神經(jīng)病理性疼痛大鼠不同大小DRG神經(jīng)元興奮性分型的研究*

譚朝陽，周穎，屈祖衛(wèi)，張萌，陳沁怡，田俊杰，許珍珍，鄧詩瑜，李麗，馬克濤，司軍強

[1.石河子大學醫(yī)學院 生理教研室（新疆地方與民族高發(fā)病教育部重點實驗室），新疆 石河子 832000；2.石河子大學藥學院 藥理系，新疆 石河子 832002]

神經(jīng)病理性疼痛是一種慢性疼痛，持續(xù)6 個月以上，它通常是由炎癥、燒傷、軀體感覺系統(tǒng)的疾病或功能紊亂等造成的。根據(jù)2011年的流行病學調(diào)查顯示，神經(jīng)病理性疼痛的患病率為3.3%～8.2%[1]。目前，坐骨神經(jīng)分支選擇性損傷（spared nerve injury,SNI）模型已經(jīng)被廣泛用于神經(jīng)病理性疼痛的研究[2-4]，該模型能較穩(wěn)定地改變實驗動物的行為學，且能造成與臨床神經(jīng)病理性疼痛相似的綜合癥狀。背根神經(jīng)節(jié)（dorsal root ganglion,DRG）神經(jīng)元作為外周感覺傳入的第一級神經(jīng)元，在痛覺的產(chǎn)生和傳遞中發(fā)揮重要作用。研究表明，DRG 神經(jīng)元大小不一，其直徑的大小與其功能間存在關系。其中，小直徑的DRG 神經(jīng)元由無髓鞘的C 纖維（C）和薄髓鞘的A 纖維（Aδ）組成，傳遞傷害性刺激、熱刺激和機械刺激產(chǎn)生的感覺信號，而大直徑的DRG 神經(jīng)元由有髓鞘的A 纖維（Aβ）組成，傳遞非傷害性的刺激。不同大小神經(jīng)細胞間的功能差異，可能是由神經(jīng)元的化學物質、解剖、電生理特性及神經(jīng)元對疼痛信息處理模式的差異共同造成的[5-6]。興奮性是衡量神經(jīng)細胞功能的最基本指標，人們通常用動作電位發(fā)放頻率的高低來評價細胞的興奮性，發(fā)放頻率越高，興奮性也就越高，反之亦然。有研究者根據(jù)發(fā)放頻率和注入電流強度之間的關系將DRG 分為3 種興奮類型[7]。基于此，本實驗研究神經(jīng)病理性疼痛狀態(tài)下DRG 神經(jīng)元興奮性分型的變化，并在此基礎上分析興奮性分型與細胞大小的關系，希望能從興奮性分型和細胞大小的角度對神經(jīng)病理性疼痛的產(chǎn)生機制進行探討。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

清潔級SD 大鼠75 只，體重180～220 g，雌雄不拘，由新疆醫(yī)科大學動物實驗中心提供（動物編號：SCXK 新2003-0001）。將大鼠隨機分成Control 組、Sham 組和SNI 組。其中，Control 組5 只（行為學實驗5 只），Sham 組35 只（行為學實驗5 只，膜片鉗實驗30 只），SNI 組35 只（行為學實驗5 只，膜片鉗實驗30 只）。

1.2 主要試劑和儀器

胰蛋白酶Type Ⅲ、膠原酶Type IA、胰蛋白酶抑制劑、DMEM 培養(yǎng)基（購自美國Sigma 公司），Multi Clamp 700B 膜片鉗放大器（美國Axon 公司），P-2000 微電極拉制儀（美國Sutter 公司），Digidata 1550A 數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)（美國Axon 公司），MP-225 微操縱儀（美國Sutter 公司），UGO BASILE 37370 全自動熱輻射刺激儀（意大利Gemonio 公司）。

1.3 動物模型復制

參照DECOSTERD 和RICHNER 等[2，8]的方法，測量并記錄各組大鼠的體重，用3%戊巴比妥鈉（3 g 戊巴 比妥鈉粉劑溶入100 ml 生理鹽水）按照0.17 ml/100 g的劑量麻醉各組大鼠。取俯臥位固定于鼠板上，切口處附近用剃毛刀剃毛暴露皮膚，碘伏消毒鋪巾。于左后腿外側近髂后上棘處平行于股骨劃開皮膚，順肌肉紋理鈍性分離股二頭肌，用玻璃分針暴露并分離坐骨神經(jīng)的3 個分支（脛神經(jīng)、腓總神經(jīng)、腓腸神經(jīng)）。用3-0 醫(yī)用真絲編織線分別結扎脛神經(jīng)和腓總神經(jīng)，系緊后在結扎遠端切斷，保留2～4 mm 的遠側殘端，分層縫合肌肉和皮膚。動物單籠分開飼養(yǎng)用于實驗。Sham 組大鼠麻醉及暴露神經(jīng)的方法同上，用玻璃分針分離3 個分支后，不做任何處理，隨即分層縫合肌肉和皮膚，單籠飼養(yǎng)。

1.4 記錄熱縮足潛伏期

參照本實驗室前期研究[9-10]，在模型復制前1 天、模型復制后第1、7、14 和21 天對Control 組、Sham組及SNI 組大鼠進行熱縮足潛伏期的測試。設定UGO BASILE 37370 全自動熱輻射刺激儀參數(shù)：紅外線強度IR 值為50，時間上限為30 s。將大鼠放置于玻璃面板上的有機玻璃觀察盒內(nèi)，移動玻璃板下的紅外線發(fā)射器。瞄準大鼠后肢足心部位照射，按動計時開關。大鼠受照射后肢抬離面板，儀器感應并停止記時，此時記錄到的時間為大鼠的熱縮足潛伏期，將其作為疼痛閾值的指標。間隔30 min 待大鼠安靜后，進行下一次測量。每只大鼠測量3 次，取平均值。

1.5 記錄冷刺激抬足時間

在熱縮足潛伏期測試結束30 min后，待大鼠安靜，進行冷刺激抬足時間的測試。參照2014年NORCINI等[11]的方法，將大鼠放置在自制的觀察籠內(nèi)，待其安靜，小心地將0.1 ml 丙酮滴到大鼠左后足底外側的皮膚上，立即用計時器計時。大鼠出現(xiàn)抬足的現(xiàn)象，直至大鼠將左后足放下時，停止計時。此時記錄到的時間就是大鼠的冷刺激抬足時間。間隔30 min 待大鼠安靜后，進行下一次測量。測量3 次，取平均值。所有測量都在當日18：00～20：00 進行。

1.6 急性分離消化DRG 神經(jīng)元

在本實驗室前期研究[12-13]的基礎上略做改進，用頸椎脫臼法處死大鼠，粗剪剪開其背部皮膚，沿脊柱兩側取出L4～L6 段脊柱。將取出的脊柱沿矢狀面對半剖開，放入盛有氧飽和的細胞外液中（細胞外液成分：NaCl 150 mmol/L，KCl 5 mmol/L，MgCl21 mmol/L，HEPES 10 mmol/L，D-glucose 10 mmol/L，Sucrose 20 mmol/L，CaCl23.32 mmol/L，用1 mol/L 的NaOH 調(diào)節(jié)pH 值為7.35～7.45，蔗糖調(diào)節(jié)溶液的滲透壓為772.5～849.75 kPa）。在10 倍顯微鏡下，于剖開的左側椎管內(nèi)側去除脊髓，用游絲鑷剝除結締組織被膜，逐個取出椎間孔中的DRG 及其相連的神經(jīng)根。用精細角膜剪和游絲鑷仔細剪除與DRG 相連的神經(jīng)根。將取出的DRG 放入直徑為4 cm 的玻璃皿中，用精細角膜剪將DRG 充分剪碎，用膠頭滴管將剪碎的組織轉移入15 ml 的離心管中，隨后加入3 ml 配制好的消化酶溶液（胰蛋白酶Type Ⅲ0.24 mg/ml 和膠原酶Type IA 0.6 mg/ml，溶劑為DMEM 培養(yǎng)基）。將EP 管放入37℃水浴鍋中，消化2～4 min，邊消化邊吹打，避免產(chǎn)生氣泡。消化結束后立即加入少量胰蛋白酶抑制劑終止消化。用膠頭滴管將細胞懸液滴到膜片鉗專用的細胞培養(yǎng)皿中，靜置待細胞貼壁，待細胞貼壁充分后，加入氧飽和的細胞外液。

1.7 全細胞膜片鉗記錄

參照本實驗室原有方法[12-14]，將盛有急分離DRG神經(jīng)元的細胞培養(yǎng)皿放置在膜片鉗顯微鏡載物臺上，100 倍顯微鏡下選取膜表面光滑、整體透亮、狀態(tài)良好的DRG 細胞作為實驗對象。選用Sutter Instrument 公司帶芯的硼硅酸鹽玻璃毛坯，使用P-2000 微電極拉制儀拉制成微電極，實驗選取電阻值為2～8 MΩ 的微電極，充灌電極內(nèi)液（K-Gluconate 130 mmol/L，NaCl 10 mmol/L，MgCl2·6 H2O 1.2 mmol/L，CaCl22 mmol/L，EGTA 5 mmol/L，HEPES 10 mmol/L，D-Glucose 7.5 mmol/L。用1 mol/L 的KOH 調(diào)節(jié)pH 值為7.35～7.45，蔗糖調(diào)節(jié)溶液的滲透壓為772.5～849.75 kPa），將充灌好細胞內(nèi)液的玻璃微電極連接在微操縱儀上，用5 ml 空注射器給予一定正壓。操作微操縱儀，使微電極尖端靠近并接觸細胞，接觸細胞的瞬間可以從膜測試窗口觀察到電極電阻略微升高。隨后撤去正壓，用嘴吸法給予微電極內(nèi)部一定負壓，同時將鉗制電位逐步調(diào)節(jié)至-60 mV，待細胞與電極間形成GΩ 封接后，用嘴吸破膜法或同時輔助以電擊破膜法破膜（膜片鉗放大器提供的Zap 功能）。破膜后，阻值仍維持在GΩ 以上的細胞用于實驗。

在顯微鏡下記錄細胞直徑。在I=0 模式下記錄細胞的靜息電位，在電壓鉗模式下（鉗制電位-60 mV），記錄膜電容。在電流鉗模式下，給予細胞一系列斜坡刺激記錄動作電位。記錄的信號經(jīng)Multi Clamp 700B膜片鉗放大器放大，給予10 kHz 的濾波后，由Axon Digidata 1550A 數(shù)模/模數(shù)轉換器轉換，采樣頻率為10～20 kHz。

1.8 統(tǒng)計學方法

熱輻射刺激縮足潛伏期測量值和冷刺激抬足時間的結果采用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件進行分析，全細胞膜片鉗數(shù)據(jù)應用Clampex 10.6 軟件采集記錄，用Clampfit 10.6 軟件進行測量分析，用SPSS 17.0 軟件進行統(tǒng)計分析，所有數(shù)據(jù)最終運用GraphPad Prism 5.0 軟件進行繪圖。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，不同時間點的比較采用重復測量設計的方差分析，其余計量資料3 組及以上的比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，計數(shù)資料以率（%）表示，比較采用χ2檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 行為學測試結果

Control 組、Sham 組及SNI 組術前1 天、術后第1、7、14 和21 天的熱縮足潛伏期的比較采用重復測量設計的方差分析，結果：①不同時間點熱縮足潛伏期有差異（F=427.215，P=0.000）；②3 組間熱縮足潛伏期有差異（F=99.294，P=0.000）；③3 組間熱縮足潛伏期隨時間的變化趨勢無差異（F=0.007，P=0.993）。見表1 和圖1。

Control 組、Sham 組及SNI 組術前1 天、術后第1、7、14 和21 天的冷刺激抬足時間的比較采用重復測量設計的方差分析，結果：①不同時間點冷刺激抬足時間有差異（F=33.984，P=0.000）；②3 組間冷刺激抬足時間有差異（F=2.940，P=0.024）；③3 組間冷刺激抬足時間隨時間的變化趨勢有差異（F=78.158，P=0.000）。說明3 組的不同處理方式對冷刺激抬足時間的影響有差異。見表2 和圖2。

表1 模型復制后熱縮足潛伏期的變化 （s，±s）

表1 模型復制后熱縮足潛伏期的變化 （s，±s）

組別 n術前1 天 術后第1 天 術后第7 天 術后第14 天 術后第21 天Control 組 5 25.3±3.3 24.3±3.4 25.3±3.6 24.7±3.9 25.8±3.4 Sham 組 35 26.1±3.5 25.2±3.6 25.6±4.1 24.1±3.9 25.4±3.4 SNI 組 35 25.9±3.6 23.3±3.8 26.4±3.1 24.2±3.2 25.3±3.7

圖1 模型復制后熱縮足潛伏期的變化

2.2 SNI 大鼠DRG 神經(jīng)元的興奮性分型發(fā)生改變

為明確正常大鼠DRG 神經(jīng)元的興奮性分型情況，運用全細胞膜片鉗技術，在電流鉗模式下給予記錄電極內(nèi)一個斜坡刺激（時長1 000 ms，電流強度0～2 500 pA），再根據(jù)細胞對注入刺激的不同反應將細胞分為3 種類型。1 型細胞：在給予較小強度（50～500 pA）刺激時就能產(chǎn)生較低頻率的動作電位，并且隨著電流強度增加動作電位頻率逐漸增加。2 型細胞：在給予較小強度的刺激時，不產(chǎn)生動作電位；但在給予較高電流強度（1 500～2 500 pA）刺激時，出現(xiàn)較高頻率的動作電位。3 型細胞：興奮性較低，不產(chǎn)生動作電位（見圖3）。結果表明，正常大鼠DRG神經(jīng)元存在3 種興奮性類型的細胞，進一步對3 種類型細胞的主被動模特性進行分析（見表3）。方差分析結果顯示：1、2 和3 型細胞的靜息電位比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。1、2 和3 型細胞直徑比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），進一步兩兩比較，1 型 細胞直徑小于3 型細胞直徑（P＜0.05），2 型細胞的直徑與其他兩種類型細胞比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。1、2 和3 型細胞膜電容比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），進一步兩兩比較，1 型細胞的膜電容低于3 型細胞的膜電容（P＜0.05）。

表2 模型復制后冷刺激抬足時間的變化 （s，±s）

表2 模型復制后冷刺激抬足時間的變化 （s，±s）

組別 n術前1 天 術后第1 天 術后第7 天 術后第14 天 術后第21 天Control 組 5 2.62±0.82 2.44±0.76 2.83±0.86 2.53±0.88 2.71±0.77 Sham 組 35 2.59±1.30 3.21±1.34 2.82±1.21 2.42±1.32 2.79±1.37 SNI 組 35 2.61±1.46 6.52±1.33 8.79±1.27 11.62±1.45 12.81±1.22

圖2 模型復制后冷刺激抬足時間的變化

為明確SNI 復制模型前后，大鼠DRG 神經(jīng)元興奮性分型如何變化，本研究運用全細胞膜片鉗技術，在電流鉗模式下對463 個DRG 細胞（Sham 組205 個，SNI 組258 個）進行記錄。根據(jù)興奮性的3 種類型進一步分類，可以看出：Sham 組中，1、2 和3 型細胞的構成比分別為44.39%、4.88%和50.73%；而SNI 組中，相應的數(shù)據(jù)為54.26%、7.36%和38.37%。兩組間各型細胞的構成比有差異（P＜0.05），SNI 組的細胞構成比與Sham 組比較，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=7.340，P=0.025），1 和2 型細胞構成比增加，而3 型細胞的構成比降低。見圖4。

圖3 SD 大鼠DRG 神經(jīng)元興奮性分型

表3 SD 大鼠不同興奮性類型DRG 的基本特性 （±s）

表3 SD 大鼠不同興奮性類型DRG 的基本特性 （±s）

注：?與3 型比較，P＜0.05

分型 直徑/μm 靜息電位 /mV 膜電容/pF 1 型 27.34±4.99?-50.87±7.10 32.54±13.44?2 型 30.25±5.83-53.13±10.04 35.87±18.44 3 型 30.40±8.97-50.88±11.35 40.21±22.94 F 值 4.388 0.447 3.803 P 值 0.014 0.640 0.024

2.3 SNI 模型復制前后不同大小DRG 神經(jīng)元興奮性分型的變化

為探討正常SD 大鼠DRG 神經(jīng)元興奮性分型與直徑之間的關系，本研究比較Control 組內(nèi)不同大小神經(jīng)元各興奮性分型細胞的構成比。細胞按直徑大小分為：小細胞（直徑＜25 μm）、中細胞（25 μm ≤直徑＜40 μm）和大細胞（直徑≥40 μm），再按照興奮性分型進一步分類。其中，小細胞1、2 和3 型細胞的構成比分別為44.44%、2.22%和53.33%；中細胞1、2 和3 型細胞的構成比分別為50.00%、5.88%和44.12%；大細胞1、2 和3 型細胞的構成比分別為12.50%、4.17%和83.33%?？梢钥闯?，中、小細胞3 型細胞的構成比與大細胞比較，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=7.210，P=0.027），中、小細胞3 型細胞的構成比較低，而1型和2 型細胞的構成比較高。見圖5。

為探討神經(jīng)病理性疼痛狀態(tài)下，DRG 神經(jīng)元興奮性分型和直徑之間的關系，比較SNI 組內(nèi)不同大小神經(jīng)元各興奮性分型細胞的構成比。按直徑大小以及興奮性分型進行分類，其中，小細胞1、2 和3 型細胞的構成比分別為43.10%、3.45%和53.45%；中細胞1、2 和3 型細胞的構成比分別為59.04%、9.04%、31.91%；大細胞1、2 和3 型細胞的構成比分別為33.33%、0.00%和66.67%?？梢钥闯瞿Ｐ蛷椭坪螅屑毎?、2 和3 型細胞構成比與大細胞比較，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=6.390，P=0.041），中細胞3 型細胞構成比較低，而1 和2 型細胞構成比較高。小細胞1、2 和3 型細胞構成比與大細胞比較，差異無統(tǒng)計學意義（χ2=0.960，P=0.620）。見圖6。

圖4 SNI 模型大鼠DRG 神經(jīng)元興奮性分型的變化 （±s）

圖5 SD 大鼠DRG 神經(jīng)元興奮性分型與直徑的關系 （±s）

圖6 SNI 模型大鼠DRG 神經(jīng)元興奮性分型與直徑的關系 （±s）

3 討論

神經(jīng)病理性疼痛是指由軀體感覺神經(jīng)系統(tǒng)的損傷或疾病而直接造成的疼痛[15]，包括皰疹后神經(jīng)痛、三叉神經(jīng)痛和中風后疼痛等。研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)病理性疼痛與DRG 神經(jīng)元的興奮性密切相關。HODGKIN[16]在放電頻率與注入電流強度間的關系的基礎上，提出關于神經(jīng)元興奮性分型的理論。XIE 等[7]研究發(fā)現(xiàn)，DRG 神經(jīng)元也能表現(xiàn)出基于動作電位爆發(fā)模式的不同興奮性分型，且發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元興奮性分型的比率不是一成不變的。在DRG 慢性壓迫模型導致的慢性疼痛狀態(tài)下，1 型神經(jīng)元的比率顯著增加，而興奮性較低的3 型神經(jīng)元的比率顯著減少。該改變表明一部分3型神經(jīng)元在病理狀態(tài)下轉化成興奮性較高的1 型神經(jīng)元。本研究結果顯示，正常SD 大鼠DRG 神經(jīng)元存在3 種興奮性類型，興奮性高的1 型細胞其直徑和膜電容明顯小于興奮性低的3 型細胞；坐骨神經(jīng)選擇性損傷后，大鼠DRG 神經(jīng)元的興奮型類型發(fā)生了改變，1 型和2 型細胞比例增大，3 型細胞比例減少，表明神經(jīng)病理性疼痛狀態(tài)下，興奮性低的3 型細胞向興奮性高的1 型和2 型細胞轉化。

研究報道，不同大小的DRG 神經(jīng)元，其功能也存在不同。這種功能上的差異，可能是由神經(jīng)元的化學物質、解剖、電生理特性和神經(jīng)元對疼痛信息處理模式的差異共同造成的[5-6]。例如，按照與IB4 結合的不同特點，小直徑的DRG 被分為IB4 陽性的肽能神經(jīng)元和IB4 陰性的非肽能神經(jīng)元，而大直徑DRG的NF200 表達為陽性[17-18]。有研究者還通過多種單細胞技術，將DRG 神經(jīng)元分為10 種類型和14 種亞型[19]。研究表明，在DRG 慢性壓迫模型引起的NP 狀態(tài)下，大直徑的DRG 的興奮性分型發(fā)生明顯的變化，并且該變化與DRG 中超極化激活的陽離子電流的大小變化有關[7]。KANG 等[20]發(fā)現(xiàn)，SNI 大鼠上中等直徑DRG 神經(jīng)元CaV3.2 T 型鈣通道的改變，可能是神經(jīng)病理性疼痛的產(chǎn)生機制。JIANG 等[21]發(fā)現(xiàn)，在大鼠小直徑的DRG 神經(jīng)元上，IgG 免疫復合物（IgG-IC）能激活Ⅰ型Fc-γ 受體介導疼痛的產(chǎn)生，大中直徑的DRG 神經(jīng)元不存在該現(xiàn)象。本研究表明，大鼠DRG神經(jīng)元的興奮性分型與其直徑大小存在關系。正常狀態(tài)下，大直徑的DRG 神經(jīng)元主要是興奮性低的3 型細胞；而中、小直徑神經(jīng)元主要是興奮性較高的1 型和2 型細胞。坐骨神經(jīng)選擇性損傷后，大直徑的DRG神經(jīng)元的3 型細胞構成比仍較中細胞高，但較小細胞之間的差異無統(tǒng)計學意義。

綜上所述，在神經(jīng)病理性疼痛狀態(tài)下，DRG 神經(jīng)元興奮性分型發(fā)生明顯改變，興奮性較高的1 型和2型細胞構成比增高，而興奮性較低的3 型細胞構成比降低，這可能是神經(jīng)病理性疼痛狀態(tài)下產(chǎn)生痛覺過敏的機制之一。此外，大鼠DRG 神經(jīng)元的直徑大小與其興奮性分型間存在關系，中小細胞的興奮性較大細胞興奮性高，表明中小細胞在神經(jīng)病理性疼痛的產(chǎn)生過程中發(fā)揮更為重要的作用。但是在神經(jīng)病理性疼痛狀態(tài)下，DRG 神經(jīng)元興奮性分型改變的機制，以及不同直徑大小的DRG 神經(jīng)元興奮性類型差異的機制仍有待探索。