呼和浩特市大青山白樺根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)研究

高秀宏,李 敏,盧 萍,呂桂芬,牛艷芳

內(nèi)蒙古師范大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 呼和浩特 010018

土壤微生物是生態(tài)系統(tǒng)的重要組分,它們驅(qū)使和影響了土壤中有機(jī)物分解、營養(yǎng)循環(huán)、生態(tài)系統(tǒng)生產(chǎn)力等許多生態(tài)系統(tǒng)過程[1- 4],它們的物種多樣性及其功能多樣性是生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性的關(guān)鍵所在[1,5]。土壤微生物在森林生態(tài)系統(tǒng)演替、干擾生態(tài)系統(tǒng)恢復(fù)與重建的過程中發(fā)揮著重要的生態(tài)功能。根際微生物多樣性及其群落結(jié)構(gòu)受其宿主植物[6-8]和土壤理化性質(zhì)[9- 10]的共同影響。探索土壤、微生物和植物之間相互影響的復(fù)雜關(guān)系,對進(jìn)一步認(rèn)識它們之間的協(xié)同進(jìn)化機(jī)制具有重要意義[11]。因此,通過探索土壤微生物群落結(jié)構(gòu)變化來預(yù)測生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)與功能,已成為目前一個重要研究方向[12]。土壤微生物多樣性及群落結(jié)構(gòu)的研究方法有傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)法、生物標(biāo)記法、BIOLOG鑒定系統(tǒng)和高通量測序技術(shù)[6- 7,21],其中高通量測序技術(shù)具有快速、高通量以及高準(zhǔn)確性等優(yōu)點[22-23],已成為解析復(fù)雜環(huán)境中微生物群落結(jié)構(gòu)組成和相對豐度的最重要工具之一[24]。如李巖等應(yīng)用高通量測序技術(shù)對西北干旱區(qū)兩種鹽生植物黑果枸杞(Lyciumruthenicum)和里海鹽爪爪(Kalidiumcaspicum)根際土壤細(xì)菌的多樣性和群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)黑果枸杞、里海鹽爪爪根際細(xì)菌多樣性豐度高于非根際土壤,黑果枸杞根際土壤細(xì)菌多樣性豐度高于里海鹽爪爪[25]。秦紅等應(yīng)用高通量測序技術(shù)對三峽庫區(qū)重慶忠縣汝溪河流域典型消落帶的耕地、林地、棄耕地土壤細(xì)菌和真菌群落多樣性進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)不同土地利用方式下細(xì)菌和真菌多樣性均有顯著性差異,耕地和林地的細(xì)菌多樣性無顯著性差異,均顯著高于棄耕地[26]。

與草地和農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)相比,對森林生態(tài)系統(tǒng)的土壤微生物多樣性及群落結(jié)構(gòu)特征的研究相對較少[13],包括對真菌和細(xì)菌的研究都相對薄弱[14]。最近研究結(jié)果表明,細(xì)菌通常含有編碼植物細(xì)胞壁降解酶的基因[15],而且對有機(jī)物質(zhì)的分解作用顯著[16-18]。另外,細(xì)菌是森林生態(tài)系統(tǒng)中固氮的主要天然因子[19],同時也參與了許多其他生態(tài)系統(tǒng)過程,例如,在礦物風(fēng)化過程中釋放出無機(jī)營養(yǎng)元素以供植物利用[20]。位于內(nèi)蒙古自治區(qū)呼和浩特市的大青山是我國北方重要的生態(tài)安全屏障,在防風(fēng)固沙、涵養(yǎng)水源、保持水土等方面發(fā)揮著重要生態(tài)功能。作為天然林和天然次生林生態(tài)系統(tǒng)的先鋒樹種,以及溫帶落葉闊葉林的優(yōu)勢樹種,白樺(Betulaplatyphylla)對于維持區(qū)域生態(tài)平衡具有重要意義。目前,關(guān)于白樺根際土壤真菌(尤其菌根真菌)有相應(yīng)研究報道[27-29],但關(guān)于白樺根際土壤細(xì)菌的研究相對較少。僅周永娜分析了山西龐泉溝自然保護(hù)區(qū)樺樹林根際細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)有25個目細(xì)菌的豐度大于1%,包括能分解糖類、脂類、蛋白質(zhì)等有機(jī)質(zhì)的細(xì)菌和具有固氮和固碳功能的細(xì)菌[30]。但上述研究結(jié)果并不能代表各種生境中白樺根際土壤細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)。白樺分布廣泛,其根際土壤細(xì)菌多樣性及群落結(jié)構(gòu)在不同生境中是否有差異？已有研究表明土壤微生物地理分布與所處的土壤類型、土地利用密切相關(guān)[31- 32]。為深入揭示森林生態(tài)系統(tǒng)中白樺根際細(xì)菌多樣性規(guī)律,本研究采用高通量測序技術(shù),對內(nèi)蒙古自治區(qū)呼和浩特市大青山白樺根際土壤細(xì)菌的物種多樣性和群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析,現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

大青山研究區(qū)位于內(nèi)蒙古自治區(qū)呼和浩特市井兒梁(編號為A2,海拔1789—1912 m, E111°26′54″ E111°44′23″,N40°53′22″—N40°54′39″)、哈達(dá)門森林公園(編號為B2,海拔1794 m—1830 m,E111°39′19″—E111°40′33″,N40°57′8″—N 41°58′32″)和小井溝(編號為C2,海拔1715 m—1854 m,E111°47′52″—E111°49′56″,N41°2′32″—N 41°2′38″)三個樣地,白樺均為1949年解放前后在火燒跡地上通過封育生長起來的萌芽林。該地區(qū)屬溫帶大陸性氣候,晝夜溫差大,年降雨量400 mm 左右,年蒸發(fā)量1800 mm 左右,濕潤度0.3—0.6,年平均氣溫5.9℃,年日照時數(shù)2976.5 h,主風(fēng)向為西北風(fēng),無霜期90—180 d。哈達(dá)門森林公園位于井兒梁東北方向29 km；小井溝位于哈達(dá)門森林公園東62 km。哈達(dá)門森林公園和小井溝白樺林下主要伴生灌木有小蘗(Berberiskawakamii)、蒙古扁桃(Amygdalusmongolica)、繡線菊(Spiraeasalicifolia)、蒙古蕕(Caryopterismongholica)和虎榛子(Ostryopsisdavidiana),井兒梁白樺林下為天然高山草甸草原。

1.2 采樣方法

井兒梁、哈達(dá)門森林公園和小井溝3個樣地的所有樣本均采自陰坡。每個樣地選取生長良好的白樺25株,株距為50 m左右。采樣時,先用小鐵鍬除去表層枯枝落葉,沿著樹的根部輕輕拽到根的末端,深度在10—40 cm,收集根際土壤裝入無菌塑料袋中并編號,然后帶回實驗室進(jìn)行混樣,每個樣地的25個土樣混在一起,過孔徑1 mm篩?；旌虾蟮耐翗臃譃閮煞?一份用于土壤理化性質(zhì)的測定,另一份用于高通量測序。每個樣地的土壤選取4個平行樣本,井兒梁樣地(A2)編號為BP15、BP16、BP17、BP18,哈達(dá)門森林公園樣地(B2)編號為BP25、BP26、BP27、BP28,小井溝樣地(C2)編號為BP35、BP36、BP37、BP38。

1.3 白樺根際土壤樣品的理化性質(zhì)

對土壤樣品理化性質(zhì)的檢測交由內(nèi)蒙古綠恒生態(tài)科技有限公司完成,檢測項目包括全氮(TN)、速效鉀(AK)、有效磷(EP)、銨態(tài)氮(AN)、硝態(tài)氮(NN)、有機(jī)質(zhì)(OM)、含水量(WC)和pH(表1)。

全氮采用半微量凱氏定氮法；速效鉀采用乙酸銨浸提-火焰光度法；有效磷用0.5 mol/L NaHCO3法,分光光度計測定；銨態(tài)氮和硝態(tài)氮采用氯化鉀溶液浸提-流動注射法；土壤有機(jī)質(zhì)采用重鉻酸鉀外加熱法測定；土壤含水量測定采用烘干法；土壤 pH 值采用 1∶2.5土水比,酸度計測定[33]。

1.4 土壤總DNA提取、PCR擴(kuò)增及文庫的構(gòu)建

采用mobio土壤微生物 DNA 強(qiáng)力提取試劑盒PowerSoil? DNA Isolation Kit對根際土壤樣品基因組DNA進(jìn)行提取。細(xì)菌 16S rRNA (V3+V4)區(qū)域引物：5′- ACTCCTACGGGAGGCAGCA- 3′,5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT- 3′。PCR反應(yīng)體系：基因組DNA40- 60 ng,上下游引物(10 μmol/L)各1.5 μL,Q5 High-Fidelity DNA Polymerase 0.2 μL,High GC Enhancer 10 μL,Bμffer 10 μL,dNTP 1 μL,補(bǔ)水至總體積50 μL。擴(kuò)增條件：95℃ 5 min；95℃ 1 min, 50℃ 1 min,72℃ 1 min,擴(kuò)增15個循環(huán)；72℃延伸 7 min。第二輪擴(kuò)增反應(yīng)體系：目的區(qū)域PCR純化產(chǎn)物 10 μL,MPPI-a(10μmol/L)1 μL,MPPI-b(10μmol/L)1 μL,2×Phusion HF MM 20 μL,補(bǔ)水至總體積40 μL。擴(kuò)增條件：98℃ 30 s；98℃ 10 s,65℃ 30 s,72℃ 30 s,擴(kuò)增10個循環(huán)；72℃延伸 5 min。PCR結(jié)束后,對產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。PCR產(chǎn)物經(jīng)磁珠法回收后,純化后的產(chǎn)物進(jìn)行Nanodrop 2000定量后,按照質(zhì)量比1∶1進(jìn)行混樣[34]。由北京百邁客生物科技有限公司進(jìn)行后續(xù)的樣品建庫與宏基因測序。

1.5 數(shù)據(jù)分析

對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接,將拼接得到的序列進(jìn)行質(zhì)量過濾,并去除嵌合體,得到高質(zhì)量的Tags序列。在相似性 97% 的水平上對序列進(jìn)行聚類,以測序所有序列數(shù)的0.005%作為閾值過濾 OTU。

對樣品α多樣性指數(shù)的分析采用Mothur軟件進(jìn)行,計算ACE、Chao1、Shannon和Simpson等物種多樣性指數(shù)。Alpha多樣性(Alpha diversity)反映的是單個樣品物種豐度(richness)及物種多樣性(diversity),有多種衡量指標(biāo)：Chao1、Ace、Shannon、Simpson。Chao1和Ace指數(shù)衡量物種豐度即物種數(shù)量的多少。Shannon和Simpson指數(shù)用于衡量物種多樣性,受樣品群落中物種豐度和物種均勻度(Community evenness)的影響。相同物種豐度的情況下,群落中各物種具有越大的均勻度,則認(rèn)為群落具有越大的多樣性；Shannon指數(shù)值越大,Simpson指數(shù)值越小,說明樣品的物種多樣性越高。覆蓋率數(shù)值越高,則樣本中序列沒有被測出的概率越低,該指數(shù)反映了本次測序結(jié)果是否代表樣本的真實情況。

Shannon指數(shù)按下式計算,其中Pi為第i種細(xì)菌數(shù)量占細(xì)菌總量的比值。

均勻度按下式計算,其中S為細(xì)菌的總物種數(shù)。

EH=H/lnS

Chao1 指數(shù)按下式計算,其中,SChao1= 估計的OTU數(shù)；Sobs=實際OTU數(shù)；n1=只有一條序列的OTU數(shù)目；n2=只有兩條序列的 OTU數(shù)目。

ACE 指數(shù)按下式計算：

其中,n1=只含有一條序列的OTU的數(shù)目；N=抽樣中出現(xiàn)的總序列數(shù)目。

β多樣性(Beta diversity)分析使用QIIME軟件進(jìn)行,比較多組樣本在物種多樣性方面存在的相似程度。本研究采用主坐標(biāo)分析(Principal coordinates analysis,PCoA)。通過主坐標(biāo)分析可以實現(xiàn)多個樣品的分類,進(jìn)一步展示樣品間物種多樣性差異。坐標(biāo)圖上距離越近的樣品,相似性越大。

運(yùn)用 R 軟件進(jìn)行各種分析圖的繪制與結(jié)果輸出。利用Canoco(version 4.5)軟件對細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與土壤理化因子進(jìn)行冗余分析(RDA)。用SPSS 22.0軟件進(jìn)行細(xì)菌豐度和土壤理化性質(zhì)的相關(guān)性分析及顯著性檢驗。不同處理的均值在5%的顯著性水平下做 LSD(Least significant difference)多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤理化性質(zhì)

呼和浩特市大青山3個樣地土壤的理化性質(zhì)測定結(jié)果見表1。井兒梁、哈達(dá)門森林公園和小井溝的土壤全氮含量、速效鉀、有效磷、有機(jī)質(zhì)和土壤含水量間均存在顯著差異(P<0.05)；井兒梁樣地的銨態(tài)氮含量顯著低于哈達(dá)門森林公園和小井溝；井兒梁和哈達(dá)門森林公園的硝態(tài)氮含量顯著高于小井溝。

2.2 測序結(jié)果評估

通過對大青山3個采樣地白樺根際土壤的12個樣本中細(xì)菌的高通量測序,得到原始序列共876074條,經(jīng)數(shù)據(jù)優(yōu)化后得到有效序列708847條,序列平均長度420 bp左右。土壤細(xì)菌OTUs的稀釋曲線如圖1所示,12個樣本的稀釋曲線最終趨于平緩,說明測序數(shù)據(jù)量足以反映樣品中的物種多樣性。

表1 呼和浩特市大青山3個樣地白樺根際土壤的理化性質(zhì)

Table 1 Physical and chemical properties of rhizosphere soil ofBetulaplatyphyllain three sampling sites in the Daqing Mountains, Hohhot

樣地Sampling sites全氮Total N(TN)/(g/kg)銨態(tài)氮Ammonium nitrogen(AN)/(mg/kg)硝態(tài)氮Nitrate nitrogen(NN)/(mg/kg)速效鉀Available K(AK)/(g/kg)有效磷Available P(AP)/(mg/kg)有機(jī)質(zhì)Organic matter(OM) /(g/kg)含水量WC(%)pH井兒梁(A2)2.92±0.05a16.46±0.83a3.34±0.43a0.17±0.02a4.75±0.15a67.08±2.24a29.00±1.00a6.95±0.11a哈達(dá)門(B2)2.54±0.08b29.57±1.75b2.92±0.26a0.29±0.02b9.43±0.25b84.59±4.36b22.67±1.53b6.88±0.08a小井溝(C2)3.87±0.05c27.16±3.06b2.32±0.2b0.39±0.02c8.51±0.34c94.42±0.93c14.67±1.53c6.34±0.09b

不同字母表示同一列內(nèi)各均值存在顯著性差異(P<0.05)

圖1 呼和浩特市大青山3個樣地白樺根際土壤細(xì)菌OTUs稀釋曲線Fig.1 Rarefaction curves of rhizosphere soil bacteria OTUs of Betula platyphylla in three sampling sites in the Daqing Mountains, Hohhot

2.3 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

在97%的相似度水平下,分析每個樣地的OTU個數(shù)。本研究結(jié)果表明(圖2),井兒梁(A2)、小井溝(B2)和哈達(dá)門森林公園(C2)三個樣地土壤細(xì)菌OTUs數(shù)量分別為1256、1281和1263個,其中3個不同樣地間共有細(xì)菌OTUs數(shù)量為1207個。而小井溝樣地的特有細(xì)菌OTUs數(shù)量最多,為9個；井兒梁樣地特有細(xì)菌OTUs為8個,哈達(dá)門森林公園樣地特有細(xì)菌OTUs數(shù)量最少,為6個。表明不同樣地間的細(xì)菌OTU組成存在一定的差異。

圖2 呼和浩特市大青山3個樣地白樺根際土壤細(xì)菌OTUs數(shù)量(A2：井兒梁,B2：小井溝,C2：哈達(dá)門森林公園)Fig.2 Number of bacterial OTUs in rhizosphere soil of Betula platyphylla in three sampling sites in the Daqing Mountains, Hohhot(A2: Jingerliang, B2: Xiaojinggou, C2: Hadamen Forest Park)

2.4 優(yōu)勢細(xì)菌分析

通過對高通量測序結(jié)果的分析,從3個樣地的土壤樣本中測序得到根際細(xì)菌OTUs共有1308個,分屬于28門、90綱、126目、213科、286屬。在門水平上(圖3),相對豐度大于1%的門分別為變形菌門(Proteobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、綠彎菌門(Chloroflexi)、硝化螺旋菌門(Nitrospirae)、疣微菌門(Verrucomicrobia)及擬桿菌門(Bacteroidetes)。在3個樣地中相對豐度最高的門均為變形菌門、酸桿菌門和放線菌門,其中變形菌門OTUs數(shù)量最多,在井兒梁(A2)、小井溝(B2)和哈達(dá)門森林公園(C2)3個樣地中所占比例分別為26.82%、30.83%和28.21%；酸桿菌門在3個樣地中的相對豐度分別為21.67%、18.93%和19.09%；放線菌門在3個樣地的相對豐度分別為14.56%、20.78%和21.76%,這3個門的相對豐度之和在各樣地中均超過60%。在進(jìn)行聚類熱圖分析時(圖4),發(fā)現(xiàn)小井溝(B2)和哈達(dá)門森林公園(C2)首先聚為一類,表明這2個樣地在細(xì)菌門水平上的物種組成上更為接近,與井兒梁(A2)的物種組成存在一定的差異。

圖3 呼和浩特市大青山3個樣地白樺根際土壤細(xì)菌門水平的群落結(jié)構(gòu)(A2：井兒梁,B2：小井溝,C2：哈達(dá)門森林公園)Fig.3 Bacterial community structure in rhizosphere soil of Betula platyphylla at phylum level in three sampling sites in the Daqing Mountains, Hohhot(A2: Jingerliang, B2: Xiaojinggou, C2: Hadamen Forest Park)

圖4 呼和浩特市大青山3個樣地白樺根際土壤細(xì)菌門水平聚類熱圖(A2：井兒梁,B2：小井溝,C2：哈達(dá)門森林公園)Fig.4 Bacterial cluster heatmap at phylum level in rhizosphere soil of Betula platyphylla in three sampling sites in the Daqing Mountains, Hohhot(A2: Jingerliang, B2: Xiaojinggou, C2: Hadamen Forest Park)

2.5 α多樣性指數(shù)分析

在97%相似度水平下,3個樣地α多樣性指數(shù)值統(tǒng)計結(jié)果如表2所示。分析表明不同樣地白樺根際土壤細(xì)菌多樣性、均勻度和豐富度均有一定差異。香農(nóng)指數(shù)和辛普森指數(shù)分析表明,小井溝(B2)和哈達(dá)門森林公園(C2)的根際細(xì)菌多樣性較高,與井兒梁(A2)有顯著性差異(P<0.05)。ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)分析表明,小井溝(B2)和哈達(dá)門森林公園(C2)白樺根際細(xì)菌豐度高于井兒梁(A2)。另外,所有樣地的OTU覆蓋率均超過99%,同時結(jié)合土壤細(xì)菌OTU稀釋曲線(圖1),說明本次測序能檢測到環(huán)境中絕大多數(shù)的物種,研究結(jié)果能反映大青山白樺根際土壤樣本中微生物的真實情況。

2.6 β多樣性指數(shù)分析

通過對3個樣地白樺根際土壤細(xì)菌群落PCoA聚類結(jié)果分析(圖5),發(fā)現(xiàn)本研究中每個樣地的4個重復(fù)均聚類于同一象限(除B2樣地有一個重復(fù)與其他3個重復(fù)不在同一象限),說明樣品的重復(fù)性較好,組內(nèi)變異相對較??；而3個樣地均聚類于不同象限,說明組間差異明顯。

PC1為造成樣品差異性最大的主坐標(biāo)成分,解釋度為71.18%；其次為PC2,解釋度為15.58%,兩個主坐標(biāo)軸的總解釋度達(dá)到86.76%。在PC1維度上,能將井兒梁(A2)的樣品與小井溝(B2)和哈達(dá)門森林公園(C2)的樣品很好地分開,這與前面小井溝(B2)和哈達(dá)門森林公園(C2)的物種組成比井兒梁(A2)更為相似的結(jié)果一致。

表2 呼和浩特市大青山3個樣地白樺根際土壤細(xì)菌的α多樣性指數(shù)(A2：井兒梁,B2：小井溝,C2：哈達(dá)門森林公園)

Table 2 Diversity index of rhizosphere soil bacteria ofBetulaplatyphyllain three sampling sites in the Daqing Mountains, Hohhot(A2: Jingerliang, B2: Xiaojinggou, C2: Hadamen Forest Park)

樣地Sampling siteACE指數(shù)ACE indexChao1指數(shù)Chao1 index辛普森指數(shù)Simpson index香農(nóng)指數(shù)Shannon index覆蓋率CoverageA21188.32±12.24a1196.46±25.87a0.0079±0.0003a5.83±0.01a0.99±0.0010aB21223.45±13.30b1230.74±26.74a0.0062±0.0005b6.01±0.03b0.99±0.0009aC21211.13±15.65b1221.71±16.31a0.0061±0.0005b5.99±0.01b0.99±0.0010a

不同字母表示同一列內(nèi)各均值存在顯著性差異(P<0.05)

圖5 呼和浩特市大青山3個樣地白樺根際土壤細(xì)菌群落 PCoA 聚類圖(A2：井兒梁,B2：小井溝,C2：哈達(dá)門森林公園)Fig.5 PCoA analysis of bacterial communities in rhizosphere soil of Betula platyphylla in three sampling sites in the Daqing Mountains, Hohhot(A2: Jingerliang, B2: Xiaojinggou, C2: Hadamen Forest Park)

2.7 環(huán)境因子對細(xì)菌群落的響應(yīng)

圖6 呼和浩特市大青山白樺根際土壤細(xì)菌群落與環(huán)境因子之間關(guān)系的RDA 分析Fig.6 RDA analysis of bacterial community associated with environmental factors in rhizosphere soil of Betula platyphylla in the Daqing Mountains, HohhotAct：Actnobacteria；Chl：Chlorflexi；Pla：Plantomycetes；Gem：Gemmationagetes；Aci：Aciobacteria；Nit：Nitrsirae；Bac：Bacterodetes；Pro：Protebacteria；Ver：Verucomicrobia

通過對白樺根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與土壤理化性質(zhì)的RDA分析與相關(guān)性分析(圖6和表4),發(fā)現(xiàn)TN、pH和WC對白樺根際主要優(yōu)勢細(xì)菌的影響較大,各環(huán)境因子對3個樣地土壤細(xì)菌優(yōu)勢門的影響順序為TN>pH>WC>AK>NN>AN>OM>EP。TN與酸桿菌門、芽單胞菌門、Latescibacteria、硝化螺旋菌門和疣微菌門呈極顯著正相關(guān),與放線菌門、擬桿菌門、變形菌門和浮霉菌門呈極顯著或顯著負(fù)相關(guān)；pH與放線菌門、浮霉菌門、擬桿菌門和變形菌門呈極顯著或顯著正相關(guān),與酸桿菌門、Latescibacteria、硝化螺旋菌門、疣微菌門和浮霉菌門呈極顯著負(fù)相關(guān)；WC與浮霉菌門、放線菌門呈極顯著或顯著正相關(guān),與疣微菌門、硝化螺旋菌門和Latescibacteria呈顯著負(fù)相關(guān)；AK與浮霉菌門和放線菌門呈極顯著或顯著負(fù)相關(guān),與疣微菌門呈顯著正相關(guān)；NN與疣微菌門呈顯著負(fù)相關(guān)；AN與綠彎菌門和浮霉菌門呈極顯著或顯著負(fù)相關(guān)；OM與疣微菌門呈顯著正相關(guān),與浮霉菌門呈極顯著負(fù)相關(guān)；EP與綠彎菌門呈極顯著負(fù)相關(guān)。

表4 呼和浩特市大青山白樺根際土壤細(xì)菌門水平群落結(jié)構(gòu)與土壤理化性質(zhì)相關(guān)性分析

Table 4 Correlation analysis between physical-chemical properties and bacterial community on phylum level in rhizosphere soil ofBetulaplatyphyllain the Daqing Mountains, Hohhot

TNAKEPANNNOMpHWC酸桿菌門 Acidobacteria0.885??0.6470.1270.215-0.1550.493-0.806??-0.653放線菌門 Actinobacteria-0.934??-0.690?-0.156-0.2670.574-0.5620.861??0.733?擬桿菌門Bacteroidetes-0.926??-0.4820.1170.0210.558-0.3660.763?0.544綠彎菌門 Chloroflexi0.109-0.485-0.807??-0.810??0.300-0.5860.2470.468芽單胞菌門 Gemmatimonadetes0.822??0.337-0.301-0.122-0.2840.153-0.599-0.352Latescibacteria0.953??0.6260.0490.149-0.5470.518-0.881??-0.672?硝化螺旋菌門Nitrospirae0.968??0.6550.1020.227-0.6640.577-0.925??-0.728?浮霉菌門Planctomycetes-0.750?-0.876??-0.568-0.688?0.778-0.827??0.861??0.875??變形菌門Proteobacteria-0.837??-0.4540.0870.0820.465-0.3910.740?0.501疣微菌門Verrucomicrobia0.954??0.792?0.3080.333-0.748?0.735?-0.937??-0.862??

* 表示顯著相關(guān) (P<0.05),**,表示極顯著相關(guān) (P<0.01)

3 討論

3.1 大青山白樺根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)

細(xì)菌多樣性對于維持土壤生態(tài)平衡具有重要作用。土壤中具有非常豐富的細(xì)菌多樣性,不同環(huán)境及不同類型的土壤中既有相似的細(xì)菌組成,同時又有各自的優(yōu)勢類群[35]。Xia等對我國從南到北不同森林類型(包括熱帶森林、亞熱帶森林、溫帶森林和北方森林類型)的115個典型森林土壤樣品的研究表明,發(fā)現(xiàn)放線菌門的相對豐度最高 (22%),其次是酸桿菌門(18%)、疣微菌門(Verrucomicrobia)(8.68%)和浮霉菌門(Planctomycetes)(6.75%),而擬桿菌門(Bacteroidetes)的相對豐度僅為1.4%[36]。Liu等對我國西北部黑土中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的研究表明,豐度大于5%的門有酸桿菌門、放線菌門、變形菌門、擬桿菌門、綠彎菌門(Chloroflexi)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)和浮霉菌門[37]。翟婉璐等通過對浙江省杭州市雷竹林下土壤細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)的研究,發(fā)現(xiàn)變形菌門(30. 80%)、酸桿菌門(22. 0%)和放線菌門(平均相對豐度13.9%)為該林下的優(yōu)勢門[38]。Zeng等通過對陜西黃土高原不同植被區(qū)(森林、森林草地、草地、沙漠和沙漠生態(tài)系統(tǒng))土壤細(xì)菌的研究,發(fā)現(xiàn)放線菌門和變形菌門、綠彎菌門、酸桿菌門、 浮霉菌門是所有樣品中的優(yōu)勢門,其中放線菌門和變形菌門的豐度最高[10]。丁新景等對黃河三角洲 4 個不同樹種(臭椿、榆樹、白蠟和刺槐)人工林根際土壤細(xì)菌的分析表明,酸桿菌門、變形菌門和放線菌門的相對豐度大于 10%,是根際土壤中的優(yōu)勢群落[39]。Yuan等研究表明,青藏高原高山草地土壤中酸桿菌門和變形菌門的豐度最高[40]。其他針對森林生態(tài)系統(tǒng)的研究結(jié)果也表明,土壤細(xì)菌中酸桿菌門、放線菌門和變形菌門的相對豐度較高[41- 42],主要是由于該類細(xì)菌具有較寬的生態(tài)位,并且對不同環(huán)境的適應(yīng)性強(qiáng)。本文研究結(jié)果也表明,白樺根際土壤中變形菌門、酸桿菌門和放線菌門的細(xì)菌的相對豐度在3個采樣地均最高,各樣地中3個門的相對豐度之和均高于60%,是該地區(qū)白樺根際土壤中的優(yōu)勢細(xì)菌群落。綜上所述,在門水平上,雖然土壤細(xì)菌多樣性及其群落結(jié)構(gòu)隨不同森林類型、土壤、植被等的不同而存在一定的差異,但土壤中的優(yōu)勢類群基本相同。

土壤細(xì)菌在生態(tài)系統(tǒng)的有機(jī)物分解以及營養(yǎng)循環(huán)中發(fā)揮了重要作用。研究中變形菌門(Proteobacteria)在3個樣地中的相對豐度均最高(26.8%—30.8%),在屬水平上,短根瘤菌屬 (Bradyrhizobium)(相對豐度1.3%—2.1%)和硝化螺旋菌屬(Nitrospira)(相對豐度1.1%—1.7%)的相對豐度較高。有報道指出,部分該類細(xì)菌具有固氮、解磷作用[43],它們的存在參與了土壤氮磷循環(huán),在改善土壤環(huán)境中發(fā)揮了重要作用。由于酸桿菌門是一類新劃分出的細(xì)菌類群,目前,對其研究較少,但已有研究表明,酸桿菌門細(xì)菌能夠降解復(fù)雜的木質(zhì)素與纖維素,進(jìn)而提高土壤養(yǎng)分[44],有研究者已從這類細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)了可編碼纖維素酶和半纖維素酶的基因[45]。放線菌大部分為腐生菌,其中部分種類能夠分泌分解木質(zhì)素的酶,表明具有分解木質(zhì)素和纖維素的能力[46]。另外,有研究發(fā)現(xiàn)放線菌門具有共生固氮和解磷作用[47],因此,這類細(xì)菌在森林生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)中可能發(fā)揮了重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)芽單胞菌門的相對豐度僅次于上述3門,在3個樣地的相對豐度在8.20%—10.20%,高于其他研究者的報道,如海南降香黃檀不同混交林芽單胞菌門的相對豐度在1.1%—2.6%[48]；三江平原小葉章濕地土壤芽單胞菌門的相對豐度在1.0%—2.0%[49]。這可能是由于芽單胞菌門的部分細(xì)菌具有耐鹽或嗜鹽的特性,適宜在含鹽量較高的土壤中生存,而呼和浩特周邊地區(qū)的土壤屬于典型的鹽土類型,有利于這類細(xì)菌的繁殖。

3.2 環(huán)境因子與白樺根際土壤細(xì)菌的關(guān)系

環(huán)境生態(tài)因子對植物根際微生物的分布存在顯著影響[10,14]。字洪標(biāo)等通過對青海省云杉、白樺、落葉松和山楊組成的 7 種不同林分類型的土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)的研究,發(fā)現(xiàn)pH值和土壤含水量是影響土壤微生物群落的主要因素[29]。丁新景等對黃河三角洲4個不同樹種人工林根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的研究表明,土壤電導(dǎo)率、堿解氮、有效磷和速效鉀含量是土壤細(xì)菌結(jié)構(gòu)和多樣性的主要影響因素,土壤含水量和有效磷含量與細(xì)菌豐度存在顯著相關(guān)性[39]。本文研究發(fā)現(xiàn),TN、pH和WC對白樺根際主要優(yōu)勢細(xì)菌(門水平)的影響較大。氮常常是土壤中的限制性營養(yǎng)成分[14],土壤N有效性與根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的變化密切相關(guān)[9]。Magill等對森林土壤的研究結(jié)果表明,隨著土壤N含量的增加,酸桿菌門的多樣性也增加[50]。本文研究發(fā)現(xiàn),TN與酸桿菌門、芽單胞菌門、Latescibacteria、硝化螺旋菌門、疣微菌門、放線菌門、擬桿菌門、變形菌門和浮霉菌門的相對豐度存在顯著或極顯著相關(guān)性,表明TN是影響細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的主要因子。土壤pH值是細(xì)菌群落組成的最重要的驅(qū)動因素,這一觀察結(jié)果在多項研究(尤其是對森林土壤的研究)中得到證實[35,49]。有研究表明,酸桿菌門細(xì)菌在酸性土壤環(huán)境中有較高的豐度[51- 52]。研究發(fā)現(xiàn)酸桿菌門的相對豐度與pH呈極顯著負(fù)相關(guān)(表4),酸桿菌門在3個樣地的相對豐度分別為21.67%、18.93%和19.09%,低于柳春林等[53]報道的53.3%—67.8%(鼎湖山森林土壤,pH3.00—4.50)和隋心等[54]報道的53.0%(三江平原土壤,pH5.39—5.85),這可能是由于酸性環(huán)境更有利于酸桿菌門細(xì)菌的生長繁殖。而本研究樣地大青山土壤pH基本接近中性,因此,酸桿菌門細(xì)菌相對豐度低于酸性土壤。綜上所述,由于不同研究者考察的環(huán)境因子不同,因此,目前針對森林生態(tài)系統(tǒng)中土壤優(yōu)勢細(xì)菌受環(huán)境因子的影響程度尚無定論。

本研究利用 Illumina 高通量測序技術(shù)對呼和浩特市大青山白樺根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及其多樣性進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)變形菌門(Proteobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)和放線菌門(Actinobacteria)是白樺根際土壤的優(yōu)勢細(xì)菌門,TN、pH和WC是白樺根際優(yōu)勢細(xì)菌門的主要影響因子,3個樣地白樺根際土壤細(xì)菌多樣性、均勻度和豐富度均有一定差異。小井溝和哈達(dá)門森林公園樣地白樺的伴生灌木一致,井兒梁樣地白樺林下為草甸草原,研究發(fā)現(xiàn),小井溝和哈達(dá)門森林公園白樺根際土壤細(xì)菌的多樣性及豐度(ACE指數(shù))顯著高于井兒梁。