guān)重要的作用，本研究進(jìn)一步探討了VF干預(yù)對(duì)結(jié)腸平滑肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的影響。胞內(nèi)Ca2+主要來(lái)源于胞內(nèi)鈣庫(kù)的釋放和胞外Ca2+內(nèi)流，本研究發(fā)現(xiàn)VF干預(yù)可顯著抑制由ACh引起的結(jié)腸平滑肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高，并發(fā)現(xiàn)該作用主要是通過(guò)減少胞外Ca2+內(nèi)流實(shí)現(xiàn)的。

1 Da=0.992 1 u

胞外Ca2+主要通過(guò)L型鈣通道進(jìn)入平滑肌細(xì)胞，L型鈣通道包括Cav 1.1、1.2、1.3、1.4四種亞型，其中Cav1.2通道是胃腸道Ca2+流入引發(fā)平滑肌收縮的主要途徑[15]。Cav1.2通道由α1、α2、δ、β四個(gè)亞基組成，其中α1亞基是構(gòu)成通道孔道結(jié)構(gòu)的主要跨膜亞單位，是決定通道性質(zhì)的主要成分。本研究發(fā)現(xiàn)VF干預(yù)可劑量依賴性地抑制結(jié)腸平滑肌細(xì)胞Cav1.2通道(α1亞基)表達(dá)，VF可能通過(guò)下調(diào)Cav1.2通道表達(dá)抑制胞外Ca2+內(nèi)流，進(jìn)而引起胞內(nèi)Ca2+濃度下降。

本研究分析了VF對(duì)正常大鼠結(jié)腸平滑肌收縮的作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果尚需在肥胖大鼠模型中進(jìn)一步驗(yàn)證。此外，除對(duì)遠(yuǎn)端結(jié)腸收縮的影響外，VF對(duì)不同腸段平滑肌是否發(fā)揮同樣作用亦有待進(jìn)一步探討。由于實(shí)驗(yàn)條件和技術(shù)的限制而未能進(jìn)行Cav1.2通道活性檢測(cè)，亦為本研究不足之一。在本實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上對(duì)上述問(wèn)題加以完善并作進(jìn)一步研究，將能更好地闡明VF抑制平滑肌收縮的分子機(jī)制。

綜上所述，VF可能通過(guò)下調(diào)結(jié)腸平滑肌細(xì)胞膜Cav1.2通道表達(dá)降低細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度，引起結(jié)腸平滑肌收縮障礙。肥胖患者血清VF水平升高，可能參與了肥胖狀態(tài)下結(jié)腸動(dòng)力障礙的發(fā)生。有學(xué)者指出肥胖患者可通過(guò)控制飲食和規(guī)律運(yùn)動(dòng)降低血清VF水平[16]，而規(guī)律運(yùn)動(dòng)也是胃腸動(dòng)力障礙(如便秘)患者的基礎(chǔ)治療之一，VF水平降低是否在其中發(fā)揮一定效應(yīng)，有待進(jìn)一步驗(yàn)證。