胰島素樣生長(zhǎng)因子-Ⅱ?qū)β殉舶┘?xì)胞SKOV3中MMP-9表達(dá)的調(diào)節(jié)及其機(jī)制分析

楊杰

【摘 要】目的：分析胰島素樣生長(zhǎng)因子-Ⅱ（IGF-Ⅱ）對(duì)卵巢癌細(xì)胞SKOV3中基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）表達(dá)的影響。方法：持續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞48h后加入不同濃度IGF-Ⅱ，繼續(xù)培養(yǎng)18h，然后應(yīng)用RT-PCR法行MMP-9mRNA測(cè)定，應(yīng)用明膠酶譜法對(duì)MMP-9蛋白水平變化情況進(jìn)行半定量測(cè)定。結(jié)果：IGF-Ⅱ能夠?qū)MP-9蛋白分泌產(chǎn)生刺激作用，IGF-Ⅱ濃度不斷增加的情況下其誘導(dǎo)作用也隨之增強(qiáng)，隨著濃度升高，MMP-9分泌量出現(xiàn)下降表現(xiàn)，但是IGF-Ⅱ?qū)MP-9基因表達(dá)水平不會(huì)產(chǎn)生明顯影響。結(jié)論：IGF-Ⅱ能夠?qū)β殉舶┘?xì)胞SKOV3中MMP-9分泌產(chǎn)生刺激作用，在卵巢癌侵襲及轉(zhuǎn)移等過(guò)程中也可發(fā)揮一定的作用。

【關(guān)鍵詞】胰島素樣生長(zhǎng)因子-Ⅱ;卵巢癌細(xì)胞SKOV3;MMP-9表達(dá)的調(diào)節(jié)及其機(jī)制

【中圖分類號(hào)】R737.31【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A【文章編號(hào)】1672-3783（2019）12-03--02

基質(zhì)金屬蛋白酶為Ca2+及Zn2+依賴酶家族，明膠酶表達(dá)與卵巢癌侵襲及轉(zhuǎn)移存在重要關(guān)聯(lián)。特異性金屬蛋白酶抑制因子（TIMPs）可有效阻斷明膠酶活性，腫瘤惡性表型可能與TIMPs、MMP-S及MMP-9等動(dòng)態(tài)平衡失調(diào)可能存在重要關(guān)聯(lián)[1]。此次研究旨在分析IGF-Ⅱ?qū)β殉舶┘?xì)胞SKOV3中MMP-9表達(dá)的影響，如下：

1 資料與方法

1.1 臨床資料

于含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中對(duì)SKOV3腫瘤細(xì)胞株進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，TIMP-1、MMP-9及β-catin引物由上海生物工程公司合成，PCR試劑盒產(chǎn)自SABC公司，AMV反轉(zhuǎn)錄盒產(chǎn)自Peptotech公司，IGF-Ⅱ產(chǎn)自Peptotech公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

應(yīng)用0.25%胰酶消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期卵巢癌細(xì)胞SKOV3中，在24孔板中接種1.5×105/ml濃度細(xì)胞懸液，1ml培養(yǎng)基/孔，每組均有4個(gè)復(fù)孔。在37℃環(huán)境下持續(xù)培育（48h），然后將上清棄除，應(yīng)用無(wú)血清培養(yǎng)基進(jìn)行清洗，然后將不含IGF-Ⅱ、含有10ng/ml、50ng/ml以及100ng/ml等不同濃度的IGF-Ⅱ加入其中，繼續(xù)培養(yǎng)18h。收集細(xì)胞后將細(xì)胞總RNA提出出來(lái)并保存至-80℃冰箱內(nèi)。收集細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)上清液并通過(guò)離心處理將細(xì)胞碎片去除，然后放置于-20℃環(huán)境下保存[2]。

1.2.2 明膠酶譜法

分別配制5%濃縮膠及10%分離膠，將終濃度0.1%明膠加入分離膠中，陽(yáng)性對(duì)照為HT-1080細(xì)胞上清液。應(yīng)用細(xì)胞計(jì)數(shù)法對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的等總蛋白樣品進(jìn)行調(diào)整，然后將之置于樣品槽中電泳，將2.5% TritonX-100溶液中加入凝膠并漂洗2次。在37℃恒溫?fù)u床及100ml明膠酶緩沖液中持續(xù)溫育12-16h，采用0.1%考馬斯亮藍(lán)染色后再實(shí)施脫色處理，對(duì)負(fù)染酶帶進(jìn)行觀察[3]。

1.2.3 RT-PCR法

待IGF-Ⅱ作用于細(xì)胞后應(yīng)用異硫氰酸胍一步法實(shí)施總RNA提取操作，應(yīng)用AMV反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄總RNA，內(nèi)參照為β-actin。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

每組試驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行3次，應(yīng)用Gel-analysis凝膠成像系統(tǒng)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，應(yīng)用單因素方法分析法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，P<0.05組間差異顯著且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IGF-Ⅱ調(diào)節(jié)SKOV3培養(yǎng)上清液中MMP-9蛋白分泌情況分析

研究結(jié)果表明，10ng/ml、50ng/ml以及100ng/ml IGF-Ⅱ均能夠使MMP-9表達(dá)得到增加，將不含IGF-Ⅱ的SKOV3培養(yǎng)液作為對(duì)比組并將MMP-9含量作為1，不同濃度下IGF-ⅡMMP-9增加比例為（47.79±2.51）%、（80.16±2.49）%、（75.01±4.19）%，與對(duì)比組相比可見(jiàn)顯著差異，P<0.05。

2.2 IGF-Ⅱ?qū)MP-9表達(dá)影響分析

IGF-Ⅱ刺激細(xì)胞18h后進(jìn)行細(xì)胞總RNA提取并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄后，應(yīng)用PCP擴(kuò)增TIMP-1m RNA及MMP-9mRNA。不含IGF-Ⅱ刺激SKOV3后的MMP-9mRNA與β-actin mRNA比值為1.4871±0.0414，10ng/ml、50ng/ml以及100ng/ml不同濃度時(shí)比值分別為1.4901±0.0398、1.5049±0.0135、15154±0.0141，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P>0.05。

3 討論

作為促有絲分裂原，IGF-Ⅱ可通過(guò)酪氨酸激酶途徑加快腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化及增殖。此次研究表明，不同濃度IGF-Ⅱ?qū)MP-9mRNA基因表達(dá)誘導(dǎo)作用不明顯，IGF-Ⅱ不會(huì)導(dǎo)致MMP-9基因表達(dá)增加，表明IGF-Ⅱ?qū)β殉舶┘?xì)胞SKOV3MMPs表達(dá)不會(huì)產(chǎn)生促進(jìn)作用，IGF-Ⅱ可通過(guò)轉(zhuǎn)錄后蛋白調(diào)節(jié)增加卵巢癌細(xì)胞MMP-9分泌量[4]。綜上所述，IGF-Ⅱ可刺激卵巢癌細(xì)胞SKOV3中MMP-9分泌，可促進(jìn)卵巢癌腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移。

參考文獻(xiàn)：

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