豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染肺泡巨噬細(xì)胞后差異表達(dá)膜蛋白的鑒定與分析

張玉嬌，高 飛,2，曲澤慧，姜一峰,2，周艷君，虞凌雪，李麗薇，趙 款，童光志,2

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241，2. 揚(yáng)州大學(xué) 江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚(yáng)州 225009）

豬繁殖與呼吸綜合征（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）俗稱藍(lán)耳病，是一種嚴(yán)重影響?zhàn)B豬業(yè)發(fā)展的接觸性傳染病。1987年美國(guó)首次報(bào)道PRRS后[1]，德國(guó)、英國(guó)、荷蘭、西班牙等歐洲國(guó)家相繼報(bào)道了該病的發(fā)生。目前，PRRS幾乎在所有養(yǎng)豬國(guó)家中廣泛流行。PRRS的病原為豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）。荷蘭學(xué)者首次分離到歐洲型PRRSV代表毒株Lelysted[2-3]。北美學(xué)者相繼分離到北美型PRRSV代表毒株ATCCVR2332[4]，中國(guó)在1996年首次分離到PRRSV[5]。2006年，中國(guó)大面積爆發(fā)高致病性PRRS（highlypathogenic PRRS，HP-PRRS），其發(fā)病率及死亡率與經(jīng)典PRRS相比均顯著升高，給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大損失[6]。

PRRSV屬于套式病毒目、動(dòng)脈炎病毒科、動(dòng)脈炎病毒屬[7]?；蚪M為單股正鏈RNA，全長(zhǎng)約15 kb，5'端有帽子結(jié)構(gòu)，3'端有poly(A)尾[8]，至少含有10個(gè)開放閱讀框[9]。PRRSV具有嚴(yán)格的細(xì)胞嗜性，肺泡巨噬細(xì)胞（pulmonary alveolar macrophage，PAM）為其天然靶細(xì)胞。本團(tuán)隊(duì)在前期研究中利用遺傳背景清晰的HP-PRRSV毒株HuN4及其體外傳代致弱毒株HuN4-F112分別感染PAM，發(fā)現(xiàn)只有部分PAM可以被PRRSV感染，且強(qiáng)毒感染PAM的效率顯著高于弱毒，但導(dǎo)致這種差異的機(jī)制尚不明確，推測(cè)感染PAM的能力可能與病毒的致病力有關(guān)。PRRSV可通過受體調(diào)節(jié)的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞[10]，而細(xì)胞表面存在差異表達(dá)的受體或相關(guān)的膜蛋白可能會(huì)影響PRRSV強(qiáng)弱毒的感染效率，從而導(dǎo)致強(qiáng)弱毒在致病性方面出現(xiàn)差異。

本研究利用EGFP標(biāo)記的PRRSV強(qiáng)弱毒株分別感染PAM，通過FITC通道篩選感染及未感染PRRSV的PAM，分別提取感染及未感染的PAM膜蛋白，分析鑒定PRRSV強(qiáng)弱毒株感染后PAM差異表達(dá)的膜蛋白，從而深入了解PRRSV感染致病的分子機(jī)理。

1 材料和方法

1.1 病毒和細(xì)胞HP-PRRSV強(qiáng)毒株HuN4[11]和PRRSV弱毒株HuN4-F112由豬病毒性繁殖障礙綜合癥團(tuán)隊(duì)實(shí)驗(yàn)室（本實(shí)驗(yàn)室）保存[12]；帶有EGFP基因的重組PRRSV毒株rHuN4-EGFP和rHuN4-F112-EGFP由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建與保存[13]；PAM取自15日齡PRRSV陰性豬肺泡灌洗液。

1.2 主要試劑抗PRRSV N蛋白多抗為本實(shí)驗(yàn)室制備[14]；ProteoExtract Transmembrane Protein Extraction Kit購(gòu)自上海拜力生物科技有限公司。

1.3 主要儀器Easy-nLC 1000液相色譜儀購(gòu)自Thermo Finnigan公司；Q Exactive質(zhì)譜儀購(gòu)自Thermo Fisher Scientific公司；FACSARIA III分選流式細(xì)胞儀購(gòu)自BD公司；Eppendorf Mastercycler realplex熒光定量PCR儀購(gòu)自Eppendorf公司。

1.4 PAM的分離和培養(yǎng)采用肺泡灌洗法獲得PAM。用4℃預(yù)冷的無菌PBS（含100 μg /mL青霉素和100 μg /mL鏈霉素）灌洗肺臟，輕輕按摩肺葉后將肺泡灌洗液吸出，重復(fù)上述操作，直至肺臟呈透明狀。收集所有的肺泡灌洗液，4℃、500×g離心10 min 獲得細(xì)胞，PBS 洗滌2 次后，用10% FBS的RPMI-1640重懸細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。以1×106個(gè)/mL的細(xì)胞密度接種到細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，更換新培養(yǎng)液，獲得能夠貼壁的PAM。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)分選PAM將貼壁培養(yǎng)的PAM用0.25%胰酶消化5 min，500×g離心10 min后，收獲細(xì)胞，PBS清洗2次，再用含EDTA的MACS（流式細(xì)胞儀分選與磁珠分選）緩沖液重懸。用40 μm濾網(wǎng)去除粘連細(xì)胞，將PAM收集于流式管中。通過FITC通道檢測(cè)熒光信號(hào)，分選感染與未感染PRRSV的PAM。

1.6 膜蛋白樣品的制備按照ProteoExtract Transmembrane Protein Extraction Kit說明書操作，提取PAM細(xì)胞膜蛋白。加入少量SDT buffer（4% SDS、1 mmol/L DTT、150 mmol/L Tris-HCl，pH8.0），置沸水浴5 min，離心取上清，用BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)含量。

1.7 FASP酶解取50 μL樣品，加入 DTT至終濃度為100 mmol/L， 置沸水浴5 min，取出冷卻至室溫；加入200 μL UA buffer（8 mol/L Urea、150 mmol/L Tris-HCl，pH8.0）混勻，轉(zhuǎn)入10 kd超濾離心管，14 000×g離心15 min；加入200 μL UA buffer，離心15 min，棄濾液；加入100 μL IAA（終濃度為50 mmol/L IAA溶于UA中），600 r/min振蕩1 min，避光室溫30 min，14 000×g離心10 min；加入100 μL UA buffer，14 000×g離心10 min，重復(fù)2次；加入100 μL NH4HCO3（100 mmol/L），14 000×g離心10 min，重復(fù)2次；加入40 μL Trypsin buffer（4 μL Trypsin溶于40 μL NH4HCO3），600 r/min振蕩1 min，置37℃中16～18 h；換新收集管，14 000×g離心10 min，取濾液，測(cè)定多肽含量（OD280）。

1.8 Shot-gun LC-MS質(zhì)譜分析按照定量結(jié)果取2 μg酶解后產(chǎn)物進(jìn)行Shot-gun LC-MS分析。采用納升流速HPLC液相系統(tǒng)EASY-nLC1000進(jìn)行分離。液相A液為0.1%甲酸乙腈水溶液（乙腈為2%），B液為0.1%甲酸乙腈水溶液（乙腈為84%）。色譜柱Thermo EASY column SC200 150 μm×100 mm（RP-C18）以100%的A液平衡。樣品由自動(dòng)進(jìn)樣器上樣到色譜柱進(jìn)行分離，流速為300 μL /min。相關(guān)液相梯度如下：0～55 min，B液線性梯度從0%到45%；55～58 min，B液線性梯度從45%到100%；58～60 min，B液維持在100%。酶解產(chǎn)物經(jīng)毛細(xì)管高效液相色譜分離后用Q Exactive質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜分析。分析時(shí)長(zhǎng)：60 min，檢測(cè)方式：正離子，母離子掃描范圍：300～1800 m/z。多肽和多肽碎片的質(zhì)量電荷比按照下列方法采集：MS1在M/Z 200時(shí)分辨率為70 000，AGC target：3e6，一級(jí)Maximum IT：10 m，Number of scan ranges：1，Dynamic exclusion：40.0 s；每次全掃描（full scan）后采集20個(gè)碎片圖譜，二級(jí)在M/Z 200時(shí)分辨率為17 500，MS/MS Activation Type：HCD，Isolation window：2 m/z，Microscans：1，二級(jí)Maximum IT：60 m，Normalized collision energy：30eV，Underfill ratio：0.1 %。

1.9 質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析原始文件（raw file）用Proteome Discoverer 1.4（Thermo）提交至Mascot 2.2服務(wù)器，搜索相應(yīng)的數(shù)據(jù)庫(kù)，最后得到鑒定的蛋白質(zhì)結(jié)果。相關(guān)參數(shù)如下：Enzyme=Trypsin，Missed cleavage=2，F(xiàn)ixed modification：Carbamidomethyl（C），Variable modification：Oxidation（M）。查庫(kù)所用本地化Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)：uniprot Sus scrofa蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)（下載日期20150317，序列34349條）。肽段容差（Peptides tolerance）：20 ppm，MS/MS tolerance：0.1Da，結(jié)果過濾參數(shù)：FDR≤0.01。

1.10 生物信息學(xué)分析鑒定蛋白使用在線定位預(yù)測(cè)軟件（http://genome.unmc.edu/ngLOC/index.html）進(jìn)行定位分析。篩選的差異蛋白使用Blast2GO軟件進(jìn)行基因本體（gene ontology）分析，分別進(jìn)行蛋白的生物學(xué)過程（biological process）、分子功能（molecular function）、細(xì)胞組成（cellular component）分析。

2 結(jié)果

2.1 PAM的病毒感染小豬安樂死后，取出肺臟，成功分離到半貼壁的PAM。將培養(yǎng)24 h的PAM，分別感染1MOI的rHuN4-EGFP和rHuN4-F112-EGFP。病毒吸附1 h后，用PBS洗滌2次，加入2%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基，在37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。通過流式細(xì)胞儀FITC通道篩選到感染及未感染PRRSV的PAM，提取膜蛋白，成功獲得足量的用于質(zhì)譜分析的膜蛋白樣品。

2.2 Shotgun定性質(zhì)譜分析結(jié)果利用Shotgun定性質(zhì)譜技術(shù)，分析感染rHuN4-EGFP和rHuN4-F112-EGFP的PAM差異膜蛋白，共鑒定到肽段7273個(gè)，對(duì)應(yīng)蛋白1154個(gè)，細(xì)胞膜定位的蛋白數(shù)量為681個(gè)，占59.01%。其中在rHuN4-EGFP感染樣品中特異檢測(cè)到72個(gè)差異表達(dá)蛋白，在rHuN4-F112-EGFP感染樣品中特異檢測(cè)到12個(gè)蛋白（表1）。其中，Lectinlike oxidized LDL receptor-1、Junction plakoglobin 在rHuN4-EGFP感染組和rHuN4-F112-EGFP感染組中均能被檢測(cè)到，因此，最終共獲得82個(gè)在強(qiáng)弱毒感染PAM過程中存在差異表達(dá)的膜蛋白。

表1 Shotgun質(zhì)譜鑒定部分差異蛋白表Table1 A partial differential protein of the Shotgun mass spectrometry

圖1 感染rHuN4-EGFP的PAM差異膜蛋白的GO注釋Fig. 1 Gene ontology (GO) categories of the identified membrane proteins from PAM infected with rHuN4- EGFP

同時(shí)，將特異檢測(cè)到的差異蛋白從生物學(xué)過程、分子功能、細(xì)胞組成等方面進(jìn)行GO注釋，感染rHuN4-EGFP強(qiáng)毒株以及rHuN4-F112-EGFP弱毒株的差異表達(dá)膜蛋白主要參與代謝、生物學(xué)調(diào)節(jié)、細(xì)胞加工過程，大部分蛋白具有結(jié)合、催化活性，這些蛋白主要為細(xì)胞器和細(xì)胞膜的組成成分（圖1和圖2）

2.3 PAM差異膜蛋白對(duì)PRRSV復(fù)制的影響對(duì)Shotgun質(zhì)譜結(jié)果進(jìn)行分析后，將部分差異表達(dá)的膜蛋白基因克隆到真核表達(dá)質(zhì)粒，分別轉(zhuǎn)染MARC-145細(xì)胞后，再感染PRRSV強(qiáng)毒HuN4或弱毒HuN4-F112，采用抗PRRSV N蛋白的多克隆抗體進(jìn)行Western blot分析。結(jié)果表明，前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草桿菌蛋白酶9（proprotein convertase subtilisin/kexin type 9，PCSK9）重組蛋白對(duì)PRRSV強(qiáng)毒株和弱毒株均有抑制作用（圖3A），而Clusterin和Apoliproterin C-II則能夠促進(jìn)PRRSV的復(fù)制（圖3B）。

重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MARC-145細(xì)胞36 h后接種0.1MOI的HuN4或HuN4-F112病毒。接種病毒48 h后，收取上清測(cè)定病毒含量（TCID50），并用RT-qPCR測(cè)定病毒的拷貝數(shù)[15]。結(jié)果表明，過表達(dá)PCSK9能抑制PRRSV強(qiáng)毒和弱毒的復(fù)制（圖4）。

3 討論

PRRSV一直嚴(yán)重危害著養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，尤其是2006年爆發(fā)的HP-PRRSV對(duì)我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，但目前對(duì)HP-PRRSV的致病機(jī)制卻知之甚少。本團(tuán)隊(duì)前期實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明PRRSV強(qiáng)弱毒株感染PAM的效率存在差異，很可能與PRRSV的致病機(jī)制有關(guān)。本研究通過Shotgun質(zhì)譜技術(shù)篩選影響PRRSV感染效率的差異膜蛋白，通過對(duì)差異膜蛋白的研究來探究PRRSV的致病機(jī)制。

通過流式細(xì)胞術(shù)分選獲得感染EGFP標(biāo)記的PRRSV強(qiáng)毒株（rHuN4-EGFP）或弱毒株（rHuN4-F112-EGFP）的PAM，提取其膜蛋白進(jìn)行質(zhì)譜分析，獲得了82個(gè)在強(qiáng)弱毒感染PAM過程中差異表達(dá)的膜蛋白。選取部分可信度較高的差異膜蛋白檢測(cè)其對(duì)PRRSV復(fù)制的影響，過表達(dá)實(shí)驗(yàn)顯示PCSK9蛋白能夠抑制PRRSV復(fù)制，Apolipoprotein C-II和Clusterin能夠促進(jìn)PRRSV復(fù)制。Apolipoprotein C-II存在于高密度脂蛋白顆粒上，參與高密度脂蛋白向低密度脂蛋白轉(zhuǎn)移膽固醇酯的過程，其表達(dá)量增多，能增加低密度脂蛋白從肝臟向其他組織和器官運(yùn)輸膽固醇的能力，對(duì)于靶細(xì)胞內(nèi)的膽固醇運(yùn)輸具有重要作用。有文獻(xiàn)表明，細(xì)胞及病毒的脂筏結(jié)構(gòu)對(duì)于PRRSV的復(fù)制具有重要作用，脂筏為富含膽固醇和鞘磷脂的的膜脂微區(qū)（membrane lipid microdomain），用膽固醇抑制劑MβCD處理細(xì)胞能明顯抑制PRRSV的復(fù)制，MβCD處理的病毒則失去感染細(xì)胞的能力[16-17]，可見膽固醇代謝對(duì)于PRRSV的感染是非常重要的。載脂蛋白作為攜帶脂蛋白中膽固醇酯入胞的載體，很可能通過調(diào)節(jié)膽固醇代謝，從而影響PRRSV的復(fù)制。

圖3 Western blot檢測(cè)差異膜蛋白對(duì)PRRSV復(fù)制的影響Fig.3 Effect of differential membrane proteins on PRRSV replication by Western blot

圖4 TCID50及RT-qPCR檢測(cè)差異膜蛋白對(duì)PRRSV復(fù)制的影響Fig.4 Effect of differential membrane protein on PRRSV replication by TCID50 and RT-qPCR

PCSK9又稱神經(jīng)凋亡調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化酶（neural apoptosis-regulated convertase 1，NARC-1），屬于前蛋白轉(zhuǎn)化酶（proprotein convertases，PC）家族。已有文獻(xiàn)表明PCSK9蛋白能夠與低密度脂蛋白受體(low-density lipoprotein receptor, LDLR)結(jié)合，加速細(xì)胞內(nèi)LDLR在溶酶體中的降解，阻礙LDLR的循環(huán)使用，影響細(xì)胞攝入膽固醇的能力，從而顯著抑制PRRSV的復(fù)制[18]。因此，PCSK9蛋白很可能通過影響細(xì)胞膽固醇水平來影響PRRSV復(fù)制。Wang等[19]研究表明不同PAM的CD163豐度存在差異，并且CD163豐度越高，PRRSV復(fù)制能力越強(qiáng)，從另一方面證實(shí)PAM細(xì)胞膜蛋白差異能影響PRRSV復(fù)制。對(duì)影響PRRSV復(fù)制的差異膜蛋白進(jìn)行研究，將有助于深入了解PRRSV復(fù)制特性，為探索PRRSV致病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

已報(bào)道的關(guān)于PRRSV感染PAM蛋白質(zhì)組學(xué)研究均是將接種PRRSV后所有的PAM作為試驗(yàn)組，將未接種PRRSV的PAM作為對(duì)照組進(jìn)行比較分析[20-21]。由于PRRSV感染PAM的效率比較低，在病毒量足夠的情況下，并不是所有PAM均可被PRRSV感染，大部分PAM并未感染PRRSV，因此，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能不夠嚴(yán)謹(jǐn)。本研究利用rHuN4-EGFP、rHuN4-F112-EGFP病毒感染PAM細(xì)胞，通過流式細(xì)胞儀的FITC通道成功分選到確定感染PRRSV的PAM，將確定感染PRRSV的PAM細(xì)胞膜蛋白與確定未感染PRRSV的PAM比較，結(jié)果更為準(zhǔn)確，能更好地對(duì)PRRSV復(fù)制及致病性機(jī)制進(jìn)行研究。