小鼠支氣管肺泡干細(xì)胞的分離、鑒定與三維培養(yǎng)體系的構(gòu)建

王淑艷，陳以文，于 雪 ，劉丹彤 ，盛春瑞 ，暢洪昇，李麗娜

支氣管肺泡干細(xì)胞(bronchioalveolar stem cells，BASCSs)是一類位于終末細(xì)支氣管和肺泡交界處的肺組織固有的干細(xì)胞，它對(duì)于支氣管和肺泡的修復(fù)與再生具有十分重要的意義[1-2]。肺腺癌起源于BASCSs的惡性轉(zhuǎn)化[3-6]，而在特發(fā)性肺纖維化中，肺組織中的BASCSs數(shù)量下降[7]。BASCSs的研究對(duì)于揭示肺纖維化和肺癌的發(fā)病機(jī)制具有十分重要的意義[8-9]。本研究擬建立BASCSs的純化與體外三維培養(yǎng)體系,為進(jìn)一步研究BASCSs的相關(guān)特性奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 儀器：CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo，美國(guó))；倒置相差顯微鏡(Olympus，日本)；流式細(xì)胞儀(FACSCanto II，美國(guó)BD公司)。試劑：DMEM/F12培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司)，DMEM(高糖)培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)(美國(guó)Gibco公司)，Elastase (美國(guó)Worthington Biochemical公司)，0.2 mmol/L EGTA-1×PBS、1×PBS、1×HBSS+、DNase (200 U/mL)、2.5 g/L胰酶-EDTA、Matrigel (美國(guó)BD公司)，7-Aminoactinomycin D(7-AAD)、CD45-biotin、CD31-biotin、CD34-biotin、APC eFluor 780-streptavidin (美國(guó)eBioscience公司)，Insulin/transferrin/selenium(ITS) (美國(guó)Invitrogen公司)，Sca-1-AlexaFluor 647、EpCAM-PE-Cy7 (美國(guó)Biolegend公司)，SB431542(美國(guó)Ascent Scientific LLC公司)，小鼠肺成纖維細(xì)胞Mlg2908(美國(guó)ATCC)，12孔Transwell小室(美國(guó)Becton公司)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：健康雄性C57BL6小鼠[斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司提供]，體質(zhì)量18～20 g，清潔級(jí)，實(shí)驗(yàn)過(guò)程按照《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》處理實(shí)驗(yàn)動(dòng)物[10]。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 小鼠支氣管干細(xì)胞的體外分離與鑒定[11-15](1)小鼠用100 g/L水合氯醛腹腔麻醉，75%乙醇消毒，在超凈臺(tái)中剪開(kāi)腹腔，腹主動(dòng)脈放血處死。剪開(kāi)胸腔，注意保持肺臟完整。(2)剪開(kāi)下腔靜脈，向右心室內(nèi)注射10 mL的1×PBS，以沖洗肺臟血管。(3)氣管插管，以0.2 mmol/L EGTA-1×PBS 1 mL進(jìn)行肺泡灌洗，重復(fù)4次。小心取出心臟和肺臟，注意保持肺臟完整。(4)經(jīng)氣管向肺內(nèi)注入1 mL Elastase(4 U/mL)，37 ℃孵育5 min。然后經(jīng)氣管向肺內(nèi)注入0.5 mL Elastase(4 U/mL)，37 ℃孵育5 min，重復(fù)4次(共注入肺臟3 mL Elastase溶液)。(5)取出消化好的肺臟，剪取肺葉，置于無(wú)菌細(xì)胞培養(yǎng)皿中，用剪刀剪碎肺組織至2 mm3，再用手術(shù)刀片切碎。(6)加入5 mL濃度為200 U/mL的DNAseⅠ溶液，37 ℃孵育15 min。(7)加入4 ℃的1×HBSS+液10 mL，以吸管反復(fù)吹打組織塊，使其盡量分散，然后過(guò)75 μm細(xì)胞篩，收集細(xì)胞懸液，以20 mL 4 ℃的1×HBSS+液洗滌組織塊，并用研磨棒輕研組織塊，以獲得更多細(xì)胞。(8)2 500 r/min ，4 ℃離心5 min，棄上清液，拍松細(xì)胞。(9)加入1 mL ddH2O，45 s左右加1 mL 2×HBSS+液，再加入4 ℃的1×HBSS+液20 mL。(10)2 500 r/min，4 ℃離心5 min，棄上清液，拍松細(xì)胞。加入4 ℃的1×HBSS+液0.5 mL，以臺(tái)盼藍(lán)液進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。調(diào)細(xì)胞濃度至1×107個(gè)/毫升。(11)向細(xì)胞懸液中加入下列抗體：CD45-biotin (稀釋度1∶200)，CD31-biotin(稀釋度2.5-100)，CD34-biotin(稀釋度6.5∶100)，Sca-1-AlexaFluor 647(稀釋度1∶200)，EpCAM-PE-Cy7(稀釋度1∶200)，4 ℃避光孵育45 min。(12)加入5 mL 4 ℃的1×HBSS+液2 mL，混勻，600 g，4 ℃離心5 min，棄上清液，拍松細(xì)胞。加4 ℃的1×HBSS+液0.5 mL。(13)向細(xì)胞懸液中加入APC eFluor 780-streptavidin 5 μL，4 ℃避光孵育30 min。(14)加入5 mL 4 ℃的1×HBSS+液2 mL，混勻，600 g，4 ℃離心5 min，棄上清液，拍松細(xì)胞。加4 ℃的1×HBSS+液1 mL。(15)加入7-AAD 150 μL，15 min后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)并分選BASCSs(CD31-CD34-CD45-SCA-1+EpCAM+細(xì)胞)。分選后用流式細(xì)胞儀鑒定BASCSs純度。

1.2.2 小鼠支氣管干細(xì)胞的三維培養(yǎng)[12,16-17](1)將小鼠肺成纖維細(xì)胞系Mlg2908，以DMEM(高糖)培養(yǎng)基+100 mL/L FBS，培養(yǎng)于37 ℃、50 mL/L CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中。(2)BASCSs基礎(chǔ)培養(yǎng)基：DMEM/F12培養(yǎng)基，含100 mL/L FBS，10 mL/L ITS液，0.25 mg/mL amphotericin B，100 IU/mL penicillin，100 mg/mL streptomycin和 10 mmol/L SB431542。(3)將Mlg2908細(xì)胞和分選得到的BASCSs按1×103∶1×106的比例混勻，與等體積的Matrigel混勻，加入Transwell小室中，注意勿產(chǎn)生氣泡。(4)將Transwell小室放入細(xì)胞培養(yǎng)板中，將培養(yǎng)板置于37 ℃、50 mL/L CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中5 min，使Matirgel凝固。(5)向培養(yǎng)板下孔中加入BASCSs基礎(chǔ)培養(yǎng)基至液面達(dá)Matrigel上表面。(6)將上述培養(yǎng)體系置于37 ℃、50 mL/L CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，隔日換液。(7)第7天在倒置顯微鏡下拍照，并拼合照片。

2 結(jié)果

2.1 BASCs分離結(jié)果 通過(guò)Elastase酶消化肺組織，每只成年小鼠可得到有核細(xì)胞總數(shù)(1.6～1.8)×107個(gè)，流式細(xì)胞技術(shù)顯示，CD31-CD34-CD45-SCA-1+EpCAM+細(xì)胞約占EpCAM+細(xì)胞的22 %(見(jiàn)圖1)。取部分分選得到的細(xì)胞經(jīng)流式細(xì)胞技術(shù)再次鑒定，CD31-CD34-CD45-SCA-1+EpCAM+細(xì)胞純度大于90%(見(jiàn)圖2)。

2.2 支氣管肺泡干細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果 BASCSs與成纖維細(xì)胞混合培養(yǎng)于Matrigel中，第4日，可見(jiàn)小圓形的克隆形成，周圍圍繞著成纖維細(xì)胞(見(jiàn)圖3)；繼續(xù)培養(yǎng)，克隆體積增大，但數(shù)量逐漸減少，至第8日，大部分克隆直徑可達(dá)50 μm，形態(tài)各異，克隆與其他區(qū)域?qū)Ρ让黠@(見(jiàn)圖4)。

3 討論

2005年由KIM等[6]首先在小鼠肺支氣管肺泡連接區(qū)發(fā)現(xiàn)了BASCSs。BASCSs 是維持Clara 細(xì)胞和肺泡上皮細(xì)胞更新的基礎(chǔ)。目前認(rèn)為，BASCSs表達(dá)分泌珠蛋白家族成員1A1 (SCGB1A1) 和肺泡表面活性蛋白C(SP-C) ，特異細(xì)胞表面標(biāo)志是干細(xì)胞抗原(SCA-1)和上皮細(xì)胞黏附分子(EpCAM)，其細(xì)胞表型為CD31-CD34-CD45-SCA-1+EpCAM+。

由于肺部結(jié)構(gòu)復(fù)雜，且肺上皮細(xì)胞更新率較低，使得BASCSs的分離提取、鑒定與體外研究都面臨著較大的困難。近年來(lái)，隨著細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的日益進(jìn)步，已經(jīng)能夠在體外進(jìn)行BASCSs的三維培養(yǎng)[18]。我們參考國(guó)外同行實(shí)驗(yàn)方法，在建立了小鼠BASCSs的分離、鑒定和三維培養(yǎng)方法的過(guò)程中，獲得了一些心得體會(huì)。

3.1 關(guān)于消化方法的選擇 文獻(xiàn)中報(bào)道可用于分離BASCSs的消化方法主要有以下幾種：collagenase dispase 序貫消化[19]，dispase、collagenase/dispase混合酶序貫消化[20]和Elastase分次注入消化[11]。我們比較了這三種消化方法，結(jié)果以Elastase分次注入消化獲得的有核細(xì)胞數(shù)量最多，所以選用該消化法。

3.2 細(xì)胞分離技巧 BASCSs處于終末細(xì)支氣管和肺泡的交界處，而且數(shù)量較少，用常規(guī)的酶消化法難以制備。其分離的關(guān)鍵在于讓酶能夠充分作用于終末細(xì)支氣管和肺泡的交界處。所以我們采用了分次肺臟酶灌注法。其操作的要點(diǎn)是：(1) 獲得完整肺臟，如果肺臟被膜有破損，酶液漏出，會(huì)導(dǎo)致分離到的BASCSs數(shù)量大大下降。為此，解剖肺臟時(shí)務(wù)必十分小心，特別注意不要讓肋骨殘端刺破肺臟被膜；(2)要盡量切碎組織，組織塊越小越好，這樣才能使更多的BASCSs分散到分離液中，但不能在細(xì)胞篩上研碎組織，吹打組織懸液時(shí)也要溫和操作，否則細(xì)胞容易破碎；(3)所有操作盡量在冰上進(jìn)行，盡可能縮短操作時(shí)間，以保證盡可能多的細(xì)胞存活。

3.3 關(guān)于紅細(xì)胞的去除 細(xì)胞分離的過(guò)程中，不可避免地會(huì)混入紅細(xì)胞。過(guò)多的紅細(xì)胞混入會(huì)影響CD31、CD34、CD45抗體染色結(jié)果。所以，在染色前需要去除紅細(xì)胞。文獻(xiàn)中最常見(jiàn)的去除紅細(xì)胞的辦法是用紅細(xì)胞裂解液[21]。另一種方法是利用紅細(xì)胞對(duì)低滲液的敏感度高于有核細(xì)胞的特點(diǎn)，用雙蒸水短暫處理細(xì)胞懸液，然后加入等體積的兩倍濃度的培養(yǎng)基恢復(fù)滲透壓。通過(guò)比較BASCSs的三維培養(yǎng)結(jié)果，兩種方法差別不大，第二種方法操作更便捷，而且可以避免紅細(xì)胞裂解液中的一些成分對(duì)BASCSs產(chǎn)生影響的可能。所以在實(shí)驗(yàn)中采用了第二種方法。

3.4 細(xì)胞三維培養(yǎng)技巧 BASCSs在三維培養(yǎng)中會(huì)逐步分化，形成克隆。培養(yǎng)的時(shí)間可達(dá)15 d，但最佳觀察時(shí)間在7 d左右。細(xì)胞培養(yǎng)操作要點(diǎn)如下： (1)三維培養(yǎng)的時(shí)間較長(zhǎng)，一定要注意預(yù)防污染，特別是真菌污染，必要時(shí)可以添加真菌抑制劑；(2)在三維培養(yǎng)體系中，肺成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于BASCSs，所以一定要加入成纖維細(xì)胞抑制劑SB431542；(3)將細(xì)胞與Matrigel混合的操作務(wù)必在冰上，否則Matrigel容易凝固，堵塞吸頭；(4)為使Matrigel上表面附近的克隆能夠正常生長(zhǎng)，可以向Matrigel表面滴1滴培養(yǎng)基。培養(yǎng)板下孔中的培養(yǎng)基液面可以略高于Matrigel上表面。

通過(guò)對(duì)相關(guān)文獻(xiàn)的比較與實(shí)驗(yàn)，我們探索出一套適合小鼠BASCSs的分離、鑒定與三維培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)體系。最佳分離方法，即用Elastase分次注入消化，此法獲得的有核細(xì)胞數(shù)量最多。分離要點(diǎn)為：肺臟須完整，不要讓肋骨殘端刺破肺臟被膜；盡量切碎組織，吹打組織懸液時(shí)也要溫和操作；所有操作盡量在冰上進(jìn)行，盡可能縮短操作時(shí)間；用雙蒸水短暫處理細(xì)胞懸液，然后加入等體積的兩倍濃度的培養(yǎng)基恢復(fù)滲透壓，以去除多余的紅細(xì)胞。鑒定方法：用流式細(xì)胞儀檢測(cè)并分選，分選后用流式細(xì)胞儀鑒定BASCSs純度。三維培養(yǎng)時(shí)，要注意預(yù)防污染，特別是真菌污染；要加入成纖維細(xì)胞抑制劑SB431542；務(wù)必在冰上將細(xì)胞與Matrigel混合；可使培養(yǎng)基浸潤(rùn)于Matrigel表面，以使其附近的克隆能夠正常生長(zhǎng)。該方法簡(jiǎn)單高效，能夠?yàn)檫M(jìn)一步研究BASCSs的相關(guān)特性奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。