微粒皮移植聯(lián)合醫(yī)用自凝集水凝膠修復(fù)家兔全層皮膚缺損的實驗研究

陳斌，王曉輝，李睿智，史夢柔，李東風，于歡，劉偉偉，崔曉雪，劉山海，高萍

（1.天津市醫(yī)藥科學(xué)研究所，天津 300020；2.愛美客技術(shù)發(fā)展股份有限公司，北京 100022）

本研究將有一定黏合能力和組織修復(fù)活性的自凝集水凝膠（醫(yī)用可注射聚羧甲基葡萄糖胺凝膠）聯(lián)合微粒皮移植，評估其修復(fù)動物大面積全層皮膚創(chuàng)傷的效果。實驗中使用以羧甲基葡萄糖胺為主要前體的產(chǎn)品，其凝膠原液和雙重交聯(lián)劑液體混合后，在物理和化學(xué)催化下，可溫和、迅速地變?yōu)橛叙じ叫缘膹椥阅z，且有一定強度，對微粒皮起到保護和固定作用。自凝集水凝膠使用方便，與微粒皮移植手術(shù)聯(lián)用利于皮膚創(chuàng)面愈合。

1 材料與方法

1.1 材料和實驗動物

醫(yī)用可注射聚羧甲基葡萄糖胺凝膠（北京愛美客技術(shù)發(fā)展股份有限公司），凝膠原液和聚合劑分別裝載在雙聯(lián)裝置的2個針筒內(nèi)（批號20141008，北京愛美客技術(shù)發(fā)展股份有限公司），麻醉用戊巴比妥鈉（批號127K1005，北京化學(xué)試劑公司），生理鹽水（批號4D74G1，天津大冢制藥有限公司），芝麻油（批號A0318542，比利時ACROS公司），家兔（北京隆安實驗動物養(yǎng)殖中心）。

1.2 方法

1.2.1 皮內(nèi)刺激實驗①浸提液制備：將實驗樣品推棄掉初始端0.5 ml后取余下混合樣品，30 min凝膠凝固后，以0.2∶1.0比例制備浸提液，浸提介質(zhì)分別為生理鹽水和芝麻油。②皮內(nèi)刺激：家兔2只，背部去毛備皮，75%乙醇消毒皮膚，于脊柱兩側(cè)各選擇10個注射點，每點間隔2 cm，每點皮內(nèi)注射0.2 ml實驗液。左側(cè)前后5點分別注射實驗樣品生理鹽水浸提液和溶劑對照生理鹽水；右側(cè)前后5點分別注射實驗樣品芝麻油浸提液和溶劑對照芝麻油。注射后24、48及72 h觀察注射局部及周圍皮膚組織反應(yīng)。

1.2.2 自凝集水凝膠聯(lián)合微粒皮移植①用物理凍融法制備脫細胞真皮：家兔背部皮下取薄中厚斷層皮片，-70℃條件下反復(fù)凍融，用十二烷基硫酸鈉溶液反復(fù)超聲清洗，得到脫細胞真皮。病理切片觀察脫細胞效果。②自凝集水凝膠聯(lián)合微粒皮移植：將實驗組5只家兔麻醉，背部切除全層皮膚，形成3.5 cm×3.5 cm 缺損創(chuàng)面，并取刃厚皮切碎成1 mm×1 mm微粒皮，直接用自體微粒皮擺放創(chuàng)面，液態(tài)黏合凝膠原液滴灑，待凝膠自凝（約1、2 min）即實現(xiàn)微粒皮固定，創(chuàng)口封閉；再用準備好的自制脫細胞真皮緊密覆蓋創(chuàng)面，將真皮四角與周圍皮膚縫合固定，包扎傷口。同時設(shè)3個對照組，分別為不植入微粒皮組、不使用凝膠組及凡士林紗布覆蓋物組（將脫細胞真皮改為凡士林紗布），其余步驟與實驗組相同，各組5只家兔。觀察期為4周，觀察傷口愈合情況。③病理觀察：切取愈合創(chuàng)面皮膚，立即浸入10%中性甲醛固定24 h，常規(guī)脫水、透明、浸蠟及包埋后切片，用蘇木精-伊紅染色法（HE）行常規(guī)病理檢查。

2 結(jié)果

2.1 皮內(nèi)刺激實驗結(jié)果

自凝集水凝膠的生理鹽水和芝麻油浸提液的局部組織反應(yīng)綜合平均計分與溶劑對照平均計分之差均為0.0，符合標準中平均計分之差＜1.0的要求，產(chǎn)品無刺激性。

2.2 家兔異體脫細胞真皮的脫細胞效果

鏡下纖維組織中未見殘存細胞，脫細胞效果良好。見圖1。

圖1 脫細胞真皮 （×40）

2.3 自凝集水凝膠聯(lián)合微粒皮移植的傷口愈合情況

實驗組4周后脫細胞真皮脫落，傷口均完全愈合并生出毛發(fā)。愈合創(chuàng)面HE染色常規(guī)病理切片下可見表皮層與真皮層修復(fù)較好，有少量炎癥細胞。不植入微粒皮組在4周創(chuàng)口處仍有約2 cm×2 cm區(qū)域結(jié)痂。病理可見結(jié)痂區(qū)域周圍有大量膿細胞和炎癥細胞。不使用凝膠組4周傷口愈合，有2只有局部較小結(jié)痂或增生，病理切片顯示多數(shù)缺損的表皮層與真皮層修復(fù)較好，小結(jié)痂或增生處表皮層已修復(fù)，但真皮和皮下有較多炎癥細胞浸潤。凡士林紗布覆蓋物組家兔4周后創(chuàng)面均完全愈合，病理結(jié)果與實驗組相近。見圖2、3。

圖2 各組術(shù)后4周創(chuàng)面愈合情況

圖3 各組術(shù)后4周創(chuàng)面病理切片圖

3 討論

目前，臨床用人工皮治療大面積皮膚缺損局限很多，如種子細胞通常來源于新生兒包皮組織。使用異體細胞會引起排異反應(yīng)，如選用自體皮膚細胞，需要體外培養(yǎng)一定時間，不適用于緊急手術(shù)[1]，且結(jié)構(gòu)和力學(xué)強度等無法與自體皮膚組織相比[2]。除仍在實驗階段的干細胞人工皮外，都不具備皮膚附屬器官[3]。自體微粒皮移植是另一種修復(fù)大面積嚴重皮膚損傷的臨床治療方式，實驗中家兔在自體微粒皮移植術(shù)后，新生皮膚的結(jié)構(gòu)較好，鏡下可見附屬器官，還可見新生毛發(fā)。

自體微粒皮移植，指將面積＜1 mm2自體皮片[4]植于皮膚創(chuàng)面上，并在接種面上敷以保護層（如異體皮、脫細胞皮膚及人工真皮或高分子敷料甚至普通敷料[5-9]）的皮膚移植術(shù)，用于治療大面積深度燒傷或皮膚剝脫的治療。術(shù)中所用自體皮與創(chuàng)面面積比約為1：10～1∶20[10]，可緩解短時間內(nèi)自體皮源有限而創(chuàng)面面積較大的矛盾[11]。

實驗中不使用凝膠組部分創(chuàng)面在愈合后有局部小結(jié)痂和增生，推斷與微粒皮植入后的異位翻轉(zhuǎn)有關(guān)。邱宇軒等[12]使用小型豬皮膚缺損模型，未解決微粒皮定位問題。自凝集水凝膠能進行原位交聯(lián)，在傷口處迅速形成凝膠，很好地解決微粒皮定位問題，有效提高微粒皮的成活率。張旭輝等[13]用脫細胞真皮微粒與微粒皮混合種植證明，合適的基質(zhì)支持對微粒皮的生長修復(fù)有利。本實驗采用新上市的醫(yī)用可注射聚羧甲基葡萄糖胺凝膠與微粒皮移植手術(shù)聯(lián)合，創(chuàng)口處快速成形凝膠，保護傷口，為移植組織的生長提供結(jié)構(gòu)支持。相比黏附力較差的透明質(zhì)酸類等凝膠[14]，本實驗采用的產(chǎn)品還有一定的黏附性能。4周的實驗觀察中，實驗組家兔皮膚愈合良好，未出現(xiàn)微粒皮翻轉(zhuǎn)導(dǎo)致的局部小結(jié)痂等病變。而覆蓋物脫細胞真皮改為用凡士林紗布后，發(fā)現(xiàn)創(chuàng)面修復(fù)效果尚可，提示將自凝集水凝膠聯(lián)合微粒皮移植可降低對覆蓋物的要求，節(jié)約手術(shù)成本。

在手術(shù)中局部填充自凝集水凝膠抑制組織黏連，能起到很好的抗黏連效果[15]。本研究也證實，該材料生物相容性好，無皮膚刺激性。手術(shù)觀察發(fā)現(xiàn)自凝集水凝膠的黏合強度還有待提高，未來的研究可進一步優(yōu)化配方，提高其機械性能和黏合強度。遠期可使自凝集水凝膠結(jié)構(gòu)中連入附著功能性分子，通過其與細胞膜的化學(xué)連接[16-17]，加強微粒皮細胞與創(chuàng)口面的結(jié)合作用；另外，凝膠中引入一些活性分子，并用某些方法使其定向分布，可誘導(dǎo)和促進皮膚組織生長和血管形成，這些都是未來的研究方向。