鎘對河蟹抗氧化酶活性的影響

趙亞玲 藺翠翠

摘 要：本文采用生態(tài)學(xué)單因子梯度試驗(yàn)方法，將河蟹暴露于不同Cd2+濃度（0、0.5、1.15、3.17毫克/升）96小時，研究鎘對河蟹肝胰腺和鰓的超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）和谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶（GST）酶活性的影響和損傷，旨在探明重金屬鎘對抗氧化酶系統(tǒng)的影響。結(jié)果顯示：河蟹體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)對鎘脅迫較為敏感，其抗氧化酶活性的變化可以靈敏地反應(yīng)鎘的脅迫程度和毒性，隨著鎘脅迫時間和濃度的增加，三種酶的活性呈現(xiàn)出先被激活后被抑制的規(guī)律。

關(guān)鍵詞：鎘;河蟹;抗氧化酶

河蟹，學(xué)名中華絨螯蟹，屬軟甲綱（Malacostraca），十足目（Decapoda），弓蟹科（Varunidae），絨螯蟹屬，集中分布于我國北至遼寧，南至福建閩江口，是我國特有的大型淡水蟹類。河蟹因其個大體肥、膏滿黃多、肉質(zhì)鮮嫩而深受我國廣大消費(fèi)者的青睞。肝胰腺和鰓是河蟹的兩大重要器官，肝胰腺是河蟹體內(nèi)重要的解毒器官，發(fā)揮著降低和消除外源有害物質(zhì)的作用;鰓是河蟹體內(nèi)重要的呼吸器官，發(fā)揮著調(diào)節(jié)體內(nèi)滲透壓和平衡離子的作用。酶是生物體中一類生物大分子的總稱，在呼吸、運(yùn)動、消化、吸收、代謝、生殖等所有生命活動中起著舉足輕重的作用，酶活的變化能快速且靈敏的反映環(huán)境脅迫對生物體的影響。

鎘是一種藍(lán)白色金屬，由于其密度大于4.5克/立方厘米，被歸類為重金屬。重金屬鎘是當(dāng)今世界上三大重點(diǎn)研究的毒素之一。早在1984年，鎘就位列聯(lián)合國環(huán)境規(guī)劃署提出的12種具有全球性意義的危害化學(xué)物質(zhì)之首。國際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）將其歸為人類和實(shí)驗(yàn)動物中肺癌和前列腺癌的確認(rèn)致癌物。大部分鎘化物可溶于水，通過呼吸、消化、體表滲透等途徑被吸收到水生生物體內(nèi)，引起水生生物的急慢性反應(yīng)。進(jìn)入水生生物體內(nèi)的鎘離子，通過誘導(dǎo)作用使水生生物產(chǎn)生大量氧自由基（ROS），導(dǎo)致機(jī)體受損。生物體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)是機(jī)體的重要防御系統(tǒng)，是清除外源物質(zhì)產(chǎn)生的氧自由基的第一道防線。為了探明重金屬鎘對抗氧化酶系統(tǒng)的毒性影響程度與致毒機(jī)制，本文就不同濃度鎘對河蟹肝胰腺和鰓組織細(xì)胞中超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）和谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶（GST）酶活性的影響進(jìn)行了研究，為水產(chǎn)品的安全養(yǎng)殖提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

電動勻漿機(jī)（IKA TIGITAL）、電子天平（Sartorius，CP224S）、均質(zhì)器（IKA T18 DIGITAL）、低溫冷凍離心機(jī)（TGL-20B）。鎘標(biāo)準(zhǔn)品：濃度為1000毫克/升，購于國家有色金屬及電子材料分析測試中心。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物

河蟹：盤錦水產(chǎn)技術(shù)推廣站提供，平均濕重（50.3±0.52）克，雌雄各半，放入塑料養(yǎng)殖箱（42厘米×31厘米×26厘米）中暫養(yǎng)5天，選擇大小適宜、健康無病、活動正常的河蟹150只備用。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計

本課題組在前期對鎘引起的河蟹半致死量（LD50）的研究基礎(chǔ)上，將本文酶活實(shí)驗(yàn)設(shè)計為3個添加組和1個空白組，3個添加組的濃度分別為0.5、1.15和3.17毫克/升，每個濃度組設(shè)2個平行。實(shí)驗(yàn)采用42厘米×31厘米×26厘米大小的塑料養(yǎng)殖箱并上覆薄膜封口以保證養(yǎng)殖水體中鎘濃度的恒定，各養(yǎng)殖箱中加入5升含有不同濃度鎘的養(yǎng)殖水，水溫（21±2）℃，溶解氧>8.0毫克/升，自然光照，連續(xù)充氣增氧。實(shí)驗(yàn)期間不喂食，及時清理死亡個體。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

樣品制備：鎘脅迫96小時之后，每個平行組隨機(jī)選取3～5只河蟹，迅速取出肝胰腺和鰓，在玻璃勻漿器中加入9倍體積的預(yù)冷生理鹽水，冰浴勻漿組織10分鐘，勻漿后于離心機(jī)上離心10分鐘（2500rpm），上清液冷凍保存用于測定酶活。酶活測定：采用“南京建成”試劑盒測定SOD、CAT和GST酶活和總蛋白量，酶活單位為U/毫克蛋白。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

結(jié)果采用2平行組的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示，顯著性檢驗(yàn)用SPSS18.0軟件進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA）和多重比較（Duncan法），差異顯著臨界值為0.01。

2 結(jié)果

2.1 鎘對河蟹肝胰腺和鰓SOD酶活性的影響

不同濃度鎘對河蟹肝胰腺和鰓的SOD酶活性影響見圖1。肝胰腺空白組的SOD酶活為106U/毫克蛋白，低濃度組（0.5毫克/升）酶活為158U/毫克蛋白，顯著高于對照組（P<0.01），中高濃度組酶活分別降至82和60U/毫克蛋白，顯著低于對照組（P<0.01）。腮的低濃度組（0.5毫克/升）SOD酶活被明顯激活，SOD達(dá)164U/毫克蛋白，顯著高于對照組的120U/毫克蛋白（P<0.01），隨著鎘脅迫濃度的增大，高濃度組（3.17毫克/升）河蟹腮的SOD酶活被抑制，酶活僅為空白組的50%，為72U/毫克蛋白。由此可見，隨著鎘脅迫濃度的增大，鎘對河蟹肝胰腺和腮中SOD酶的作用總體均呈現(xiàn)出先激活再抑制的趨勢。

2.2 鎘對河蟹肝胰腺和鰓CAT酶活性的影響

不同濃度鎘對河蟹肝胰腺和鰓的CAT酶活性影響見圖2。與SOD類似，鎘脅迫后肝胰腺和鰓的CAT酶活性也發(fā)生了明顯的變化，總體規(guī)律為先激活后抑制，由圖2可以看出，低濃度組（0.5毫克/升）肝胰腺和鰓中CAT酶活均有明顯升高，分別為6.6和6.3U/毫克蛋白，顯著高于空白組（P<0.01），隨著鎘脅迫濃度的增大，肝胰腺和鰓的CAT酶活逐漸被抑制，高濃度組（3.17毫克/升）脅迫96小時后CAT酶活已從激活態(tài)逐漸回落，酶活性與空白組相當(dāng)。

2.3 鎘對河蟹肝胰腺和鰓GST酶活性的影響

不同濃度鎘對河蟹的肝胰腺和鰓GST酶活影響見圖3。鎘對河蟹肝胰腺GST酶活的影響趨勢與SOD和CAT相似，對照組GST酶活為132U/毫克蛋白，低濃度組酶活為163U/毫克蛋白，與對照組相比差異顯著（P<0.01），中、高濃度組GST酶活力分別升至149和118U/毫克蛋白，與對照組差異極顯著（P<0.01）。鰓GST酶與肝胰腺規(guī)律一致，鰓對照組GST酶活為138U/毫克蛋白，低濃度組GST酶活升高為172U/毫克蛋白，中濃度組酶活降至136U/毫克蛋白，繼續(xù)降至高濃度組的103U/毫克蛋白。

3 討論

鎘是一種常見的環(huán)境污染物，能夠刺激生物體產(chǎn)生大量的活性氧。SOD是生物體防御內(nèi)外環(huán)境中氧自由基（O2-）侵害的第一道防線，能夠靈敏反映外界對生物體的損傷。本文結(jié)果顯示，隨著鎘脅迫濃度的升高，河蟹肝胰腺和鰓中SOD活性呈現(xiàn)出先被激活隨后被抑制的趨勢，這與李涌泉、王蘭等的研究結(jié)果一致。SOD為底物誘導(dǎo)酶，低濃度的鎘脅迫致使河蟹體內(nèi)產(chǎn)生大量O2-誘導(dǎo)SOD大量產(chǎn)生以清除O2-對機(jī)體造成的損害，因此，低濃度的Cd誘導(dǎo)SOD活性增強(qiáng)。中高濃度組的Cd2+能夠與河蟹體內(nèi)細(xì)胞質(zhì)和線粒體中Cu/Zn-SOD和Mn-SOD發(fā)生置換，形成Cd-SOD改變其分子構(gòu)想，致使SOD酶活降低。

過氧化氫酶（CAT）在機(jī)體清除多余的自由基過程中扮演著重要的角色，低濃度鎘脅迫時，河蟹體內(nèi)H2O2和羥自由基（-HO）含量增加，SOD酶被激活的同時，CAT合成被激活，共同清除過量H2O2保護(hù)機(jī)體。本實(shí)驗(yàn)同樣得出，當(dāng)河蟹受到低濃度鎘脅迫時SOD酶活升高，同時CAT酶被激活，其酶活高于空白組50%以上，這與其他甲殼類動物的研究結(jié)果也保持一致，從CAT和SOD的作用機(jī)理同樣可以得出兩類酶活變化應(yīng)保持同步的結(jié)論。然而，隨著鎘脅迫濃度的升高，CAT活力未降低至空白組以下，而是維持在空白組的酶活范圍內(nèi)，這可能與鎘未對CAT造成類似SOD分子構(gòu)想的改變的影響有關(guān)。

GST是一類多功能解毒酶，GST的多功能性使它在機(jī)體解毒代謝中起著十分重要的作用。特定的GST亞基對致癌性異生物質(zhì)有特異的高催化活性，能夠催化GSH（谷胱甘肽）與機(jī)體中被氧化的-SH反應(yīng)使其再生。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，低濃度的Cd2+對GST酶活表現(xiàn)出激活作用，此時GST能夠與低濃度的Cd2+結(jié)合，從而降低對河蟹機(jī)體的氧化損傷，但隨著Cd2+濃度的升高，Cd2+的累積毒性增加，原有GST活性中心遭到嚴(yán)重破壞，新的GST難以合成，活力降至正常范圍以下。

4 結(jié)論

河蟹體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)對鎘脅迫具有較高的敏感性，SOD、CAT和GST酶對降低鎘引起的氧化損傷具有積極作用。抗氧化酶系統(tǒng)中SOD、CAT和GST的活力隨鎘脅迫的時間和濃度發(fā)生規(guī)律性變化，隨著時間和濃度的增加，3種酶的活力呈現(xiàn)出先激發(fā)后抑制的規(guī)律。

作者簡介：趙亞玲，高級農(nóng)藝師。