浙江沿岸髭縞蝦虎魚的系統(tǒng)地理分析

楊開榮，毛君來，顧翠平，陳永久,

（1.浙江海洋大學(xué)國家海洋設(shè)施養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，浙江舟山 316022；2.浙江海洋大學(xué)海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，浙江舟山 316022）

髭縞蝦虎魚Tridentiger barbatus隸屬于蝦虎魚科Gobiidae、縞蝦虎魚屬Tridentiger。因下頜長有胡須，又稱須縞蝦虎魚。成魚體側(cè)扁，背緣廣弧形隆起；頭大平扁，頭部有許多觸須，穗狀排列。眼小，口大，前位。頭部無鱗，體被櫛鱗[1]。髭縞蝦虎魚是近海底層溫暖性小型魚類，廣泛分布于中國、朝鮮半島、日本及菲律賓沿岸海域，常棲息于河口咸淡水域，有時也進(jìn)入江、河下游淡水水域中生活，主要以牡蠣貝類、小型魚類、枝角類及其他水生昆蟲為食。髭縞蝦虎魚是浙江沿岸常見的種類[2]。由于髭縞蝦虎魚個體小，因此食用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值不顯著，但可用于指示環(huán)境，是研究群體遺傳結(jié)構(gòu)和系統(tǒng)地理的理想生物學(xué)模型。

魚類線粒體DNA標(biāo)記，如細(xì)胞色素c氧化酶第一亞基（COI）結(jié)構(gòu)簡單、長度適宜，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于物種鑒定、系統(tǒng)地理以及遺傳多樣性研究[3]。COI基因序列在很大程度上彌補(bǔ)了形態(tài)學(xué)鑒定的不足，為新物種和遺傳多樣性的鑒定提供了有力的技術(shù)支持。基于線粒體COI序列多態(tài)，于亞男等[4]對長江口7種蝦虎魚進(jìn)行了系統(tǒng)分類，顧翠平等[5]報(bào)道了浙江沿岸斑尾刺蝦虎魚Acanthogobius ommaturus的分類與遺傳關(guān)系。本文通過對髭縞蝦虎魚COI DNA序列分析，旨在探索浙江沿岸髭縞蝦虎魚群體遺傳多樣性與系統(tǒng)地理關(guān)系，為下一步浙江沿岸髭縞蝦虎魚及其它魚類物種保護(hù)措施的實(shí)施，以及海洋生態(tài)環(huán)境的評估提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本和保存

髭縞蝦虎魚樣本于 2012年7月-2015年10月期間分別采自舟山嵊泗、舟山岱山、寧波象山、臺州臨海、溫州洞頭和溫州蒼南6個點(diǎn)的潮間帶水域，采樣點(diǎn)的地理位置如圖1所示。樣本收集主要采用網(wǎng)撈與手抓的方式。共采集41個髭縞蝦虎魚樣本，樣本數(shù)量分布如表1。樣本置于95%乙醇中并保存于-20℃冰箱中以備用。

采樣點(diǎn)地理分布從北至南依次為嵊泗、岱山、象山、臨海、洞頭和蒼南。

圖1 髭縞蝦虎魚采樣地點(diǎn)分布圖Fig.1 Map shows sampling sites of T.barbatus

1.2 DNA的提取、擴(kuò)增及測序

每個樣本剪取0.5～1 cm新鮮或冷凍組織進(jìn)行基因組DNA提取，使用Promega公司W(wǎng)izard Genomic DNA Purification Kit試劑盒進(jìn)行抽提。DNA沉淀、干燥處理后，溶于200 μL DNA Rehydration Solution中。DNA擴(kuò)增引物采用硬骨魚類COI通用引物 Fish1F和Fish1R[3]；引物由上海生工生物股份有限公司合成。PCR在一個25 μL的反應(yīng)體系中進(jìn)行，包括12.5 μL TaqMix，1 μL正向引物，1 μL反向引物，9.5 μL滅菌雙蒸水，1 μL模板DNA。PCR反應(yīng)程序?yàn)?5℃預(yù)變性2 min，95℃變性40 s，52℃退火60 s，72℃延伸90 s，共35個循環(huán)，72℃最后延伸5 min。瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測，凝膠成像儀掃描記錄結(jié)果，結(jié)果單一明亮的PCR產(chǎn)物送上海生工生物股份有限公司測序。

表1 浙江沿岸髭縞蝦虎魚樣本采集與COI DNA序列變異信息Tab.1 Information of COI DNA sequence variation in T.barbatus from the coastal sea of Zhejiang

1.3 DNA序列數(shù)據(jù)的處理

采用Clustal X 2.0[6]和BioEdit v.7.0.9.0[7]軟件對所測的序列進(jìn)行同源序列比對、排序。利用DnaSP5.10[8]計(jì)算序列的單倍型數(shù)目、單倍型多態(tài)性（Hd）及核苷酸多態(tài)性（π）。利用Network4.6[9]構(gòu)建單倍型網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖。采用MEGA6.0[10]構(gòu)建鄰接（NJ）聚類樹。最后，采用 Arlequin 3.5軟件[11]進(jìn)行分子方差分析（AMOVA）、并計(jì)算采樣點(diǎn)之間的FST值。

2 結(jié)果

本文共獲得41條長度為579 bp的線粒體DNA COI序列，并鑒定出11個單倍型。單倍型之間堿基替換為1～5個。H01是最常見單倍型，占總數(shù)的56.1%，被23個樣本分享，分布于6個采樣點(diǎn)；H02分布于除象山之外的5個采樣點(diǎn)；洞頭、臨海分享了H03；H06和H07僅分布在嵊泗；H08和H09僅分布在岱山；H10只分布在象山；H11只分布在蒼南。詳細(xì)如表1所示。單倍型多態(tài)性與核苷酸多態(tài)性在嵊泗最高（Hd=0.90±0.16；π=0.003 1±0.000 7），在臨海最低（Hd=0.57±0.13；π=0.001 3±0.000 4）。單倍型網(wǎng)絡(luò)圖呈輻射狀（圖 2a），以H01和H02為中心，通過1～3個堿基替換與其它所有單倍型相連接；NJ聚類樹顯示6個采樣點(diǎn)髭縞蝦虎魚單倍型沒有形成與地理相關(guān)的類群（圖 2b）。

圖2 髭縞蝦虎魚COI DNA單倍型網(wǎng)絡(luò)圖（a）和NJ聚類樹（b）Fig.2 T.barbatus COI DNA haplotype network（a）and NJ tree（b）

6個采樣點(diǎn)之間的遺傳差異（FST指數(shù)）為-0.143～0.198，其中嵊泗與臨海采樣點(diǎn)之間遺傳差異指數(shù)最大，為 0.198（0.05＞p＞0.01），其次為嵊泗與洞頭，為 0.146（p＞0.05），其余幾乎無差異，具體如表2。此外，分子方差分析（AMOVA）顯示種群間變異率為較小，即3.11%（d.f.=5），而種群內(nèi)變異率高達(dá) 96.89%（d.f.=35）。

表2 不同采集地點(diǎn)髭縞蝦虎魚樣本的遺傳差異指數(shù)（FST）Tab.2 The population genetic differentiation index（FST）of T.barbatus among different sampling locations.

3 討論

遺傳多樣性是生物多樣性的核心，也是生物進(jìn)化的基礎(chǔ)[12]，遺傳多樣性的高低與物種的適應(yīng)能力有密切的關(guān)系。單倍型多態(tài)性（Hd）和核苷酸多態(tài)性（π）是反映種群遺傳多樣性的重要指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)髭縞蝦虎魚種群具有單倍型多態(tài)性高和核苷酸多態(tài)性低的特點(diǎn)，這類情況在我國及鄰近海域的海洋魚類中普遍存在，如雙帶縞蝦虎魚Tridentiger bifasciatus[13]、大瀧六線魚Hexagrammos otakii[14]。本研究中髭縞蝦虎魚的π值為0.001 3～0.003 1，低于其它眾多海洋魚類。這一點(diǎn)在YU Ziniu，et al[15]發(fā)表的關(guān)于黃海與東海日本鳀Engraulis japonicus的文章中得到了證實(shí)（平均π值=0.006 4）；此外，LYNCH，et al[16]報(bào)道，美國大西洋沿岸的大西洋油鯡Brevoortia tyrannus的平均π值為0.027 4。一般來說，單倍型多態(tài)性和核苷酸多態(tài)性數(shù)值越大，種群遺傳多樣性越豐富[17-18]，其有效群體也越大，并且物種對環(huán)境變化的適應(yīng)潛力也越大。

本文結(jié)果顯示浙江沿岸髭縞蝦虎魚的單倍型多態(tài)性與核苷酸多態(tài)性在嵊泗最高（Hd=0.90±0.16；π=0.003 1±0.000 7），在臨海最低（Hd=0.57±0.13；π=0.001 3±0.000 4）。推測這可能與嵊泗列島棲息地生態(tài)環(huán)境多樣性，或者較少人為活動干擾有關(guān)；臨海髭縞蝦虎魚的遺傳多樣性較低，可能是該地區(qū)受到了較多人為因素的干擾。這也表明該地區(qū)的髭縞蝦虎魚種質(zhì)資源狀況不容樂觀。建議應(yīng)采取一定措施，如沿海作業(yè)管控等對該地區(qū)進(jìn)行種質(zhì)資源的保護(hù)，以提高髭縞蝦虎魚的遺傳多樣性。此外，由于本次COI分析的髭縞蝦虎魚的樣本數(shù)比較少，因此后續(xù)應(yīng)擴(kuò)大樣本容量，以便做進(jìn)一步的驗(yàn)證分析。

單倍型網(wǎng)絡(luò)圖，還有NJ聚類關(guān)系、AMOVA和FST分析結(jié)果一致表明，浙江沿岸髭縞蝦虎魚地理群體間差異不大，沒有嚴(yán)格形成與地理水文特征相符合的系統(tǒng)地理結(jié)構(gòu)。初步推斷有兩種可能：（1）不同群體間的隔離時間不久；（2）該海域沒有顯著的基因流障礙。此外，臺灣暖流與沿岸入海徑流的交匯，有助于海洋魚卵、幼體及成體的擴(kuò)散，導(dǎo)致了髭縞蝦虎魚沒有顯著的系統(tǒng)地理分化。這一點(diǎn)與顧翠平等[5]在浙江沿海斑尾刺蝦虎魚研究中獲得的結(jié)果相似。

致謝：感謝顧翠平，許則灘，嚴(yán)安琪，Jamel Tyso James，王一凡，謝斐昂實(shí)驗(yàn)室成員在采樣、以及實(shí)驗(yàn)和數(shù)據(jù)分析過程中提供幫助。