阿維菌素納米乳劑的研制及其檢測

穆永才 羅天瑤

摘要：為了研制成阿維菌素納米乳制劑，篩選出由油酸乙酯、吐溫80、1，2-丙二醇、純水組成的空白納米乳體系。經(jīng)溶解試驗，該體系對阿維菌素的溶解性良好，可達(dá)1.6%以上。選取1%的阿維菌素納米乳劑，進(jìn)行質(zhì)量和安全性評價，結(jié)果表明：這種阿維菌素納米乳劑理化指標(biāo)合格，無刺激性、無過敏性、無溶血性，穩(wěn)定，安全可靠。

關(guān)鍵詞：納米乳;阿維菌素;新劑型;研制;檢測

中圖分類號：S859.5 ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：2095-9737（2019）03-0001-04

阿維菌素是大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，具有結(jié)構(gòu)新穎、農(nóng)畜兩用的特點(diǎn)。目前，在市場上銷售的阿維菌素原藥是以abamectin為主要?dú)⑾x成分，并以B1a的含量來標(biāo)定[1]。這種抗生素在獸醫(yī)臨床上主要用于畜禽的消化道線蟲和外寄生蟲的驅(qū)殺。常用的劑型有粉劑和注射劑等。這些劑型一度滿足防治畜禽相應(yīng)寄生蟲的需求，但也存在著持效期短、需多次給藥、藥效不穩(wěn)定等缺點(diǎn)。納米乳劑是由油相、水相、乳化劑和助乳化劑組成的相對穩(wěn)定體系，制成藥劑具有生物活性高、緩釋、刺激性小、毒性低、穩(wěn)定的特點(diǎn)[2]。為了克服現(xiàn)有阿維菌素制劑的諸多不足，筆者研制成一種阿維菌素納米乳制劑，并對其特性進(jìn)行測定，現(xiàn)報道如下。

1 材料

1.1 儀器設(shè)備

激光粒度儀（winner802型），由濟(jì)南微納顆粒儀器股份有限公司生產(chǎn);運(yùn)動黏度自動測定儀（ZTND2000型），由上海平軒科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn);電導(dǎo)率儀（DDSJ-318型），由上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司生產(chǎn);恒溫磁力攪拌器（S10-2型），由上海司樂儀器有限公司出品;ZYP-320偏光顯微鏡，上海兆儀光電有限公司生產(chǎn)，HT7700透射電鏡，日本日立公司生產(chǎn);MiniSpan Plus微型高速離心機(jī)，杭州奧盛儀器有限公司生產(chǎn);WAY-2W阿貝折射儀，上海精科實業(yè)有限公司生產(chǎn);LC-20AT液相色譜儀，日本島津公司生產(chǎn);FAT2104電子天平，常州萬得天平儀器有限公司生產(chǎn)。BR120-4固液比重計，百榮精密儀器有限公司生產(chǎn)。

1.2 主要試劑

阿維菌素原藥（B1≥90%），大慶志飛生物化工有限公司生產(chǎn);油酸乙酯、乙酸乙酯，江西阿爾法高科藥業(yè)有限公司生產(chǎn);聚氧乙烯氫化蓖麻油（Cremophor RH40），德國巴斯夫公司（BASF）生產(chǎn);Transcutol.V（二乙二醇單乙基醚獸用型），法國嘉法獅公司（Gattefossé）生產(chǎn);吐溫80、1，2-丙二醇、正丁醇、無水乙醇，天津富宇精細(xì)化工有限公司生產(chǎn);色譜甲醇，購自天津賽孚瑞科技有限公司;阿維菌素色譜標(biāo)準(zhǔn)樣品，沈陽化工研究院生產(chǎn)。純化水，檢驗研究室自制。

1.3 實驗動物

健康狀況良好的成年大耳白兔4只，雌雄各半，購于富?？h華美養(yǎng)兔場;體重50 kg綿羊20只購自于齊齊哈市北郊養(yǎng)羊戶。這些實驗動物均為舍飼，自由采食，自由飲水，實驗前進(jìn)行臨床健康觀察。

2 方法

2.1 阿維菌素納米乳劑的制備

2.1.1 增溶體系的選擇

以各組分均為醫(yī)藥級產(chǎn)品、對阿維菌素增溶能力強(qiáng)、形成穩(wěn)定的納米乳劑為標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行增溶體系的選擇。預(yù)選的體系有油酸乙酯、水、聚氧乙烯氫化蓖麻油、二乙二醇單乙基醚體系[2]，油酸乙酯、水、吐溫80、1，2-丙二醇體系[3]，乙酸乙酯、水、吐溫80、無水乙醇體系[4]，油酸乙酯、水、吐溫80、正丁醇體系[5]。

篩選方法采取2種方式。方式1是將每個預(yù)選體系的油相、乳化劑、助乳化劑及主藥按一定質(zhì)量依次混合后，再逐滴加入水相，觀察體系狀態(tài)。油相與總表面活性劑的比例分別是1∶9;1∶8;1∶7;1∶6;1∶5;1∶4。乳化劑與助乳化劑的比例（Kim值）分別為3∶1;2.5∶1;2∶1;1∶1。方式2是預(yù)先將油相與主藥混合制成油藥溶液?；旌系拇涡蚴侨榛瘎⒅榛瘎?、油藥溶液。逐滴加水，觀察體系狀態(tài)。油藥與總表面活性的比例和乳化劑與助乳化劑的比例（Kim值）同方式1。采用以上兩種方式在4種體系中篩選出油酸乙酯、水、吐溫80、1，2-丙二醇體系為最佳增溶體系。經(jīng)反復(fù)多次試驗，形成濃度高達(dá)1.6%以上阿維菌素納米乳。

2.1.2 1%阿維菌素納米乳的制備

稱取21.50%的乳化劑于制藥燒杯底部，再稱取8.68%的助乳化劑置于乳化劑之上，然后再稱取3.77%的油藥溶液置于助乳比劑之上。將轉(zhuǎn)子和溫度探頭置于制藥燒杯內(nèi)，設(shè)定轉(zhuǎn)數(shù)為120 r/min，溫度為35℃，開啟磁力攪拌器開關(guān)。邊攪拌，邊逐滴加入純化水，滴水速度控制在60滴/min，當(dāng)加入水量達(dá)到66.05%時，關(guān)閉滴定管閥門，停止滴水，繼續(xù)攪拌至溶液透明為止。

將上述藥液過濾除菌后，分裝于高溫干燥滅菌的青霉素瓶中，用于各項檢測之用。

2.2 納米乳劑的檢測

2.2.1 理化性質(zhì)的檢測

2.2.1.1 粒度檢測

使用光相關(guān)納米粒度儀進(jìn)行檢測。測試條件：分散介質(zhì)為水，折射率為1.333，粘度為8.904E-04Pa.S，測試溫度為25℃，延遲單位時間是25μs。

2.2.1.2 納米乳類型檢測

采取如下兩種方法[6]：①稀釋法，將少量的乳狀液分別加入油和水中輕輕搖動，看乳狀液在油中還是在水中容易分散。當(dāng)乳狀液加入油中容易分散，則油為連續(xù)相，說明乳狀液為W/O型;當(dāng)乳狀液加入水中容易分散時，則水為連續(xù)相，乳狀液為O/W型。②濾紙法，將一滴乳狀液滴于濾紙的中心，如果乳狀液為O/W，即水為連續(xù)相時，水容易在濾紙上通過毛細(xì)作用而向外擴(kuò)散，最終在濾紙的中心剩余1個小油點(diǎn)。但如果是W/O型乳狀液時，乳狀液幾乎在濾紙上不擴(kuò)散。

2.2.1.3 粘度檢測

采用運(yùn)動粘度測定儀進(jìn)行檢測。測試前參數(shù)設(shè)置：樣品號碼：0001#，當(dāng)前粘度計1#，1#粘度計系數(shù)為0.8，預(yù)置溫度25℃，溫度微調(diào)-0.5℃，打開自動控溫，開啟打印，設(shè)置好日期和時間。將藥劑按要求吸入毛細(xì)管粘度計內(nèi)，并將毛細(xì)管粘度計置于恒溫槽中，即可檢測，每樣品檢測3次，取其均值。

2.2.1.4 密度檢測

選用固液比重計進(jìn)行檢測。用100 g標(biāo)碼進(jìn)行校正，設(shè)定常用參數(shù)，選擇測量模式，按照液體比重測量的操作方法進(jìn)行。

2.2.1.5 電導(dǎo)率檢測

開機(jī)后在儀器的起始狀態(tài)進(jìn)行設(shè)置操作。在測量模式中勾選電導(dǎo)率選項和連續(xù)測量模式;在系統(tǒng)設(shè)置中進(jìn)行操作編號;在設(shè)置電導(dǎo)常數(shù)中設(shè)置與電導(dǎo)電極上標(biāo)注的同樣的電導(dǎo)常數(shù)。按要求安裝好電導(dǎo)電極以及溫度傳感器，準(zhǔn)備好待測溶液后，即可開始測量。

2.2.1.6 雙折射現(xiàn)象檢測

采取偏光顯微鏡法檢測。經(jīng)過調(diào)節(jié)亮度、調(diào)焦、調(diào)整載物臺和物鏡中心重合、孔徑光闌中心調(diào)節(jié)、正交偏光觀察等幾個步聚，觀察被檢樣品有無雙折射現(xiàn)象的發(fā)生。

2.2.1.7 pH值檢測

采用pH計法測定。準(zhǔn)備：按使用說明進(jìn)行相關(guān)準(zhǔn)備，儀器標(biāo)定：打開電源開關(guān)，儀器進(jìn)入pH測量狀態(tài)。調(diào)節(jié)溫度使溫度顯示值和溶液溫度一致。按“標(biāo)定”鍵，任選兩種標(biāo)定液進(jìn)行標(biāo)定。測量：用蒸餾水及被測溶液清洗電極后即可對被測液進(jìn)行測量。

2.2.1.8 穩(wěn)定性檢測

采取了恒溫儲存試驗。即將藥品試樣分別儲存在高溫（40℃）和常溫（20～25℃）的環(huán)境中，隨時觀察藥樣的外觀變化，并按一定時間間隔進(jìn)行藥樣粒度和主藥含量檢測。

2.2.2 阿維菌素含量的測定

采用液相色譜分析方法。色譜條件：高效液相色譜儀（具有紫外可變波長檢測器）;色譜柱：150 mm×3.9 mm（id）不銹鋼柱，內(nèi)裝Nova-PakC18、5 μs填充物;流動相：甲醇+乙腈+水=38+38+24，經(jīng)過濾、脫氣處理;流量控制在1.0 mL/min;柱溫：置室溫下，其溫差變化不能大于2℃;檢測波長：245 nm;進(jìn)樣體積：5 μL;保留時間：B1a 15.6 min，B1b 11.3 min。

2.2.3 納米乳劑的溶血試驗

按有關(guān)文獻(xiàn)[7]介紹的方法進(jìn)行。首先制成2%兔紅細(xì)胞懸液。再用生理鹽水對1%阿維菌素納米乳制劑進(jìn)行稀釋（稀釋比為1∶3）后當(dāng)作供試藥液。然后取7支10 mL試管，分別編號為1～7號，將1～5號管作為試樣品管，將6號管作為陰性對照管，將7號管作為陽性對照管。各試管加樣種類、次序及加樣量見表1。

按上表依次加樣，混勻后置37℃恒溫箱中溫育。記錄0.25 h，0.5 h，1 h，2 h，3 h的結(jié)果。當(dāng)陰性對照管（凝聚和無溶血發(fā)生）和陽性對照管（有溶血）條件成立的情況下，在3 h內(nèi)，如果試樣管中的溶液不發(fā)生凝聚和溶血，則受試藥液可以注射使用;若試樣管中的溶液發(fā)生凝聚和（或）溶血，則受試藥液不宜注射使用。

2.2.4 納米乳劑對家兔的刺激性試驗

遵循有關(guān)文獻(xiàn)[8]進(jìn)行。利用白兔背部皮膚脫毛處理后，分成左右、前后四區(qū)。將生理鹽水和伊維菌素微乳制劑一次性涂抹于指定的皮膚區(qū)域，劑量均為0.5 mL.觀察皮膚接觸受試物后是否引起紅腫、充血、滲出等局部反應(yīng)，根據(jù)制定的“皮膚刺激反應(yīng)評分標(biāo)準(zhǔn)”和“皮膚刺激強(qiáng)度評價標(biāo)準(zhǔn)”評定藥物對家兔皮膚的刺激性。同時將受試物滴于家兔眼結(jié)膜囊內(nèi)，觀察虹膜、角膜和結(jié)膜是否出現(xiàn)渾濁、充血、水腫等局部反應(yīng)，依據(jù)“眼刺激試驗評分標(biāo)準(zhǔn)”和“眼刺激程度評價標(biāo)準(zhǔn)”評價藥物對家兔眼睛的刺激性。

2.2.5 對靶動物綿羊的安全性試驗

將20只綿羊隨機(jī)分成4組，設(shè)1倍量、3倍量、5倍量、空白對照、處理，每組的給藥劑量分別為0 mg/kg、0.2 mg/kg、0.6 mg/kg、1.0 mg/kg體重肌注給藥，二次用藥24 h后，于靜脈采血進(jìn)行血液生化和血液學(xué)的檢測，以及病理學(xué)檢查。整個試驗期間每天定時觀察試驗羊的精神、飲食和臨床癥狀的改變并記錄死亡情況。

3 試驗結(jié)果

3.1 理化性質(zhì)檢測結(jié)果（見表2）

3.2 穩(wěn)定性檢測結(jié)果（見表3）

3.3 溶血試驗結(jié)果

在試驗觀察期內(nèi)，陽性對照組可見完全溶血現(xiàn)象，其他各組未見溶血和凝集現(xiàn)象的發(fā)生，說明1%阿維菌素納米乳注射液可供注射使用。

3.4 刺激性試驗結(jié)果

破損皮膚試驗區(qū)24 h后已無刺激性，完整試驗區(qū)30 min后無刺激性。對照組破損皮膚試驗區(qū)在去除受試物30 min后對皮膚無刺激性。根據(jù)評分標(biāo)準(zhǔn)將該注射液對皮膚的刺激性定為無刺激。

受試兔雙眼角膜、結(jié)膜、虹膜均正常。該注射液對家兔的眼部無明顯影響。依據(jù)眼的刺激反應(yīng)評分統(tǒng)計結(jié)果判定該制劑對家兔眼睛無刺激性。

3.5 安全性試驗結(jié)果

整個試驗期內(nèi)，試驗、對照各組羊健康狀況良好，精神、飲水、采食未見異常。無中毒和死亡的現(xiàn)象發(fā)生。

血液、生化及病理學(xué)檢測結(jié)果表明，1%阿維菌素納米乳注射液對羊的血細(xì)胞生成無不良影響，對羊的肝、腎功能和各物質(zhì)代謝均無不良影響，未發(fā)現(xiàn)各組羊的實質(zhì)器官有異常和可疑的病變。

4 討論與分析

阿維菌素已廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)和畜牧業(yè)病蟲害的防治。在獸醫(yī)臨床上主要用于畜禽消化道線蟲和體外寄生蟲的驅(qū)殺。對于如此重要的抗寄生蟲病藥物新劑型的研究和探索一直是業(yè)內(nèi)人士的熱點(diǎn)課題。目前的研究和生產(chǎn)實踐表明，用于防治植物病蟲害的阿維菌素納米乳劑已有市售。在防治畜禽寄生蟲病方面，獸用伊維菌素納米乳的研制已有報道[2]，但獸用阿維菌素納米乳劑尚未見報道。伊維菌素與阿維菌素，雖為同類藥物，結(jié)構(gòu)相似，藥效相同，但阿維菌素的價格較伊維菌素低。本項研究的難點(diǎn)主要在于對阿維菌素溶解性好、穩(wěn)定、毒性低或無毒的納米乳基質(zhì)的研制及生產(chǎn)工藝的建立。

在研制過程中，結(jié)合國內(nèi)外已有報導(dǎo)和多年從事納米乳獸藥研究經(jīng)驗，在四種醫(yī)用納米乳基質(zhì)中，篩選出油酸乙酯、吐溫80、1，2-丙二醇、純水為組分的阿維菌素納米乳增溶體系。經(jīng)特殊工藝處理后，對阿維菌素的增溶濃度可達(dá)到1.6%以上，此濃度高于常規(guī)注射劑（1%），加之納米乳劑具有微量高效的特性，因此完全滿足臨床需求。研制的另一個難點(diǎn)是納米乳劑主藥濃度的測定。為了使B1a和B1b與雜質(zhì)完全分離，項目組經(jīng)多次試驗發(fā)現(xiàn)以38%乙腈、38%甲醇與24%純水（均為體積百分比）組成流動相，可以解決這一問題。這種定量方法簡便可行，準(zhǔn)確度和精密度較好。

按照《中國獸藥典》[9]、《化學(xué)藥物刺激性、過敏性和溶血性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》[10]，參考有關(guān)文獻(xiàn)方法進(jìn)行了1%阿維菌素納米乳劑理化性質(zhì)、安全性以及刺激性、過敏性和溶血性的試驗。結(jié)果表明，該制劑穩(wěn)定（穩(wěn)定期在2年以上），理化指標(biāo)符合相關(guān)規(guī)定，對靶動物安全，無刺激性、過敏性和溶血性。

上述試驗結(jié)果為該制劑的臨床應(yīng)用打下了良好的基礎(chǔ)。

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