頭孢硫脒新雜質(zhì)的制備及結(jié)構(gòu)解析

劉玲 林順權(quán) 袁曉 蒲含林,*

(1 暨南大學(xué)細胞生物學(xué)系，廣州 510630；2 廣州牌牌生物科技有限公司，廣州 510663)

頭孢硫脒(圖1)又稱仙力素，是我國自主研發(fā)并第一個進入臨床試驗的第一代頭孢菌素類藥物。頭孢硫脒是一個廣譜抗生素，在臨床應(yīng)用中，對大部分革蘭陽性菌和部分革蘭陰性菌表現(xiàn)出很強的殺滅作用。臨床研究表明，頭孢硫脒對由金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、腸球菌等引起的呼吸道、泌尿系統(tǒng)、軟組織、燒傷及手術(shù)后等的感染效果良好，尤其對抗藥性較強的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、耐甲氧西林表皮葡萄球菌作用明顯[1]。

藥物中部分雜質(zhì)的存在，會引起不良反應(yīng)，影響藥效。為了完善頭孢硫脒的質(zhì)量檢測標(biāo)準(zhǔn)，文獻調(diào)研發(fā)現(xiàn)頭孢硫脒有關(guān)物質(zhì)的研究中，已發(fā)表的文獻均采用LC-MS推測有關(guān)物質(zhì)的大致化學(xué)結(jié)構(gòu)，對雜質(zhì)結(jié)構(gòu)中的一些原子或基團的變化未做細致研究，對于氧化雜質(zhì)這樣有兩個以上位點可以加氧的，難以推測其氧化雜質(zhì)的具體結(jié)構(gòu)[2-7]。本文還提出了雙鍵轉(zhuǎn)移雜質(zhì)的合成和分離純化方法，對這兩個雜質(zhì)用核磁共振譜結(jié)合質(zhì)譜進行了結(jié)構(gòu)分析，確證了其結(jié)構(gòu)。本研究為頭孢硫脒生產(chǎn)工藝的改進、質(zhì)量研究及貯藏條件的確定提供了依據(jù)[8-9]。

1 儀器與試劑

1.1 試劑

磷酸氫二鈉、雙氧水、三乙胺、三甲基氯硅烷均為分析純；乙腈為色譜純；水為公司自制的去離子水；頭孢硫脒原料購于武漢澤山城生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司。

1.2 儀器

HITACHI高效液相色譜儀、DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器、Thermo Fisher LCQ Fleet、BRUKER AVANCE Ⅲ 500MHz超導(dǎo)核磁共振譜儀。

2 頭孢硫脒雜質(zhì)的制備

2.1 液相色譜條件

圖1 頭孢硫脒的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structural formula of cefathiamidine

流動相為磷酸鹽緩沖液(取無水磷酸二氫鈉2.76g，檸檬酸1.29g，加水溶解并稀釋至1L)：乙腈(80:20)；流速1.0mL/min；色譜柱Wondasil C18-WR(4.6mm×250mm, 5μm)，柱溫30℃，檢測波長為254nm，進樣量10μL。

2.2 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用條件

采用Thermo Hypersil Gold C18(160mm×2.1mm, 3μm)色譜柱，以0.05%甲酸水:乙腈(90:10)為流動相，流速0.4mL/min，檢測波長254nm，柱溫為30℃，進量為10μL；離子源為ESI，正離子檢測模式，離子掃描范圍m/z：150～2000；噴霧電壓：4000V；金屬毛細管溫度：275℃；鞘氣壓力：35arb；輔助氣壓力：5arb。

2.3 核磁測試條件

實際照射頻率：125.76MHz；去偶場頻率：500.13MHz，溶劑：DMSO-d6，圖譜范圍：δ： 0～210ppm。

2.4 雜質(zhì)的制備方法

2.4.1 氧化雜質(zhì)的制備

取頭孢硫脒原料1g，溶于50mL水，常溫下加入30%雙氧水5mL，攪拌反應(yīng)2h，參照“2.1”項方法用HPLC定位反應(yīng)液中目標(biāo)雜質(zhì)，結(jié)果如圖2所示，目標(biāo)雜質(zhì)的保留時間為3.813min。將反應(yīng)液注入ODS分離柱，乙腈-水洗脫，洗脫過程如表1所示。冷凍干燥后得到白色固體樣品，純度＞98%，通過核磁共振及多級質(zhì)譜分析其結(jié)構(gòu)。

2.4.2 雙鍵轉(zhuǎn)移雜質(zhì)的制備

以DCM為溶劑溶解頭孢硫脒，加入適量三乙胺和三甲基氯硅烷，在-10℃下混合反應(yīng)1h。用與反應(yīng)液等體積的水萃取反應(yīng)液，取水層，重復(fù)萃取3次，合并萃取液。參照“2.1”項中方法用HPLC定位目標(biāo)雜質(zhì)，結(jié)果如圖3，目標(biāo)雜質(zhì)的保留時間為5.44min。將萃取的水層注入ODS材料分離柱，乙腈-水洗脫，洗脫過程如表2所示。冷凍干燥后得到黃白色固體粉末，純度＞95%，借助核磁共振及多級質(zhì)譜分析其結(jié)構(gòu)。

圖2 氧化雜質(zhì)反應(yīng)液的HPLC檢測Fig.2 HPLC detection of oxidized impurity reaction solution

表1 氧化雜質(zhì)分離純化過程Tab.1 Separation and purification process of oxidized impurity

圖3 雙鍵轉(zhuǎn)移雜質(zhì)反應(yīng)液的HPLC檢測Fig.3 HPLC detection of double bond transfer impurity reaction solution

表2 雙鍵轉(zhuǎn)移雜質(zhì)分離純化過程Tab.2 Separation and purification process of double bond transfer impurity

3 雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)解析

通過上述制備和分離過程，得到兩個雜質(zhì)的純品，分別取固體樣品20mg，用于結(jié)構(gòu)分析測定。

3.1 雜質(zhì)質(zhì)譜及分析

取供試品溶液，參照“2.2”項下的質(zhì)譜條件，采用一級全掃描質(zhì)譜方式采集數(shù)據(jù)，得氧化雜質(zhì)及雙鍵轉(zhuǎn)移雜質(zhì)三級質(zhì)譜圖。

3.1.1 氧化雜質(zhì)

如圖4所示，m/z：[M+H]+489.10為頭孢硫脒分子正好增加一個氧原子(489.10-1.0=488.2=472.2+16.0)。碎片290.97為雜質(zhì)分子6-、7-位斷開后，7-位上酰胺鍵斷裂后連有氨基的六元環(huán)部分。273.94為碎片290.97去掉一個羧基上的羥基(290.97-17)，219.01為碎片273.94的1-位上的乙酰氨基斷裂離去后的六元環(huán)部分(273.94-54.93)，200.92為碎片219.01的2-位羧基脫水后的碎片(219.01-18.09)，158.94為碎片200.92斷裂3-位側(cè)鏈上的乙烯醇后的片段(200.92-42)，具體裂解過程如圖5。

3.1.2 雙鍵轉(zhuǎn)移雜質(zhì)

如圖6所示，分子離子峰為m/z：[M+H]+473.2, 碎片428.78是分子中去掉端部的異丙基后的部分，片段412.96是碎片428.78中去掉一個羧基氧原子，片段353.91是前一個片段斷裂掉側(cè)鏈上的乙酰氧基后的碎片，311.61為前一片段斷裂烯丙基后的碎片，269.03為前一片段斷裂異丙烯基后的碎片，201.06為除去兩個環(huán)和一個亞甲基的剩余側(cè)鏈部分，155.88為201.06斷裂甲酰胺基后的片段，127.77為前一片段斷裂亞甲胺后的碎片，具體裂解過程如圖7所示。

3.1.2 雜質(zhì)核磁信息

圖4 氧化雜質(zhì)的多級質(zhì)譜Fig.4 Multistage mass spectrometry of oxidized impurity

圖5 氧化雜質(zhì)裂解Fig.5 Possible fragmentation of oxidized impurity

圖6 雙鍵轉(zhuǎn)移雜質(zhì)多級質(zhì)譜Fig.6 Multi-stage mass spectrometry of double bond transfer impurity

取兩個雜質(zhì)樣品，用DMSO溶解后，按“2.3”項下條件進行NMR分析，通過NMR結(jié)果對推斷的結(jié)構(gòu)進行確證。氧化雜質(zhì)與雙鍵轉(zhuǎn)移雜質(zhì)核磁碳譜、氫譜歸屬表信息如表3所示。

4 結(jié)論

如圖8所示，氧化雜質(zhì)的質(zhì)譜分子離子峰與其結(jié)構(gòu)一致為頭孢硫脒增加一個氧原子，其一級、二級、三級和四級質(zhì)譜圖中主要碎片峰的出現(xiàn)都能與推測結(jié)構(gòu)式分子中對應(yīng)的斷裂碎片的分子量相對應(yīng)，從各級質(zhì)譜的碎片峰推斷氧化發(fā)生在5-位硫原子上。13C NMR譜中C-2和C-3的化學(xué)位移值顯示其均為季碳原子，1H NMR譜中六元環(huán)上有-CH2-(C-4)的峰。

雙鍵轉(zhuǎn)移雜質(zhì)的質(zhì)譜分子離子峰與雜質(zhì)的分子量一致，一級、二級和三級質(zhì)譜圖中主要碎片峰的出現(xiàn)都能與推測結(jié)構(gòu)式分子中對應(yīng)的斷裂碎片的分子量相對應(yīng)，13C NMR譜中C-3和C-4的化學(xué)位移值顯示其為雙鍵碳原子峰。1H NMR譜中少了未發(fā)生雙鍵轉(zhuǎn)移時的六元環(huán)上的-CH2-(C-4)峰。

綜上所述，本文確定了頭孢硫脒雙鍵轉(zhuǎn)移和頭孢硫脒氧化雜質(zhì)的具體結(jié)構(gòu)，本研究結(jié)果為頭孢硫脒質(zhì)量控制提供了借鑒，同時也建議頭孢硫脒在存儲和運輸過程中應(yīng)盡量避免堿性環(huán)境，避免與空氣過多接觸。

圖7 雙鍵轉(zhuǎn)移雜質(zhì)多級質(zhì)譜裂解路線Fig.7 Multi-stage mass spectrometry cracking route for double bond transfer impurities

表3 雙鍵轉(zhuǎn)移雜質(zhì)與氧化雜質(zhì)的1H NMR、13C NMR化學(xué)位移歸屬Tab.3 1H NMR and 13C NMR chemical shift assignment of double bond transfer impurities and oxidized impurities

圖8 雜質(zhì)結(jié)構(gòu)Fig.8 Structure of impurities