壯骨止痛方水提B部位對(duì)去勢(shì)雌鼠骨質(zhì)疏松的療效及機(jī)理研究

甘國興，莫新民△，李勁平，張國民，范娟娟，劉仕杰

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410007;2.中南大學(xué)藥學(xué)院，湖南 長沙 410013)

原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥(Osteoporosis OP)是一種全身性骨骼疾病，已成為影響老年人身體健康和生活質(zhì)量的嚴(yán)重社會(huì)問題。壯骨止痛膠囊是由壯骨止痛方依據(jù)中醫(yī)理論結(jié)合現(xiàn)代藥理研究研制而成，具有補(bǔ)益肝腎、壯骨止痛功效，能有效治療骨質(zhì)疏松癥，已獲得國家新藥證書(國藥證字Z20050125)。為明確其藥效成分及其作用機(jī)理，我們課題組用不同溶劑從壯骨止痛方藥中提取了6個(gè)部位，現(xiàn)在將水提B部位的療效及其可能的作用機(jī)制報(bào)告如下。

1 材料

1.1 動(dòng)物與飼料

3月齡SD雌性大鼠75只，體重250g左右，SPF級(jí)，廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)SCXK(粵)2008－0002。飼料由標(biāo)準(zhǔn)普通飼料湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 藥品與試劑

壯骨止痛方水提B部位及壯骨止痛方(原材料購自九芝堂，由中南大學(xué)藥學(xué)院天然藥物化學(xué)系制備)、雌激素(HY-032)、PTH(HY-105)、CT(HY-085)、BGP(HY-084)放免試劑盒(北京華英生物技術(shù)研究所)。

1.3 主要儀器

Unigamma骨密度儀(意大利)、JY3002型電子天平、低溫離心機(jī)、LEICA DM LB2型雙目顯微鏡、超低溫冰箱、萬能力學(xué)儀、MIAS醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)、Motic B5顯微攝像系統(tǒng)、GC-1500 r放射免疫計(jì)數(shù)器、JEOL-1230型透射電鏡(日產(chǎn))等。

2 方法

2.1 分組及造模方法[1]

采用國內(nèi)外公認(rèn)的雌性大鼠去卵巢3個(gè)月造成絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥病理模型。大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，隨機(jī)分出空白組和假手術(shù)組各15只，除空白組外，其余的用2%戊巴比妥鈉(0.2ml/100g體重)麻醉，在無菌條件下從距離大鼠胸腰椎外側(cè)1cm處縱向切開皮膚及兩側(cè)肌肉，摘除雙側(cè)卵巢，假手術(shù)組僅在卵巢周圍切除相應(yīng)重量的脂肪，分兩層縫合傷口并用生理鹽水擦洗干凈血跡，術(shù)后連續(xù)3d大腿肌肉注射青霉素，每只大鼠4萬u/d，術(shù)后5d拆線，飼養(yǎng)于室溫23℃ ～25℃、相對(duì)濕度40% ～60%的清潔環(huán)境中，自由攝食和攝水。術(shù)后1周將模型大鼠隨機(jī)分為模型組、壯骨止痛方組、水提B部位組，加上假手術(shù)組和空白組共5組，每組15只。

2.2 給藥方法

各組均從第5天拆線后開始給藥，每天灌胃1次，連續(xù)13周。空白組、假手術(shù)組和模型組每天灌胃相應(yīng)體積冷開水和油中王牌植物油，其余各組開始灌胃相應(yīng)藥物(水相 0.6 ml/100g·d，油相0.4ml/100g·d)。劑量按各藥效相關(guān)物質(zhì)相對(duì)壯骨止痛方的得率及人鼠體表面積折算確定。

2.3 指標(biāo)檢測(cè)

連續(xù)灌胃13周，每10d稱1次體重，13周之后所有大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉(0.2ml/100g)麻醉后，腹部切口分離腹主動(dòng)脈，用負(fù)壓采血管采血8ml，靜置 2h～3h，3000r/min離心 15min后分離血清，以備放射免疫法檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)。剖取左右后肢完整的股骨、脛骨及第2～4腰椎，去除上面附著的肌肉組織，保留骨膜并做相關(guān)檢查。

2.3.1 子宮稱重 打開腹腔，從子宮與陰道分界處剪斷，仔細(xì)分離出雙側(cè)子宮，除掉周圍的脂肪組織，用分析天平稱取濕重。

2.3.2 檢測(cè)放免法檢測(cè)雌激素、PTH、CT、BGP。

主要從植物群落的外貌特征、景觀結(jié)構(gòu)、空間特征、游憩利用現(xiàn)狀4個(gè)方面對(duì)樣方進(jìn)行調(diào)研。詳細(xì)記錄各個(gè)樣方地理位置、植物種類、數(shù)量、特征數(shù)據(jù)(高度、冠幅、胸徑、多蓋度等)、生境條件等。同時(shí)根據(jù)植株干、枝、葉的生理性狀評(píng)估樹木的生長勢(shì),描繪樣地平面圖,并拍攝照片以作為其平面分布和豎向景觀的有效補(bǔ)充。

2.3.3 骨密度檢測(cè) 取右側(cè)股骨、T2～T4腰椎骨用濕紗布包裹，送湖南中醫(yī)藥大學(xué)附一院骨密度室檢測(cè)骨密度。

2.3.4 骨生物力學(xué)檢測(cè) 取左側(cè)脛骨分干凈肌肉，用濕紗布包裹送國防科技大學(xué)物理系檢測(cè)骨最大彈性應(yīng)力、最大抗彎強(qiáng)度。

2.3.5 骨組織病理學(xué)檢測(cè) 取左側(cè)股骨，用4%的多聚甲醛固定48h，然后用5%的硝酸脫鈣1周，送湖南中醫(yī)藥大學(xué)病理檢驗(yàn)中心檢測(cè)股骨頭區(qū)域的病理組織形態(tài)學(xué)變化，測(cè)量股骨頭平均骨小梁密度。

2.3.6 透射電鏡檢測(cè) 取右側(cè)脛骨分離肌肉，用2.5%的戊二醛固定24h，然后用5%的硝酸脫鈣1周送中南大學(xué)電鏡室檢測(cè)。

2.4 統(tǒng)計(jì)方法

數(shù)據(jù)處理采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗(yàn)作為顯著性分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 對(duì)去勢(shì)骨質(zhì)疏松模型雌鼠子宮濕重影響

表1顯示，與模型組比較，水提 B部位組雌鼠子宮濕重有所增加，但無差異性(P>0.05)。

3.2 對(duì)去卵巢雌性骨質(zhì)疏松模型大鼠骨密度的影響

表2 壯骨止痛方水提B部位對(duì)去勢(shì)骨質(zhì)疏松模型雌鼠骨密度的影響

3.3 對(duì)去卵巢雌性骨質(zhì)疏松癥大鼠左后支脛骨生物力學(xué)的影響

表3顯示，與模型組相比，水提B部位能夠顯著提高去勢(shì)骨質(zhì)疏松模型雌鼠左后肢脛骨最大應(yīng)力和最大抗彎強(qiáng)度(P<0.05)，提高骨生物力學(xué)性能。

表3 壯骨止痛方水提B部位對(duì)去勢(shì)骨質(zhì)疏松模型雌鼠左后肢脛骨生物力學(xué)的影響

3.4 對(duì)去卵巢雌性骨質(zhì)疏松癥大鼠血清E2、BGP、PTH、CT 的影響

表4顯示，與模型組比較，壯骨止痛方水提 B部位能夠顯著降低去勢(shì)骨質(zhì)疏松模型雌鼠血清CT(P<0.05)，有升高去勢(shì)骨質(zhì)疏松模型雌鼠血E2的趨勢(shì)，但無差異性(P>0.05);血清 BGP、PTH比模型組略高。

表4 壯骨止痛方水提B部位對(duì)去勢(shì)骨質(zhì)疏松模型雌鼠血清E2、BGP、PTH、CT的影響

3.5 對(duì)去勢(shì)骨質(zhì)疏松模型雌鼠左股骨組織形態(tài)學(xué)的影響

附圖顯示，空白組、假手術(shù)組動(dòng)物骨小梁分布均勻，股骨頸梁髓比正常。去卵巢模型組骨小梁稀疏、破壞，骨髓腔擴(kuò)大，梁髓比明顯下降。壯骨止痛方組和水提B部位組骨小梁密度分布比較均勻，梁髓比基本恢復(fù)正常，鏡下可見成骨細(xì)胞。

3.5.1 表5顯示，在10×40倍鏡下，通過顯微形態(tài)學(xué)計(jì)算機(jī)網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)測(cè)量股骨頭骨小梁密度，每張切片取5個(gè)視野，取其平均值。

表5 壯骨止痛方水提B部位對(duì)去勢(shì)骨質(zhì)疏松模型雌鼠左股骨骨小梁密度的影響

表5提示，壯骨止痛方水提B部位能夠顯著提高去勢(shì)骨質(zhì)疏松模型雌鼠左股骨骨小梁密度，與模型組比較有非常顯著的差異性(P<0.01)，療效不及壯骨止痛方。

3.5.2 電鏡檢查 JEOL-1230型透射電鏡觀察、照片。

結(jié)果分析，假手術(shù)組骨間質(zhì)致密，骨細(xì)胞內(nèi)部分線粒體存在空泡變性，骨陷窩較小。模型組大部分骨細(xì)胞胞核及胞漿濃縮明顯，骨細(xì)胞的凸起明顯減少，骨陷窩橢圓形。給藥后，水提B部位組骨細(xì)胞核較正常，胞漿濃縮明顯，骨細(xì)胞的凸起明顯減少，骨陷窩呈扁橢圓形。壯骨止痛方組骨細(xì)胞較正常，骨細(xì)胞凸起無明顯改變，骨陷窩明顯縮小呈扁橢圓形。

4 討論

壯骨止痛方水提B部位是淫羊藿等的水提取物。現(xiàn)代藥理研究證明，淫羊藿有增強(qiáng)下丘腦-垂體-性腺軸及腎上腺皮質(zhì)軸、胸腺軸等內(nèi)分泌系統(tǒng)的激素樣作用，能促進(jìn)骨髓細(xì)胞DNA合成，促進(jìn)組織蛋白質(zhì)合成及促進(jìn)骨細(xì)胞生長等作用，對(duì)破骨細(xì)胞有直接的抑制作用，因而能對(duì)抗動(dòng)物去卵巢、去睪丸及長期大劑量服用腎上腺皮質(zhì)激素所引起的骨質(zhì)疏松癥。有促進(jìn)骨形成防止骨丟失，升高骨密度，改善骨生物力學(xué)性能和骨小梁形態(tài)結(jié)構(gòu)的作用。有文獻(xiàn)報(bào)道，淫羊藿水提液能夠促進(jìn)骨髓基質(zhì)中的成骨細(xì)胞表達(dá) TGF-B1，并抑制 TNF-α的表達(dá)，間接抑制骨吸收[2];可抑制骨髓細(xì)胞誘導(dǎo)破骨細(xì)胞的形成，從而減少破骨細(xì)胞的產(chǎn)生。淫羊藿可能通過下調(diào)這些骨調(diào)節(jié)相關(guān)細(xì)胞因子，抑制破骨細(xì)胞的形成，而淫羊藿同時(shí)還能夠直接促進(jìn)破骨細(xì)胞的凋亡[3]。在淫羊藿作用下，破骨細(xì)胞的生成、分化成熟受阻及凋亡增加，最終阻止了由雌激素水平下降引起的骨代謝失衡，維持了骨質(zhì)中的骨量和骨小梁的形態(tài)，防止了骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生[4]。

本實(shí)驗(yàn)中，與假手術(shù)組和空白組比較，模型鼠股骨和腰椎骨密度都明顯下降，差異有顯著或非常顯著意義(P<0.05或 P<0.01);血清 E2含量明顯下降(P<0.01);骨小梁稀疏、破壞，骨髓腔擴(kuò)大，梁髓比明顯下降，說明絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥病理模型復(fù)制成功。給藥后與模型組比較，水提B部位組骨密度增加非常明顯，骨生物力學(xué)性能提高，骨小梁密度分布比較均勻，梁髓比基本恢復(fù)正常，鏡下可見成骨細(xì)胞，說明壯骨止痛方水提B部位對(duì)骨質(zhì)疏松癥有良好療效。與空白組和假手術(shù)組比較，模型組血清BGP、PTH均明顯升高(P<0.01)，血清CT也有升高的趨勢(shì)，血清E2含量明顯下降(P<0.01)，表明去勢(shì)后模型鼠雌激素缺乏或不足，骨轉(zhuǎn)換加快，導(dǎo)致高轉(zhuǎn)換型骨質(zhì)疏松發(fā)生。與模型組比較，水提B部位能夠顯著降低去勢(shì)骨質(zhì)疏松模型雌鼠血清CT(P<0.05)，說明水提B部位能夠降低骨轉(zhuǎn)換，有升高去勢(shì)骨質(zhì)疏松模型雌鼠血清E2的趨勢(shì)，但無差異性(P>0.05)。BGP是成骨細(xì)胞的特異性產(chǎn)物。壯骨止痛方水提B部位組血清BGP、PTH含量高于模型組，血清CT含量明顯降低，提示壯骨止痛方水提B部位能提高成骨細(xì)胞活性，促進(jìn)骨形成，抑制骨吸收。

綜上所述，壯骨止痛方水提B部位能顯著增加模型鼠骨密度，提高模型鼠骨生物力學(xué)性能，逆轉(zhuǎn)骨質(zhì)疏松癥的病理形態(tài)學(xué)改變，有效治療骨質(zhì)疏松癥。其機(jī)理可能是增強(qiáng)下丘腦-垂體-性腺軸及腎上腺皮質(zhì)軸、胸腺軸等內(nèi)分泌系統(tǒng)的激素樣作用，促進(jìn)骨髓細(xì)胞DNA合成和組織蛋白質(zhì)合成，提高成骨細(xì)胞活性，促進(jìn)骨形成;促進(jìn)骨髓基質(zhì)中的成骨細(xì)胞表達(dá)TGF-B1，并抑制 TNF-α的表達(dá)，間接抑制骨吸收。抑制骨髓細(xì)胞誘導(dǎo)破骨細(xì)胞的形成，從而減少破骨細(xì)胞的產(chǎn)生，通過下調(diào)這些骨調(diào)節(jié)相關(guān)細(xì)胞因子，抑制破骨細(xì)胞的形成，同時(shí)直接促進(jìn)破骨細(xì)胞的凋亡。

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