水產(chǎn)品中有機(jī)磷農(nóng)藥多殘留的固相萃取-氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測定

葉茂盛，孫秀梅，郝 青，金衍健，胡紅美，郭遠(yuǎn)明，應(yīng)忠真，王范盛

（浙江海洋大學(xué)海洋與漁業(yè)研究所，浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江省海洋漁業(yè)資源可持續(xù)利用技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江舟山 316021）

我國的農(nóng)藥的使用一直是一個被大眾關(guān)注的問題，各類農(nóng)藥通過環(huán)境遷移、地表徑流等方式污染養(yǎng)殖或捕撈水域，部分農(nóng)藥則廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖中的清塘和病蟲害防治，甚至水產(chǎn)品的加工過程中也出現(xiàn)了非法使用農(nóng)藥等現(xiàn)象。有機(jī)磷農(nóng)藥對細(xì)菌、害蟲、雜草生長等具有有效的控制，能提高農(nóng)作物的產(chǎn)量，曾被廣泛使用[1]，為研究有機(jī)磷農(nóng)藥殘留對水產(chǎn)品質(zhì)量安全的影響，加強(qiáng)水產(chǎn)品中多種有機(jī)磷農(nóng)藥檢測方法的研究，特別是建立快速、準(zhǔn)確、可操作性強(qiáng)、對環(huán)境污染小的分析方法具有現(xiàn)實(shí)應(yīng)用意義。

檢測方法方面，目前國內(nèi)的有機(jī)磷農(nóng)藥檢測有氣相色譜法（GC）[2-4]、氣相色譜質(zhì)譜法（GC/MS）[5-7]、高效液相色譜（HPLC）[8-9]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）[10-11]。余駿等[12]檢測水產(chǎn)品中有機(jī)磷農(nóng)藥殘留時，將樣品用丙酮提取、弗羅里硅土凈化后，進(jìn)行DB-1701毛細(xì)管色譜柱分離用火焰光度檢測器直接測定，建立了氣相色譜法測定水產(chǎn)品體內(nèi)樂果、甲基對硫磷和馬拉硫磷殘留量的方法。張?jiān)频萚13]采用酸化的乙酸乙酯提取等量后的樣品，將提取液過酸性氧化鋁柱從而去脂，EI源，正離子多反應(yīng)檢測模式檢測，外標(biāo)法定量，使用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀同時檢測水產(chǎn)品樣品中的敵百蟲、敵敵畏、蠅毒磷、乙酰甲胺磷、甲胺磷、毒死蜱、樂果等7種有機(jī)磷類藥物的殘留量。牛佳鈺等[14]不僅簡單的闡述了有機(jī)磷農(nóng)藥殘留對環(huán)境的污染以及對人體健康的危害，還提出一些常用的農(nóng)藥檢測方法，例如高效液相色譜法、氣相色譜法、薄層層析法、熒光光度法、免疫測定法以及電化學(xué)方法等。自從ERCEGOVICH，et al[15]和HAMMOCK，et al[16]提出利用免疫學(xué)技術(shù)進(jìn)行農(nóng)藥殘留分析以來，國外近年來在此方向的研究比較活躍，尤其是酶聯(lián)免疫分析，該法測定的水中有機(jī)磷農(nóng)藥殘留限可達(dá)0.1～10 mg·L-1。CLGG，et al[17]采用液相色譜和酶聯(lián)免疫分析兩種方法檢測了草甘磷的殘留。有機(jī)磷農(nóng)藥檢測方法相對成熟，目前主要在前處理部分仍存在試劑消耗量大、操作過于繁雜、回收率不高等問題需要改善，本文主要通過比較幾種不同提取劑（乙腈，正己烷，正己烷：乙酸乙酯=1：1混液）和不同吸附劑（PSA，弗羅里硅土，中性氧化鋁）對水產(chǎn)品的凈化效果的影響，采用固相萃取-氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測定，建立了一種更簡便，提取效果更好的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)所用大黃魚Larimichthys crocea、南美白對蝦Penaeus vannamei、草魚Ctenopharyngodon idellus、鯉魚Cyprinus carpio、鯽魚Carassius auratus來自舟山當(dāng)?shù)剞r(nóng)貿(mào)市場。正己烷、乙腈、乙酸乙酯、丙酮（色譜純）、氯化鈉（分析純）、N-丙基二乙胺（PSA）（分析純）、弗羅里硅土 Florisil（100～200 目）、氧化鋁 Alumina-N（100～300 目）。

28種有機(jī)磷標(biāo)準(zhǔn)溶液（甲胺磷、敵敵畏、乙酰甲胺磷、氧化樂果、滅線磷、硫線磷、甲拌磷、樂果、特丁硫磷、地蟲硫磷、磷胺、二嗪磷、甲基對硫磷、皮蠅磷、殺螟硫磷、馬拉硫磷、倍硫磷、毒死蜱、對硫磷、水胺硫磷、喹硫磷、殺撲磷、苯線磷、丙溴磷、三唑磷、亞胺硫磷、伏殺磷、蠅毒磷）。

1.2 儀器與設(shè)備

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（Agilent 7890B-7000C 型），渦旋振蕩器（IKA MS3），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（Buchi R-215），臺式離心機(jī)（Eppendorf centrifuge5810），超聲波清洗機(jī)（KUDOS）；分析天平；烘箱。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品前處理

1.3.1 .1有機(jī)磷樣品萃取

在裝有5.0 g水產(chǎn)品試樣的離心管中加入10 mL提取劑（正己烷，乙腈，乙腈：乙酸乙酯=1：1混合溶液，乙腈：水=9：1溶液，正己烷：乙酸乙酯=1：1混合溶液），通過渦旋振蕩器震蕩2 min，使用超聲儀超聲5 min，以5 000 r·min-1的轉(zhuǎn)速離心5 min，將上層清液轉(zhuǎn)移至旋蒸瓶中，再重復(fù)上述操作，將上層清液合并，在40℃水浴旋蒸儀中濃縮至干，加入1 mL正己烷定容。

1.3.1 .2樣品凈化

將定容后的溶液通過固相萃取的方式凈化，將硅膠固相萃取柱中加入1.0 g PSA，使用適量的正己烷：乙酸乙酯：丙酮（8：1：1）活化（觀察萃取柱的活化狀態(tài)，必要時增加洗脫液體積），活化萃取柱后接上旋蒸瓶，將濃縮的提取液轉(zhuǎn)移至萃取柱中，加入10 mL洗脫液（正己烷：乙酸乙酯：丙酮=8：1：1）進(jìn)行洗脫。將收集到的洗脫液再次使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在40℃水浴旋蒸儀中濃縮至干，加入1 mL正己烷定容，使用渦旋振蕩器振蕩確保洗脫液能充分溶解在正己烷中，將定容后的溶液收集于1 mL氣相小瓶備用。

1.3.2 氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析條件

1.3.2 .1色譜條件

色譜柱為DB-1701毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 um）；色譜柱升溫程序：70℃保持2 min，以 25℃·min-1升到150℃，再以3℃·min-1升到200℃，再以8℃·min-1升到280℃保持10 min；進(jìn)樣口溫度：290℃；進(jìn)樣量為1 uL；進(jìn)樣方式：脈沖不分流方式進(jìn)樣。

1.3.2 .2質(zhì)譜條件

離子源：電子轟擊離子（EI）源；離子源溫度：300℃；四極桿溫度：150℃；GC-MS/MS接口溫度：280℃；溶劑延遲時間：5 min；碰撞氣流速：1.5 mL·min-1，淬滅氣流速：2.25 mL·min-1。采用多反應(yīng)檢測（MRM）模式。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別吸取一定量的標(biāo)準(zhǔn)溶液，用正己烷稀釋，配置成濃度為 5、10、20、40、100、200 μg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.3.2節(jié)的條件測定。以各農(nóng)藥的濃度為橫坐標(biāo)（x），以其對應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)（y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取劑的選擇與優(yōu)化

水產(chǎn)品中含有大量脂肪，豐富的氨基酸和蛋白質(zhì)，選取合適的提取劑既能減少雜峰對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾，也能減少對色譜柱的污染損害，延長色譜柱的使用壽命。本研究分別選用了正己烷，乙腈，乙腈：乙酸乙酯=1：1混合溶液，乙腈：水=9：1溶液，正己烷：乙酸乙酯=1：1混合溶液作為提取劑對同種樣品進(jìn)行提取，用硅膠柱凈化，通過氣質(zhì)聯(lián)用儀測定并分析。實(shí)驗(yàn)中用乙腈二次提取的溶液十分渾濁，且離心管口出現(xiàn)了大量樣品絮狀物，這是因?yàn)?00%濃度的乙腈溶液會使水產(chǎn)品中的蛋白質(zhì)快速變性導(dǎo)致蛋白質(zhì)迅速凝聚包裹了目標(biāo)藥物，使藥物難以被提取，導(dǎo)致回收率出現(xiàn)偏低的情況，同時渾濁的情況也使后續(xù)的固相萃取變得難以操作，加大了對實(shí)驗(yàn)的干擾。王雪榮[18]通過實(shí)驗(yàn)測定出了合適的乙腈濃度為90%。本實(shí)驗(yàn)則繼續(xù)嘗試其他提取劑的比較。用乙腈：乙酸乙酯=1：1混合溶液，乙腈：水=9：1溶液提取后的提取液均難以通過硅膠柱。結(jié)果表明：使用正己烷或正己烷：乙酸乙酯=1：1混合溶液的提取效果更好，基線更穩(wěn)定，回收率更高。正己烷和乙酸乙酯都是低毒性有機(jī)溶劑，為了簡化操作難度及步驟，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇正己烷作為提取劑。

2.2 吸附劑的選擇與優(yōu)化

提取劑未經(jīng)過凈化時，基質(zhì)存在很多雜峰，會對有機(jī)磷的測定造成極大的干擾。采用不同的吸附劑材料對提取液進(jìn)行凈化，會取得不同的效果。PSA可去除各種糖類、脂肪酸、有機(jī)酸、酚類和親脂性色素等極性物質(zhì)，并能螯合大多數(shù)金屬離子；弗羅里硅土適合從非極性基質(zhì)中吸附極性化合物；中性氧化鋁適用于對堿性物質(zhì)的分離，也可以用來分離弱的有機(jī)酸和堿等[19]。本研究用正己烷作為提取劑，在硅膠柱中分別加入等量的（1 g）PSA，弗羅里硅土，中性氧化鋁對提取液進(jìn)行凈化處理，凈化處理后的溶液通過氣質(zhì)聯(lián)用儀測定并進(jìn)行比較分析。結(jié)果表明：使用PSA作為吸附劑的凈化效果更好，可獲滿意的回收率，且重現(xiàn)性較好，其次是弗羅里硅土，中性氧化鋁的除雜能力明顯不如PSA和弗羅里硅土。故本研究采用PSA作為吸附劑。

2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

對28種農(nóng)藥的前級離子、產(chǎn)物離子、碰撞能量等一系列質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化。首先選擇前級離子，對每一種農(nóng)藥以適量的濃度進(jìn)行全掃描，并從一級質(zhì)譜圖中選擇適當(dāng)?shù)碾x子作為前級離子；其次選擇產(chǎn)物離子，對選定的前級離子用產(chǎn)物離子掃描的方式確定二級質(zhì)譜圖，從中選擇適宜的離子作為產(chǎn)物離子；經(jīng)優(yōu)化的氣相色譜質(zhì)譜條件分析得到28種有機(jī)磷的均得到較好的分離如圖1所示。對每一組前級離子/產(chǎn)物離子分別選擇不同的碰撞能量進(jìn)行掃描，最終獲得MRM掃描的監(jiān)測離子如表2所示。

圖1 28種有機(jī)磷農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液的氣相色譜質(zhì)譜圖Fig.1 Gas chromatography-mass spectrometry of 28 standard solutions of organophosphorus pesticides

2.4 方法的線性關(guān)系和定量限

使用建立的方法對28種有機(jī)磷農(nóng)藥在大黃魚和南美白對蝦中進(jìn)行線性關(guān)系和定量限的研究。結(jié)果如表2所示，在5～200 μg·L-1范圍內(nèi)，28種有機(jī)磷農(nóng)藥的峰面積與對應(yīng)的質(zhì)量濃度間呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2＞0.996 8，以被測物質(zhì)的定量離子對的信噪比為10確定定量限在0.2～7.9 μg·kg-1之間，符合農(nóng)藥殘留分析方法的要求[20]。

2.5 方法的回收率和精密度

在水產(chǎn)試樣中添加100 μg·kg-1的28種農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.3.1節(jié)方法進(jìn)行處理做回收率試驗(yàn)，每個水平平行測定6次計(jì)算精密度，結(jié)果如表2。結(jié)果表明，28種有機(jī)磷農(nóng)藥在大黃魚中的平均回收率在67%～99%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在5.3%～13.6%（n=6）之間，在南美白對蝦中的平均回收率為73%～106%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在4.6%～12.8%（n=6）之間。

表2 28種農(nóng)藥的各項(xiàng)參數(shù)及在大黃魚和南美白對蝦中的平均添加回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差Tab.2 Parameters of 28 pesticides and average addition recovery and relative standard deviation in large yellow croaker and white shrimp

3 結(jié)論

通過對樣品提取步驟和凈化步驟的優(yōu)化，本研究建立了水產(chǎn)品中28種有機(jī)磷農(nóng)藥的固相萃取-氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法。樣品經(jīng)過正己烷均質(zhì)提取，PSA聯(lián)合硅膠柱凈化后GC-MS/MS分析，雜質(zhì)含量顯著降低，靈敏度顯著提高，該方法較為靈敏、準(zhǔn)確、簡便，可用于水產(chǎn)品的有機(jī)磷農(nóng)藥殘留情況檢測。