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    分泌性中耳炎患者耳積液中miR-146a和miR-155的表達(dá)研究 ???

    2019-07-06 10:44:54王慶亮徐錦
    新醫(yī)學(xué) 2019年8期
    關(guān)鍵詞:中耳炎積液試劑盒

    王慶亮 徐錦

    【摘要】目的 探討分泌性中耳炎(SOM)患者耳積液中微小核糖核酸-146a(miR-146a)和miR-155的表達(dá)及臨床意義。方法 58例SOM患者作為研究對(duì)象(SOM組),另選取30名體檢健康者作為對(duì)照組。應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)2組血漿及SOM組耳積液miR-146a和miR-155表達(dá)情況,應(yīng)用ELISA檢測(cè)2組血漿及SOM組耳積液IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10水平,并對(duì)miR-146a、miR-155與輔助性T淋巴細(xì)胞1(Th1)、Th2細(xì)胞比例以及Th1/Th2進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果 與對(duì)照組相比,SOM組血漿、耳積液中miR-146a、miR-155、CD4+ Th1、CD4+ Th2、Th1/Th2、IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10、IFN-γ/IL-4均升高(P均< 0.05);與SOM組血漿值相比,SOM組耳積液中miR-146a、miR-155、CD4+ Th1、CD4+ Th2、Th1/Th2、IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10、IFN-γ/IL-4表達(dá)水平均升高(P均< 0.05);Pearson相關(guān)分析顯示:SOM組患者耳積液miR-146a、miR-155水平與CD4+ Th1細(xì)胞比例、CD4+ Th2細(xì)胞比例、Th1/Th2均呈正相關(guān),耳積液miR-146a、miR-155表達(dá)與IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10呈正相關(guān)。結(jié)論 SOM患者耳積液中miR-146a和miR-155高表達(dá),miR-146a、miR-155可能通過影響Th1/Th2平衡而促進(jìn)炎癥進(jìn)展。

    【關(guān)鍵詞】 分泌性中耳炎;微小核糖核酸-146a;微小核糖核酸-155;耳積液

    【Abstract】ObjectiveTo investigate the expression levels and clinical significance of microRNA-146a (miR-146a) and microRNA-155 (miR-155) in the ear effusion of patients with secretory otitis media (SOM).? Methods A total of 58 SOM patients were assigned into the SOM group, and 30 healthy subjects were recruited into the control group. The expression levels of miR-146a and miR-155 in the plasma between two groups and in the auricular effusion in the SOM group were quantitatively measured by real-time fluorescence quantitative PCR. The expression levels of interleukin-2 (IL-2), interferon-γ(IFN-γ), interleukin-4 (IL-4) and interleukin-10 (IL-10) in the plasma between two groups and in the auricular effusion in the SOM group were measured by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The correlation between miR-146a, miR-155, Th1 and Th2 proportion and Th1/Th2 was analyzed.? ResultsCompared with the control group, the expression levels of miR-146a, miR-155, CD4+ Th1, CD4+ Th1, Th1/Th2, IL-2, IFN-γ, IL-4, IL-10, IFN-γ/IL-4 were significantly up-regulated in the SOM group (all P < 0.05). Compared with plasma expression of the SOM group, the expression levels of miR-146a, miR-155, CD4+ Th1, CD4+ Th2, Th1/Th2, IL-2, IFN-γ, IL-4, IL-10, IFN-γ/IL-4 in the auricular effusion were up-regulated (all P < 0.05).Pearsons correlation analysis demonstrated that the expression levels of miR-146a and miR-155 were positively correlated with the proportion of CD4+ Th1, CD4+ Th2 and Th1/Th2. The expression levels of miR-146a and miR-155 were positively correlated with IL-2, IFN-γ, IL-4 and IL-10 in the auricular effusion.? Conclusions The miR-146a and miR-155 are highly expressed in the ear effusion of SOM patients. The miR-146a and miR-155 can promote the progression of inflammation probably by affecting the balance of Th1/Th2.

    【Key words】Secretory otitis media;Micro RNA-146a;Micro RNA-155;Ear effusion

    分泌性中耳炎(SOM)是耳鼻喉科常見疾病之一,以中耳積液及聽力下降為主要特征,可造成患者聽力損傷,影響語言發(fā)展,甚至永久性失聰[1-2]。由于耳痛不明顯,至聽力受影響才就診,多延誤最佳治療時(shí)機(jī)。有研究表明,輔助性T淋巴細(xì)胞1(Th1)/Th2失衡可能是引起SOM的原因之一[3]。而微小RNA-146a(miR-146a)、miR-155已被證實(shí)在某些免疫性炎癥疾病或炎性環(huán)境中過表達(dá),但miR-146a、miR-155在分泌性中耳炎中表達(dá)以及與Th1/Th2平衡的關(guān)系研究者較少[4-5]。本研究主要比較SOM患者血漿、耳積液與健康者血漿中miR-146a、miR-155水平,并分析miR-146a、miR-155與Th1/Th2相關(guān)性,為SOM發(fā)病機(jī)制提供理論依據(jù)。

    對(duì)象與方法

    一、研究對(duì)象

    選取2016年9月至2018年9月于本院耳鼻喉科就診的SOM患者58例作為研究對(duì)象,其中男27例、女31例,年齡(36.28±4.39)歲;單耳積液33例,雙耳積液25例;黏液性28例,漿液性30例。納入標(biāo)準(zhǔn):有明顯聽力減退者;發(fā)病時(shí)間≥21 d;經(jīng)臨床檢查、鼓氣耳鏡檢查、聲導(dǎo)抗測(cè)試、電測(cè)聽及診斷性鼓膜穿刺確診SOM。排除標(biāo)準(zhǔn):合并鼻咽部腫瘤、鼻咽癌或鼻咽部占位性病變等;合并全身系統(tǒng)系疾病;中途退出研究者。另選取同時(shí)期體檢健康者30名,排除SOM病史,經(jīng)體檢者同意收集血漿標(biāo)本作為對(duì)照。其中男13例、女17例,年齡(36.37±4.42)歲。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)同意,患者均簽署知情同意書。

    二、方 法

    1.樣本收集

    血漿標(biāo)本:所有研究對(duì)象于晨起空腹抽取肘靜脈血5 ml置于裝有枸櫞酸鈉抗凝劑的采血管中,平均分成2份,1份3 000轉(zhuǎn)/分 -4℃離心20 min,取上清置于-80℃冰箱保存,現(xiàn)用現(xiàn)融,另1份直接置于-80℃冰箱保存。

    耳積液標(biāo)本:SOM患者外耳道經(jīng)常規(guī)消毒,鼓膜表面麻醉,無菌條件下于鼓膜前下象限穿刺抽取耳積液0.1 ml,封口標(biāo)記,置于-80℃冰箱保存,以供后續(xù)使用。

    2.實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)法檢測(cè)血漿、耳積液中miR-146a和miR-155表達(dá)

    采用qRT-PCR法測(cè)定對(duì)照組血漿、SOM組血漿、耳積液中miR-146a和miR-155表達(dá)情況。取上述血漿、耳積液樣本,按照Trizol LS(賽默飛世爾科技)試劑盒說明書操作提取血清總RNA,按照Bio Rad逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(賽默飛世爾科技)操作步驟將2 μgRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,之后按照SYBR Green PCR master mix試劑說明配反應(yīng)體系并加樣。qRT-PCR反應(yīng)體系共為20 μl:SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(2×)10 μl,cDNA 2.0 μl,上下游引物各0.8 μl,ROX Reference Dye Ⅱ(50×)0.4 μl,雙蒸水 6.0 μl。完成后將其放入熒光定量PCR儀上進(jìn)行反應(yīng),程序設(shè)定為:95℃預(yù)熱1 min,95℃ 15 s,

    60℃ 30 s,72℃ 15 s,以上三步驟共循環(huán)40次。miR-146a和miR-155均以U6為內(nèi)參基因,引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,引物設(shè)計(jì)見表1。反應(yīng)結(jié)束后對(duì)Ct值進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-146a和miR-155相對(duì)表達(dá)量。

    3.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)研究對(duì)象外周血CD4+細(xì)胞Th1、Th2細(xì)胞比例

    取抗凝靜脈血,用淋巴細(xì)胞分離液分離單個(gè)核細(xì)胞,3 000轉(zhuǎn)/分離心30 min,上中層交界處為淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞混合液,3 000轉(zhuǎn)/分離心30 min,保留沉淀為單核細(xì)胞,均加入異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的鼠抗人CD4單克隆抗體20 μl,避光培育15 min,分別添加藻紅蛋白(PE)標(biāo)記的IFN-γ抗體、IL-4抗體20 μl,避光培育30 min,離心后棄上清,置于流式細(xì)胞儀下檢測(cè)Th1、Th2細(xì)胞比例。上機(jī)前常規(guī)對(duì)流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè),控制儀器各項(xiàng)指標(biāo)在質(zhì)控允許值內(nèi),每份檢測(cè)標(biāo)本獲取設(shè)門內(nèi)10 000個(gè)細(xì)胞,檢測(cè)后所得數(shù)據(jù)以Listmode文件形式保存。

    4.細(xì)胞因子檢測(cè)

    取血漿、耳積液標(biāo)本置于冰上解凍,恢復(fù)室溫后采用ELISA試劑盒檢測(cè)其中IL-2、IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-5、IL-10水平,檢測(cè)試劑盒分別為人IL-2 ELISA試劑盒(上海鈺博生物科技有限公司)、IFN-γELISA試劑盒(上海齊一生物科技有限公司)、人IL-4 ELISA試劑盒(南京森貝伽生物科技有限公司)、人IL-10 ELISA試劑盒(上海康朗生物科技有限公司)。嚴(yán)格參照試劑盒操作說明書進(jìn)行操作。

    三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    采用SPSS 17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,計(jì)量資料符合正態(tài)分布的均以表示,組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),組內(nèi)比較采用配對(duì)t檢驗(yàn),通過Pearson法進(jìn)行相關(guān)性分析,P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    結(jié)果

    一、SOM組和對(duì)照組miR-146a和miR-155水平比較

    與對(duì)照組相比,SOM組血漿、耳積液中miR-146a、miR-155表達(dá)水平均升高(P均< 0.05);與SOM組血漿中miR-146a、miR-155表達(dá)水平相比,耳積液中miR-146a、miR-155表達(dá)水平均升高(P均< 0.05),見表2。

    二、SOM組和對(duì)照組CD4+細(xì)胞Th1、Th2細(xì)胞比例、Th1/Th2比較

    與對(duì)照組相比,SOM組血漿、耳積液中CD4+ Th1比例、CD4+ Th2比例、Th1/Th2表達(dá)水平均升高(P均< 0.05);與SOM組血漿標(biāo)本相比,SOM組耳積液中CD4+ Th1比例、CD4+ Th2比例、Th1/Th2表達(dá)水平均升高(P均< 0.05),見表3。

    三、SOM組和對(duì)照組IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10水平比較

    與對(duì)照組相比,SOM組血漿、耳積液中IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10、IFN-γ/IL-4均升高(P均< 0.05);與SOM組血漿標(biāo)本相比,SOM組耳積液標(biāo)本中IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10、IFN-γ/IL-4均升高(P均< 0.05),見表4。

    四、SOM組耳積液miR-146a、miR-155與CD4+ Th1、CD4+ Th2細(xì)胞比例、Th1/Th2及細(xì)胞因子相關(guān)性分析

    Pearson相關(guān)分析顯示,SOM患者耳積液中miR-146a、miR-155表達(dá)與CD4+ Th1細(xì)胞比例、CD4+ Th2細(xì)胞比例、Th1/Th2、IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10均呈正相關(guān)(P均< 0.05),見表5。

    討論

    SOM主要表現(xiàn)為中耳積液及聽力下降,大部分患者可自愈,或經(jīng)治療后好轉(zhuǎn),但仍有10%左右患者發(fā)展為慢性中耳炎且反復(fù)發(fā)作,嚴(yán)重影響患者生存質(zhì)量。目前關(guān)于SOM的病因及發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚。有研究表明,咽鼓管功能障礙、感染、自身免疫疾病等均可造成SOM[7]。隨著免疫學(xué)的深入研究,Th1/Th2失衡在諸多炎性疾病中發(fā)揮作用[3]。微小核糖核酸是機(jī)體非編碼微小RNA,可通過調(diào)節(jié)靶基因mRNA的翻譯以及翻譯后轉(zhuǎn)錄調(diào)控靶基因的蛋白表達(dá),在炎性疾病中發(fā)揮重要作用。有報(bào)道稱,miR-146a、miR-155參與炎癥反應(yīng),但miR-146a、miR-155在SOM中以及與Th1/Th2關(guān)系尚不清楚[4-5]。

    miR-146a是由miR-146經(jīng)加工后產(chǎn)生的,位于5q34[8]。研究表明,miR-146a可介導(dǎo)炎癥反應(yīng)[9-11]。

    本研究中,SOM患者血漿中miR-146a水平顯著高于健康對(duì)照者血漿中含量,提示miR-146a水平可能與SOM的發(fā)病密切相關(guān),而SOM患者耳積液中miR-146a表達(dá)量又顯著高于患者血漿中含量,提示耳積液中miR-146a水平對(duì)SOM的發(fā)病更為敏感。miR-155是一個(gè)典型的多功能微小RNA,位于非編碼區(qū)基因BIC內(nèi),在免疫、炎癥的調(diào)控中發(fā)揮重要作用[12-13]。譚玉軍等[14]研究表明,miR-155在脂多糖誘導(dǎo)的RAW2647巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)中高表達(dá),而巨噬細(xì)胞發(fā)揮促炎作用也是引起SOM的重要因素,據(jù)此猜測(cè),miR-155可能在SOM患者耳積液中也有類似表達(dá)。本研究中,健康對(duì)照者血漿、SOM患者血漿、SOM患者耳積液中miR-155水平依次升高,提示miR-146a水平升高可能與SOM的發(fā)病密切相關(guān),且SOM患者耳積液較血漿更能體現(xiàn)SOM病情嚴(yán)重程度。

    Th細(xì)胞間的平衡狀態(tài)與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[15],Th1細(xì)胞主要介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答,分泌IL-2、IFN-γ等細(xì)胞因子,促進(jìn)細(xì)胞毒T細(xì)胞的殺傷作用,激活巨噬細(xì)胞殺滅細(xì)胞病原體[16]。Th2主要介導(dǎo)體液免疫,分泌IL-4、IL-10等細(xì)胞因子,抑制細(xì)胞免疫應(yīng)答,使Th1、Th2處于免疫平衡狀態(tài),集中力量清除外來抗原,是體內(nèi)體液免疫及細(xì)胞免疫間重要的調(diào)節(jié)樞紐,Th1/Th2失衡則導(dǎo)致各種炎癥發(fā)生[17-18]。本研究中,SOM患者血漿、耳積液中CD4+ 細(xì)胞中Th1細(xì)胞比例、Th2細(xì)胞比例均顯著高于健康對(duì)照者血漿中含量,與Th1細(xì)胞相比,Th2細(xì)胞增長(zhǎng)幅度較少,導(dǎo)致Th1/Th2升高。同時(shí)Th1相關(guān)細(xì)胞因子IL-2、IFN-γ以及Th2相關(guān)細(xì)胞因子IL-4I、L-10水平顯著升高,提示SOM患者存在較為復(fù)雜的炎癥反應(yīng),促炎因子與抑炎因子均大量產(chǎn)生。此外,IFN-γ/IL-4顯著升高,提示SOM患者Th1/Th2失衡,呈Th1優(yōu)勢(shì)。本研究進(jìn)一步表明,SOM患者血漿、耳積液中miR-146a、miR-155與Th1細(xì)胞比例、Th2細(xì)胞比例、Th1/Th2以及細(xì)胞分泌因子IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10呈正相關(guān),推測(cè)miR-146a、miR-155可能通過影響Th1/Th2平衡參與SOM發(fā)生發(fā)展進(jìn)程,但miR-146a、miR-155如何影響Th1/Th2平衡機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。本研究也存在一定不足,因?yàn)門h1、Th2并沒有標(biāo)志性的抗體,本研究用IFN-γ、IL-4分別代表Th1、Th2細(xì)胞比例,但I(xiàn)FN-γ、IL-4并非只由CD4+ 細(xì)胞產(chǎn)生,CD8+等T細(xì)胞亦可產(chǎn)生,只能代表一種趨勢(shì)。

    綜上所述,SOM患者耳積液中miR-146a、miR-155高表達(dá),可能通過影響Th1/Th2平衡參與SOM發(fā)病過程。

    參 考 文 獻(xiàn)

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    (收稿日期:2019-03-18)

    (本文編輯:楊江瑜)

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