超聲波處理對稻谷表面微生物的影響

蔡 偉，嚴卓晟 ，William Jia Lan，彭 彬，鐘堅文 ，張 杰 ，胡瓊波

（1.華南農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，廣東 廣州 510642；2.廣州市金稻農(nóng)業(yè)科技有限公司，廣東 廣州 510075；3.上海交通大學法學院，上海 200240；4.廣東省農(nóng)業(yè)機械化技術(shù)推廣總站，廣東 廣州 510500）

【研究意義】水稻是我國的主要糧食作物，其高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)是我國糧食安全的重要基礎(chǔ)。隨著人們生活水平的提高，人們對食品安全問題日益關(guān)注。種子處理技術(shù)因其具備環(huán)境污染小、對病蟲防治效果好的特點，越來越受到政府的重視與市場的歡迎［1-2］。超聲波是一種頻率超過20 kHz的壓力波，它具有很好的方向性與穿透能力，因而在衛(wèi)生健康、科研與工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用［2］。種子超聲波處理不同于化學處理，其安全性更好，無污染，處理效率更高，更方便易用，因而近年來得到廣泛發(fā)展。但是超聲波處理水稻種子尚處于發(fā)展初期，它可促進發(fā)芽與培育壯秧［2］，但是否具有殺菌作用或者對水稻芽期和苗期病害的防治作用不得而知。研究超聲波對水稻種谷表面微生物的影響有助于促進種子處理技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用，為保證國家糧食安全做出貢獻?！厩叭搜芯窟M展】超聲波處理種子技術(shù)已經(jīng)用于小麥、玉米、油菜、國槐、鎖陽及蘇鐵等多種作物與林木植物，可促進種子萌發(fā)、提高植物抗病性，以及提高產(chǎn)量［3-7］。超聲波處理水稻種子的研究報告較少，主要考察了超聲波對種谷的刺激作用、種谷體內(nèi)各種生理活性的改變，以及對水稻種子發(fā)芽、出苗及產(chǎn)量的影響，發(fā)現(xiàn)超聲波處理能提高水稻種子活力、打破種子休眠、促進種子萌發(fā)及幼苗生長、增強種子的抗逆性以及提高產(chǎn)量［2,8-9］。可見，超聲波處理水稻種子技術(shù)應(yīng)用還很粗放，必須進一步掌握超聲波對種谷本身及其表面微生物的影響規(guī)律，優(yōu)化處理方法。【本研究切入點】針對目前水稻種子超聲波處理技術(shù)發(fā)展不足，不了解超聲波對水稻種谷表面微生物影響的相關(guān)數(shù)據(jù)的前提下，本試驗設(shè)置不同的超聲波種谷處理方式，包括濕法與干法處理，以及使用不同的超聲波頻率，比較不同處理方式對種谷表面不同種類真菌與細菌的殺菌效果。【擬解決的關(guān)鍵問題】發(fā)現(xiàn)不同超聲波處理方式對種谷表面不同種類微生物的影響規(guī)律，為種谷超聲波處理技術(shù)最優(yōu)化提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試水稻品種為象牙香占，種谷為廣州市金稻農(nóng)業(yè)科技有限公司貯藏的生產(chǎn)用種。超聲波處理設(shè)備為JD-50L植物種子增產(chǎn)處理機（廣州市金稻農(nóng)業(yè)科技有限公司）。

1.2 試驗方法

試驗設(shè)超聲波濕法（Twet）、50 kHz超聲波干法（Tdry1）和25 kHz超聲波干法（Tdry2）3個處理。Twet處理取種谷2 kg浸泡在2 L自來水中并用25～50 kHz變頻超聲波處理30 min，Tdry1處理將正常干燥種谷2 kg用50 kHz固定頻率超聲波處理30 min，Tdry2處理分別將正常干燥種谷2 kg用25 kHz固定頻率超聲波處理30 min，分別設(shè)濕法對照（CK1）與干法對照（CK2），3次重復。

1.3 種谷表面微生物分離純化

從上述處理與對照中分別取種谷1 g，置于99 mL 0.05%的吐溫-80的溶液中，搖勻，靜置15 min，取0.1 mL上清稀釋于99.9 mL 0.05%吐溫-80溶液中混勻為菌懸液。取0.1 mL上述菌懸液接種于PDA平板上（90 mm×15 mm一次性培養(yǎng)皿，海門市如意實驗器材廠），用三角棒均勻涂布，每個處理5個平板，25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48 h后，分離細菌，用接種針挑取細菌菌落于PDA平板上劃線繼續(xù)純化培養(yǎng)，37℃恒溫培養(yǎng)，再用滅菌牙簽挑取單菌落于裝有5 mL液體LB的離心管里在37℃的恒溫振蕩培養(yǎng)過夜，離心后分離菌體，可斜面與砂土管保藏。真菌純化則在上述DPA平板培養(yǎng)4～7 d后，用接種針挑取菌絲于PDA平板上，待菌落純化后斜面與砂土管保藏菌種，備用。

1.4 菌種鑒定

1.4.1 形態(tài)學鑒定 將純化后的菌種分別接種于PDA平板上，恒溫培養(yǎng)，觀察菌落顏色、形態(tài)與大小變化，顯微鏡下觀察測量細菌菌體及真菌的菌絲、孢子與產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)，拍照記錄。

1.4.2 分子生物學鑒定 細菌與真菌DNA的提取分別采用 Bacterial DNA Kit與HP Fungal DNA Kit 試劑盒（Omega Bio-tek, Inc., USA）。細菌的16S rDNA序列擴增采用通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'） 和 1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）， PCR 反應(yīng) 在 T100?Thermal Cycler PCR 儀（Bio-Rad，USA）上完成，反應(yīng)總體系為50 μL，其中細菌基因組 DNA 2 μL，ddH2O 19 μL，2×Power taq PCR MasterMix（廣州擎科生物技術(shù)有限公司）25 μL，引物 27F 2 μL，引物 1492R 2 μL。擴增程序：94℃預變性3 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸45 s，共35個循環(huán)；72℃延伸10 min。真菌rDNA ITS序列擴增采用通用引物ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）和 ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'），所用儀器和PCR反應(yīng)體系、程序與細菌相似，只是DNA改為真菌基因組DNA 2 μL，引物ITS1 2 μL，引物 ITS4 2 μL。

PCR產(chǎn)物進行2%瓊脂糖凝膠電泳，緩沖液為1×TAE，電壓150 V，電流220 mA，Marker DL2000作為分子量標準參照物。電泳結(jié)束后，在凝膠成像儀上面檢測并拍照記錄，所得的特異性PCR產(chǎn)物tvrt生工生物工程（上海）有限公司測序。將所測序列信息上傳Genebank數(shù)據(jù)庫，取得登錄號，并在NCBI數(shù)據(jù)庫中用BLAST搜索同源性較高的相關(guān)序列進行比對，將序列相同度≥98%定為同種菌株。

試驗數(shù)據(jù)分析與繪圖采用Excel 2000軟件（Microsoft Corporation, USA）。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲波處理對種谷表面微生物菌落數(shù)量的影響

不同方法的超聲波處理對種谷表面的細菌與真菌的影響不同，總體上，超聲波濕法處理比干法處理對微生物影響更顯著，而50 kHz超聲波比25 kHz超聲波處理影響較大。

由圖1A、圖2可知，超聲波濕法處理（Twet）可顯著減少細菌的菌落數(shù)量，處理組的細菌菌落數(shù)為165個/平板，顯著低于CK1的373個/平板，而兩種超聲波干法處理（Tdry1和Tdry2）均不能減少細菌菌落數(shù)量。由圖1B、圖2可知，超聲波濕法處理（Twet）可顯著減少真菌菌落數(shù)，處理組的真菌菌落數(shù)為1個/平板，顯著低于CK1的1.3個/平板；50 kHz超聲波干法處理（Tdry1）有真菌菌落3個/平板，顯著低于CK2，但25 kHz超聲波干法處理（Tdry2）與CK2無顯著差異。

2.2 超聲波處理對種谷表面微生物種類的影響

從種谷表面分離純化的細菌，經(jīng)形態(tài)學與分子生物學方法鑒定為15種（表1），都不是已經(jīng)報道過的植物病原菌，檢出最多的是肺炎克雷伯菌Klebsiella pneumoniae，其次為陰溝腸桿菌Enterobacter cloacae，它們在各個處理與對照中都有大量檢出，且差異不大（圖1A，表1）。在濕法對照（CK1）中檢出了12種細菌，濕法處理中（Twet）共檢出7種細菌，未檢出銅綠假單胞菌Pseudomonasaeruginosa、粘金黃桿菌Chryseobacteriumgleum、鼠李糖短桿菌Brachybacteriumrhamnosum、變異賴氨酸桿菌Lysinibacillusvarians與成團泛菌Pantoea agglomerans等5種在濕法對照（CK1）中出現(xiàn)的細菌（圖1A）。從干法處理（Tdry1，Tdry2）與干法對照（CK2）中檢出的細菌差異不大，除了甘蔗黃單胞菌Xanthomonas sacchari和嗜麥芽窄食單胞菌Stenotrophomonas maltophilia只在干法對照中出現(xiàn)的2種外，其他種類在干法處理中都有檢出（圖1A，表1）。

從稻谷表面檢測到11種真菌（表2），以稻葉鞘腐敗病菌Sarocladium oryzae的檢出率最高，其次為草酸青霉菌Penicillium oxalicum，它們在各個處理與對照中都被檢出（圖1B）。在濕法對照（CK1）中檢出9種真菌菌，濕法處理中（Twet）檢出7種真菌，未檢出再育鐮孢菌Fusarium proliferatum與串珠鐮孢菌Gibberella fujikuroi等2種在濕法對照（CK1）中出現(xiàn)的真菌（表2，圖1B）。從干法對照（CK2）中檢出10種真菌，50 kHz（Tdry1）與25 kHz（Tdry2）2個干法處理中分別檢出9種與6種真菌，但50 kHz干法處理（Tdry1）未檢出干法對照（CK2）中出現(xiàn)的多變根毛霉菌Rhizomucor variabilis、尖孢鐮孢菌Fusarium oxysporum、莖點霉Phomasp.與串珠鐮孢菌Gibberella fujikuroi等4種真菌（表2，圖1B）。

圖1 種谷表面分離的細菌（A）與真菌（B）菌落數(shù)量Fig.1 The number of bacterial colonies separated from the surface of rice

圖2 PDA平板上的微生物菌落Fig.2 Microbial colonies in PDA plates

3 討論

水稻芽期與苗期是比較脆弱的生育期，容易受到不良環(huán)境及有害生物的侵襲，種子帶菌是傳播惡苗病、綿腐病、立枯病、稻瘟病、稻曲病等病害的主要途徑，因此，發(fā)展種子處理技術(shù)是提高種谷發(fā)芽率以及培育壯苗壯秧的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［1］。本研究結(jié)果表明，超聲波處理種谷可以殺滅其表面細菌與真菌，但殺菌效果與處理方式有關(guān)，濕法處理比干法處理效果好，這可能是由于在濕法處理時水被超聲空化，形成瞬時局部的高溫和高壓，達到殺菌效果；干法處理時50 kHz超聲波比25 kHz超聲波殺菌效果好，這是由于25 kHz超聲波干法處理的能量不足，導致其殺菌效果不如50 kHz超聲波干法處理，這與制糖工藝中的超聲波殺菌原理相似，殺菌效果與超聲波的頻率、強度及處理介質(zhì)相關(guān)。為了進一步提高超聲波處理種谷的殺菌效果，應(yīng)該以濕法處理為基礎(chǔ)，進一步優(yōu)化超聲波頻率與強度以及水分與溫度控制等條件，達到最好的殺菌效果。

表1 種谷表面的細菌種類Table 1 Bacterial species on the Surfaces of Rice seeds

表2 種谷表面的真菌種類Table 2 Fungal species on the Surfaces of Rice seeds

本研究鑒定的種谷表面真菌種類與劉西麗等［10］的研究結(jié)果大體上一致。許多植物病原真菌如鐮刀菌屬的一些種類，包括再育鐮刀菌Fusariumproliferatum、尖孢鐮刀菌Fusarium oxysporum、串珠鐮刀菌Fusariummoniliforme及木賊鐮刀菌Fusariumequiseti等，它們都是水稻立枯病的病原菌［11］，還有尚未鑒定種的莖點霉屬Phomasp.和鐮刀菌Fusariumsp.也可能是植物致病菌。超聲波對上述病菌都有一定殺菌作用，這些種傳病原的減少可有效減少水稻芽期與幼苗期病害，促進水稻壯秧壯苗。其中，多變根毛霉菌Rhizomucor variabilis被超聲波顯著抑制，但該菌多見于機會引起人和動物皮質(zhì)感染［12］，而它與水稻的互作關(guān)系未見研究報導；Sarocladium oryzae是水稻葉鞘腐敗病的病原菌，影響水稻結(jié)實，降低稻谷產(chǎn)量與米質(zhì)［13］。另外4種真菌，即木賊鐮孢菌Fusariumequiseti、草酸青霉菌Penicilliumoxalicum、黃曲霉菌Aspergillusflavus和節(jié)菱孢霉菌Arthrobotrysfoliicola，超聲波殺菌效果不顯著，可能是因為其豐度相對較高。

本研究檢測到的細菌中，只見植物病原菌甘蔗黃單胞菌Xanthomonassacchari報道，可引起甘蔗葉片褪綠條紋?。↙eafChloroticStreak Disease）［14］，但該菌也可能是一種內(nèi)生菌，并且從水稻上分離了該菌的一個菌株，對一些病原菌有拮抗作用，具有作為生防菌的潛力［15-16］，超聲波處理對該菌具有殺菌效果，但其對水稻生長發(fā)育有何效應(yīng)需要進一步研究。其他被檢測到的細菌均非植物病原菌，而多為人的條件性致病菌（當人體免疫力低下時可能被感染），如假單胞菌Pseudomonasaeruginosa、粘金黃桿菌Chryseobacteriumgleum、成團泛菌Pantoea agglomerans、嗜麥芽窄食單胞菌Stenotrophomonas maltophilia、棲稻假單胞菌Pseudomonas oryzihabitans（棲稻黃單胞菌Flavimonas oryzihabitans）、陰溝腸桿菌Enterobactercloacae、肺炎克雷伯菌Klebsiellapneumoniae、格氏多列桿菌Pluralibactergergoviae及居泉沙雷氏菌Serratia fonticola等都屬于此類細菌［17-20］。超聲波對前5種有殺菌作用，但對其余的殺菌效果較差，這可能是由于后者的豐度較高，陰溝腸桿菌、肺炎克雷伯菌、及居泉沙雷氏菌等都有很高的分離率。另外2種菌（鼠李糖短桿菌Brachybacterium rhamnosum和變異賴氨酸桿菌Lysinibacillus varians）目前未見該菌對人有致病性的研究報道，超聲波對其殺菌效果也比較好，可能也與其豐度較低有關(guān)。

4 結(jié)論

超聲波處理對種谷有殺菌作用，但殺菌效果與超聲波處理方式及微生物種類及其豐度有關(guān)?？傮w上，超聲波濕法處理（Twet）優(yōu)于干法處理，而50 kHz超聲波干法處理（Tdry1）優(yōu)于25 kHz超聲波干法處理（Tdry2）。本研究檢測到的15種種谷表面細菌中，僅甘蔗黃單胞菌Xanthomonas sacchari是植物病原菌，其他大多為條件性人的致病菌。超聲波對甘蔗黃單胞菌Xanthomonas sacchari、假單胞菌Pseudomonasaeruginosa、粘金黃桿菌Chryseobacteriumgleum、成團泛菌Pantoea agglomerans、嗜麥芽窄食單胞菌Stenotrophomonas maltophilia等豐度較低的細菌殺菌效果較好，但對陰溝腸桿菌Enterobactercloacae和肺炎克雷伯菌Klebsiellapneumoniae等豐度較高的細菌殺菌效果較差；檢測到的11種真菌中許多是植物病原菌，超聲波對層生鐮刀菌Fusariumproliferatum、尖孢鐮刀菌Fusariumoxysporum、串珠鐮刀菌Fusarium moniliforme，木賊鐮刀菌Fusariumequiseti與莖點霉菌Phomasp.等殺菌效果較好，而對稻葉鞘腐敗病菌Sarocladiumoryzae及草酸青霉菌Penicillium oxalicum等殺菌效果不顯著，可能是由于后者豐度太高所致殺菌效果偏低。超聲波處理對種谷表面的植物病原菌殺菌作用可能是是其促進水稻壯秧壯苗增產(chǎn)的原因。本研究結(jié)果可指導超聲波稻種處理技術(shù)的進一步優(yōu)化研究，促進該技術(shù)在種子處理中的發(fā)展與應(yīng)用。