Stattic 影響急性髓系白血病細(xì)胞DNA損傷修復(fù)與凋亡

羅堉暄　楊艷玲　龍冰　林燕斯　許藝川　張祥忠

【摘要】 目的探討STAT3抑制劑Stattic對急性髓系白血?。ˋMI） U937與HL60細(xì)胞株的增殖、凋亡及DNA損傷修復(fù)的影響。方法分別以不同濃度Stattic處理U937與HL60細(xì)胞24 h，以細(xì)胞增殖一毒性檢測試劑（ CCK8）法檢測白血病細(xì)胞的增殖活性;以流式細(xì)胞技術(shù)檢測白血病細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期、DNA損傷以及DNA損傷修復(fù)情況。結(jié)果U937與HL60的增殖活性隨著Stattic濃度的升高而減弱（P均<0.05）。1、2.5、5μM的Stattic均可誘導(dǎo)HL60細(xì)胞凋亡增加（P< 0.001）;而U937僅在2.5、5μM濃度的Stattic處理后細(xì)胞凋亡才增加（P< 0.001），2種AML細(xì)胞凋亡比率均隨著Stattic藥物濃度增大而增加。2.5、5μM濃度的Stattic可將U937細(xì)胞周期阻滯在G2/M期（P<0.05），同時CO/GI期百分比下降（P<0.01）。1、2.5μM濃度的Stattic將HL60細(xì)胞周期阻滯在S期，同時G2/M期及Gl/CO期百分比下降（P<0.05），HL60細(xì)胞在Stattic 5μM時，SubGI百分比升高。經(jīng)依托泊苷誘導(dǎo)DNA雙鏈斷裂后6h，Stattic處理后的U937與HL60細(xì)胞中γ-H2AX熒光強(qiáng)度仍維持在較高水平（P均<0.001）。結(jié)論Stattic可能通過誘導(dǎo)白血病細(xì)胞發(fā)生DNA損傷并阻礙其修復(fù)進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

【關(guān)鍵詞】 DNA損傷修復(fù);STAT3抑制劑;急性髓系白血病;凋亡

急性髓系白血?。?AMI）是起源于造血干/祖細(xì)胞的惡性克隆性疾病。目前化學(xué)治療聯(lián)合造血干細(xì)胞移植仍然是大部分AML患者的標(biāo)準(zhǔn)治療方案。然而僅40% - 70%的患者可通過化學(xué)治療獲得完全緩解。部分患者對化學(xué)治療藥物發(fā)生耐藥[1]。對AML發(fā)病機(jī)制的研究促進(jìn)了各類靶向藥物的開發(fā)與使用。PML/RARA融合基因陽性急性早幼粒細(xì)胞白血病患者經(jīng)全反式維甲酸聯(lián)合砷劑治療基本可以達(dá)到臨床治愈[2]。而酪氨酸激酶3（ FLT3）抑制劑對FLT3-ITD突變AML患者療效卻不理想，表現(xiàn)為緩解期短[1]。部分靶向藥物療效持續(xù)時間短或與腫瘤細(xì)胞耐藥相關(guān)。AML發(fā)生耐藥的相關(guān)機(jī)制仍需要深入研究，以尋找新的靶向藥物。

轉(zhuǎn)錄激活因子3（ STAT3）是重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)因子，磷酸化后呈活化狀態(tài)[3]。在大部分腫瘤中STAT3呈持續(xù)活化狀態(tài)[4-6]。抑制STAT3活性可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[7-8]。研究顯示STAT3與DNA損傷修復(fù)（ DDR）相關(guān)[9-11]。細(xì)胞發(fā)生基因損傷后即啟動DDR。若損傷持續(xù)存在，則細(xì)胞發(fā)生凋亡[12]。許多腫瘤對放射治療及化學(xué)治療耐藥與腫瘤細(xì)胞DDR功能活躍有關(guān)。在大多數(shù)實體腫瘤中，抑制STAT3活性可增加DDR從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[10]。筆者目前尚未見STAT3抑制劑干擾白血病患者腫瘤細(xì)胞DDR的相關(guān)報道，故擬探討STAT3抑制劑對AML細(xì)胞的增殖、凋亡和DDR的影響。

材料與方法

一、實驗材料

AML細(xì)胞株U937與HL60由中國科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院贈予。STAT3抑制劑Stattic購于CAYMAN CHEMICAL公司，依托泊苷購于Sigma公司，藥物均用二甲基亞砜（DMSO）溶解后于-20℃保存，使用時用磷酸鹽緩沖液（PBS）稀釋為需要濃度。凋亡檢測試劑盒、周期檢測試劑盒購于南京凱基生物公司，γ-H2AX熒光標(biāo)記抗體（抗體）購于Bio-Legend公司。采用BD公司C6和Calibur流式細(xì)胞儀及Berthold公司多功能酶標(biāo)儀。

二、實驗方法

1.細(xì)胞培養(yǎng)

U937和HL60細(xì)胞株復(fù)蘇后，用RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基+ 10%胎牛血清（美國Gibco公司）培養(yǎng)于5%二氧化碳、37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中，細(xì)胞密度維持在lx 10⁵-lx 10⁶，2-3d更換培養(yǎng)基。

2.細(xì)胞活力檢測

收集對數(shù)生長期的U937與HL60細(xì)胞株，調(diào)整細(xì)胞密度約為1×10⁵/ml;將對數(shù)生長期細(xì)胞接種于96孔板中，每孔100μl，藥物組分別予1、2.5、5、10μM的Stattic處理，陰性對照組予DMSO處理，空白對照為培養(yǎng)基，每組設(shè)置3個重復(fù)孔;將培養(yǎng)板置于5%二氧化碳、37℃的培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h;向每孔加入10μl的細(xì)胞增殖一毒性檢測試劑（ CCK8），將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2h;用酶標(biāo)儀測定在450 nm處的吸光度（OD）。增殖抑制率（%）=[1-（OD實驗-OD空自組）/（0D陰性對照一OD空自組）]×100%

3.AML細(xì)胞周期的檢測

采用不同濃度Stattic處理對數(shù)生長期U937與HL60細(xì)胞株24 h后收集各細(xì)胞樣品，用PBS洗3次后去上清，加入500 μl 70%預(yù)冷乙醇固定2h，用PBS洗去固定液，加入500 μl PI/RNase A染色液（ PI：Rnase A=9：1），室溫避光30 - 60 min，于Calibur流式細(xì)胞儀上檢測，用Flowjo-VIO處理圖像。

4.細(xì)胞凋亡的檢測

采用不同濃度Stattic處理對數(shù)生長期U937與HL60細(xì)胞株24 h后收集各細(xì)胞樣品，用預(yù)冷PBS（含2%胎牛血清）洗滌3次后用Bingdingbufferl00μl重懸，加5μl Annexin V-FITC和5μlPI，輕輕混勻，室溫避光15 min。在BD公司C6流式細(xì)胞儀上測熒光強(qiáng)度，調(diào)節(jié)熒光補(bǔ)償，用Flowjo-V10處理圖像。

5.細(xì)胞DDR的相關(guān)檢測

細(xì)胞DDR速度的檢測：采用終濃度為6μg/ml的依托泊苷處理對數(shù)生長期U937與HL60細(xì)胞株，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2.5 h誘導(dǎo)DNA雙鏈斷裂。洗脫藥物后加入新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，分別培養(yǎng)0、2、4、6h后，收集各時間點(diǎn)細(xì)胞樣品，用PBS洗滌3次后去上清，室溫避光下用4%多聚甲醛重懸，靜置15 min，用PBS洗去4%多聚甲醛后加入預(yù)冷的70%乙醇，將流式管放置于渦旋振蕩器上，振蕩混勻，-20℃下孵育60 min。用PBS洗去乙醇后重懸，加入5 μlγ -H2AX抗體，避光室溫孵育90 min。Calibur流式細(xì)胞儀上檢測熒光強(qiáng)度。Flowjo-V10處理圖像并計算平均熒光強(qiáng)度（MFI）。

Stattic對細(xì)胞DNA雙鏈斷裂的影響：采用不同濃度Stattic處理對數(shù)生長期U937與HL60細(xì)胞株24 h后收集各細(xì)胞樣品，用PBS洗滌，離心后用前述方法孵育γ-H2AX抗體，在Calibur流式細(xì)胞儀上測熒光強(qiáng)度，用Flowjo-V10處理圖像并計算MFI。

Stattic對細(xì)胞DDR的影響：采用終濃度為6μg/ml的依托泊苷處理對數(shù)生長期U937與HL60細(xì)胞株，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2.5 h誘導(dǎo)DNA雙鏈斷裂。洗脫藥物后，將各細(xì)胞株分為對照組與實驗組，分別在含DMSO及2.5 μM Stattic的新鮮培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，6h后收集各細(xì)胞樣品，離心后用前述方法孵育的γ-H2AX抗體在Calibur流式細(xì)胞儀上測熒光強(qiáng)度，F(xiàn)lowjo-VIO處理圖像并計算MFI。

三、統(tǒng)計學(xué)處理

圖像均采用Adobe Illustrator和GraphPad Prism處理，所有數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0分析。符合正態(tài)分布的計量資料以x±s表示，2組均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

一、Stattic抑制AML細(xì)胞增殖

CCK8檢測顯示，U937與HL60的增殖活性隨著Stattic濃度的升高而減弱（P均<0.001），見表1。

二、Stattic促進(jìn)AML細(xì)胞凋亡

1、2.5、5μM的Stattic均可誘導(dǎo)HL60細(xì)胞凋亡增加（P<0.001）;而U937僅在2.5、5μM濃度的Stattic處理后細(xì)胞凋亡才增加（P<0.001），n=3，見圖1。2種AML細(xì)胞凋亡比率均隨著Stattic藥物濃度增大而增加。

三、Stattic阻滯AML細(xì)胞周期

各周期不同Stattic濃度組間比較中，U937：F_SubGl=176.327， F_G0/G1= 67.602， F_s= 43.302， F_G2/M= 70.174; HL60： F_SubGl=902.326， F_G0/G1= 254.493，F(xiàn)_s= 470.447， F_G2/M= 35.438.P均<0.001）。 2.5、5μM濃度的Stattic可將U937細(xì)胞周期阻滯在G2廠期（P<0.05），同時GO/G1期百分比下降（P<0.01）。l、2.5μM濃度的Stattic將HL60細(xì)胞周期阻滯在S期，同時G2/M期及G1/GO期百分比下降（P<0.05），HL60細(xì)胞在Stattic 5μM時，SubG1百分比升高，提示細(xì)胞凋亡較多。n=3，見圖2。

四、AML細(xì)胞具有DNA雙鏈斷裂損傷修復(fù)能力

依托泊苷誘導(dǎo)U937與HL60細(xì)胞雙鏈斷裂后，U937與HL60γ-H2AX平均熒光水平均高于空白對照組，明確發(fā)生了DNA雙鏈斷裂。在隨后的2、4、6h后，U937與HL60中的DNA雙鏈斷裂損傷得到了修復(fù)，表現(xiàn)為γ-H2AX熒光水平逐漸下降。n=3，見圖3。

五、Stattic誘導(dǎo)AML細(xì)胞DNA雙鏈斷裂并阻礙其修復(fù)

HL60經(jīng)不同濃度Stattic處理后均發(fā)生了DNA雙鏈斷裂，其程度隨著藥物濃度的增加而增大（F= 38.367.P<0.001）0 U937經(jīng)2.5、5μM Stattic處理后也發(fā)生了DNA雙鏈斷裂（F=399.164，P< 0.001），但經(jīng)1μM Stattic處理后也出現(xiàn)DNA雙鏈斷裂，但無前2組明顯。經(jīng)依托泊苷誘導(dǎo)DNA雙鏈斷裂后6h，Stattic處理后的U937與HL60細(xì)胞中γ-H2AX熒光強(qiáng)度仍維持在較高水平，提示Stattic阻礙了DNA雙鏈斷裂修復(fù)（t_u937=199.7，P< 0.001;t_HL60= 29.11，P<0.001）。以上實驗結(jié)果均提示Stattic可以誘導(dǎo)AML細(xì)胞發(fā)生DNA雙鏈斷裂并阻礙其修復(fù)。

討 論

1995年Yu等首次發(fā)現(xiàn)STAT3與腫瘤的發(fā)生與進(jìn)展相關(guān)，目前，越來越多的研究證實了這個觀點(diǎn)，70%的實體瘤和血液腫瘤具有STAT3活性增強(qiáng)的特性[13]。STAT3可以通過AKT/STAT3、Ras/Raf/MAPK、PI3K/AKT/mTOR通路促進(jìn)白血病細(xì)胞增殖，同時，STAT3通路異?；罨€會導(dǎo)致凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)失衡[7，13]。

STAT3在白血病細(xì)胞的增殖中發(fā)揮重要作用[14]。Stattic屬于非肽類STAT3小分子抑制劑，特異性地抑制STAT3 SH2結(jié)構(gòu)域的功能，對STAT5、STATI幾乎沒有抑制作用，是STAT3抑制劑中特異性較好的小分子抑制劑。在本次實驗中我們發(fā)現(xiàn)，經(jīng)Stattic作用24 h后，AML細(xì)胞HL60及U937的細(xì)胞周期阻滯在S、G2/M期，抑制增殖，這與目前報道的抑制STAT3活性可以有效地抑制急性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞增殖相符[13]。

STAT3的持續(xù)活化可抑制白血病細(xì)胞的凋亡，有研究者在FLT3-ITD突變的細(xì)胞株MV4-11中發(fā)現(xiàn)，p-STAT3的高表達(dá)導(dǎo)致抗凋亡基因Survivin表達(dá)上調(diào)，抑制細(xì)胞凋亡。在慢性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞中，STAT3活化可上調(diào)抗凋亡基因Bcl-2、Bcl-xL、Cyclin D1和ROR1表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡[7]。抑制STAT3的活性可調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，促進(jìn)白血病細(xì)胞的凋亡。在本實驗中，Stattic能誘導(dǎo)AML細(xì)胞U937和HL60細(xì)胞凋亡，隨著藥物濃度增加，凋亡百分比增加。有研究顯示，在HL60細(xì)胞中抑制STAT3活性可以上調(diào)促凋亡蛋白Caspase-3、P27和P21，同時降低抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞凋亡[7]。然而，STAT3抑制劑對DDR的影響是否參與了白血病細(xì)胞的凋亡，目前尚無相關(guān)報道。

本實驗顯示AML細(xì)胞株U937和HL60在依托泊苷誘導(dǎo)DNA雙鏈斷裂后可對受損的DNA進(jìn)行修復(fù)，而在加用Stattic后，DDR速度下降，這提示其可阻礙DDR，從而增加U937和HL60細(xì)胞對依托泊苷誘導(dǎo)DNA雙鏈斷裂的敏感性。Stattic單藥作用24 h后可誘導(dǎo)U937和HL60細(xì)胞發(fā)生DNA雙鏈斷裂，并且DNA雙鏈斷裂水平也隨著藥物濃度升高而升高。所以Stattic可通過誘導(dǎo)DNA雙鏈斷裂并阻礙細(xì)胞對DNA雙鏈斷裂的修復(fù)，從而促進(jìn)白血病細(xì)胞凋亡，增加白血病細(xì)胞對化學(xué)治療藥物依托泊苷的敏感性。許多傳統(tǒng)化學(xué)治療藥物均通過誘導(dǎo)DNA損傷，最終誘導(dǎo)白血病細(xì)胞的凋亡。然而誘導(dǎo)DNA損傷的化學(xué)治療藥物也會激活DDR反應(yīng)，且大部分腫瘤細(xì)胞具有較高的DNA修復(fù)能力，這是腫瘤細(xì)胞對化學(xué)治療耐藥的主要機(jī)制之一[15]。在A549人肺癌細(xì)胞株CD133+的腫瘤干細(xì)胞中DDR相關(guān)的基因表達(dá)上調(diào)，較強(qiáng)的DDR能力是肺癌干細(xì)胞難以清除的原因[16]。因此，阻礙DDR速度是目前突破化學(xué)治療耐藥的重要途徑之一。在非小細(xì)胞肺癌中，奧斯替尼可降低肺癌細(xì)胞DDR速度，從而增加放射治療或致DNA損傷化學(xué)治療藥物的敏感性，減低腫瘤細(xì)胞耐藥率[17]。在白血病細(xì)胞中，西達(dá)本胺能夠下調(diào)DNA修復(fù)相關(guān)基因，維持γ-H2AX水平以及增加細(xì)胞對蒽環(huán)類化學(xué)治療藥物的敏感性[18]。STAT3與DNA損傷修復(fù)密切相關(guān)，在敲除STAT3基因的小鼠胰腺B細(xì)胞中DNA損傷增加[9]。在食管癌及膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中均發(fā)現(xiàn)抑制STAT3活性可抑制DNA損傷修復(fù)，提高腫瘤對放射治療及化學(xué)治療的敏感性[10-11]。本實驗也證實了在AML細(xì)胞中，STAT3抑制劑可阻礙DDR。

本實驗初步證實Stattic可抑制AML細(xì)胞株U937和HL60的增殖，促進(jìn)其凋亡。阻滯細(xì)胞周期于S、G2/M期及誘發(fā)DNA雙鏈斷裂、阻礙DDR是抑制增殖、促進(jìn)凋亡的可能機(jī)制。Stattic通過影響哪些DNA修復(fù)通路抑制DDR需要進(jìn)一步研究證明。

參考文獻(xiàn)

[1]

Yeung CCS， Radich J Predicting chemotherapy resistance inAML. Curr Hematol Malig Rep， 2017， 12（6）：530-536.

[2]

Watts JM， Tallman M S.Acute promyelocytiC leukemia： what isthe new standard of care？ Blood Rev， 2014. 28（5）：205-212.

[3]

Wang L，Jiang Z，Huang D，Duan J，Huang C，Sullivan S，Vali K，Yin Y，Zhang M，Wegrzyn J， Tian XC， Tang Y. JAK/STAT3 regulated global gene expression dynamics during late—stage reprogramming process.BMC Genomics，2018，19（1）： 183.

[4] Wu P，Wu D，Zhao L，Huang L，Shen G，Huang J，Chai Y.Prognostic role of STAT3 in s01id tumors：a systematic reviewand meta-analysis.0ncotarget，2016，7（15）：19863一l9883.

[5] Bmserud O，Nepstad I，Hauge M，Hat“eld KJ，Reikvam H..STAT3 as a possible therapeutic target in human malignancies：lessons fmm acute myeloid leukemia.Expert Rev Hematol，2014，8（1）：29141.

[6] 黃成雙，譚梅，張相梅，羅茜，田潤梅，蘇瓊，吳柳松，陳艷.STAT3基因在急性髓系白血病中的表達(dá)及臨床意義.中國實驗血液學(xué)雜志，2019，27（1）：45-51.

[7] ShiY，ZhangZ，QuX，ZhuX，ZhaoL，WeiR，GuoQ，SunL，YinX，ZhangY，LiX Roles of STAT3inleukemia（Review）.Int J Oncol. 2018. 53 （1） ： 7-20.

[8]Siveen KS. Sikka S. Surana R. Dai X. Zhang J. Kumar AP，Tan BK. Sethi G， Bishayee A. Targeting the STAT3 signalingpathway in cancer ： role of synthetic and natural inhihitors. Bioc-him Biophys Acta. 2014. 1845 （ 2 ） ： 136-154.

[9]De Groef S. Renmans D. Cai Y. Leuckx G. Roels S. Staels W.Gradwohl G， Baeyens L， Heremans Y. Martens GA. De Leu N .Sojoodi M. Van de Casteele M， Heimberg H. STAT3 modulatesbeta-cell cycling in injured mouse pancreas and protects againstDNA damage. Cell Death Dis. 2016. 7 （ 6 ） ： e2272.

[10]Zhang Q. Zhang C， He J， Guo Q， Hu D， Yang X， Wang J，Kang Y， She R， Wang Z， Li D， Huang C， Ma Z. Mao W，Zhou X. Xiao C . Sun X， Ma J. STAT3 inhibitor stattic enhancesradiosensitivity in esophageal squamous cell carcinoma. TumourBiol. 2015. 36 （ 3 ） ： 2135-2142.

[11]Han TJ， Cho BJ. Choi EJ. Kim DH， Song SH， Paek SH， KimIA. Inhibition of STAT3 enhances the radiosensitizing effectof temozolomide in glioblastoma cells in vitro and in vivo. JNeurooncol. 2016. 130（1）：89-98.

[12] TakagiM.DNA damage response and hematological malignancy.World J Biol Chem. 2017. 106（3）：345-356.

[13] Kanna R. Choudhary G，Ramachandra N，Steidl U，VermaA. Shastri A.s'rAT3 inhibition as a therapeutic strategy forleukemia. Leuk Lymphoma， 2017， 59（9）：2068-2074.

[14]包蓓艷，余雄偉，陳爭躍，聶振禹.JAK/STAT信號通路與組織器官纖維化的相關(guān)性研究進(jìn)展.新醫(yī)學(xué)，2014， 45（11）：710-713

[15] Wang QE. DNA damage responses in cancer stem cells：implications for cancer therapeutic strategies. World J BiolChem， 2015.6（3）：57-64.

[16] Desai A， Webb B， Gerson SL. CD133+ cells contribute toradioresistance via altered regulation of DNA repair genes in human lung cancer cells. Radiother Oncol. 2014. 110 （ 3 ） ： 538-545.

[17]Wu S， Zhu L. Tu L. Chen S， Huang H， Zhang J. Ma S， ZhangS. AZD9291 increases sensitivity to radiation in PC-9-IR cellsby delaying DNA damage repair after irradiation and inducingapoptosis. Radiat Res. 2018. 189 （ 3 ） ： 283-291.

[18] Li Y. Wang Y， Zhou Y. Li J， Chen K. Zhang L， Deng M，Deng S， Li P， Xu B. Cooperative effect of chidamide andchemotherapeutic drugs indut：e apoptosis by DNA damageaccumulation and repair defects in acute myeloid leukemia stemand progenitor cells. Clin Epigenetics . 2017 ， 9 ： 83.