生物有機(jī)肥中微生物的分離鑒定及液體菌劑的構(gòu)建

陳揚(yáng)波，卞杰松，劉彩霞，湯鑫鑫

（1.湘南學(xué)院化學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院/湘南稀貴金屬化合物及其應(yīng)用湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 郴州 423000）

【研究意義】化肥的廣泛使用在一定程度上促進(jìn)了作物的生長(zhǎng)，但是不應(yīng)該低估對(duì)土壤和環(huán)境的危害，化肥的大量使用導(dǎo)致土壤板結(jié)，減少了土壤有機(jī)質(zhì)含量和有益微生物數(shù)量［1］，導(dǎo)致農(nóng)作物產(chǎn)量減少，又因?yàn)榛手械窟^(guò)高，使得農(nóng)作物中NO3-、NO2-等離子濃度增加，對(duì)人畜會(huì)產(chǎn)生很大的毒害作用［2］。而生物有機(jī)肥是將家禽糞便、植物秸稈等通過(guò)無(wú)公害處理再往其中加入各種微生物菌種，因此微生物是生物有機(jī)肥的核心部分，微生物肥料具有增加微生物的數(shù)量，提升土壤中有機(jī)質(zhì)的含量，提高土壤營(yíng)養(yǎng)成分等優(yōu)點(diǎn)［3］；許多功能微生物能顯著改善土壤理化性質(zhì)，調(diào)節(jié)生態(tài)平衡［4］；微生物的一些代謝產(chǎn)物也能增強(qiáng)作物對(duì)惡劣環(huán)境的適應(yīng)性，微生物產(chǎn)生的抗生素能夠?qū)Υ蠖鄶?shù)有害菌產(chǎn)生拮抗作用［5］；使得最終的農(nóng)作物風(fēng)味也會(huì)得到極大的改善［6］。通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究了解生物有機(jī)肥中具體成分，完善生物肥料的作用機(jī)制，為生物有機(jī)肥的發(fā)展提供部分理論基礎(chǔ)。

【前人研究進(jìn)展】微生物肥料已經(jīng)有百余年歷史，國(guó)際上最早使用的是由根瘤菌組成的生物肥料，我國(guó)在20世紀(jì)40年代才開(kāi)始研究微生物肥料，最初都是在肥料中加入根瘤菌而成［7］；50年代早期逐漸在其中加入更多菌種，如固氮菌、磷細(xì)菌等；60年代開(kāi)始使用添加了放線菌的“5406”微生物菌肥；70年代中期開(kāi)始研發(fā)泡囊-叢枝菌根（AM菌根）［8］?？梢?jiàn)，我國(guó)微生物肥料經(jīng)歷了3次發(fā)展，但都沒(méi)有延續(xù)過(guò)長(zhǎng)的時(shí)間，由于當(dāng)時(shí)缺乏這方面的監(jiān)管，各品種良莠不齊，沒(méi)有一個(gè)適合的標(biāo)準(zhǔn)［9］。在20世紀(jì)90年代和21世紀(jì)初，當(dāng)時(shí)化肥大量使用，導(dǎo)致環(huán)境破壞嚴(yán)重，大家又重新將目光放到生物肥料上來(lái)?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前微生物肥料發(fā)展迅速，所能添加的微生物已有數(shù)十種，生物有機(jī)肥逐漸從單一變得復(fù)雜，其功能也越來(lái)越多［10］，現(xiàn)在我國(guó)提倡發(fā)展綠色農(nóng)業(yè)，而生物肥正是安全，無(wú)污染的肥料，我國(guó)幅員遼闊，耕地面積廣，今后生物肥料必定會(huì)有廣闊的前景［11］?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究主要從3個(gè)部分進(jìn)行，分別為微生物分離與鑒定、探究菌種間的拮抗實(shí)驗(yàn)、各菌種都適合生長(zhǎng)的液體培養(yǎng)基的配制。希望通過(guò)此次對(duì)生物有機(jī)肥的研究，能為后續(xù)微生物肥料的發(fā)展提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2018年10月至2019年1月在湘南學(xué)院化學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院實(shí)驗(yàn)樓進(jìn)行。

1.1.1 供試菌種 供試各菌種都分離自生物有機(jī)肥肥料，生物有機(jī)肥購(gòu)自郴州市同興南生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 培養(yǎng)基 固體培養(yǎng)基（牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基）：牛肉膏3.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，瓊脂18.0 g，水1 000 mL，pH 7.2～7.5。液體培養(yǎng)基（牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基）：牛肉膏3.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，水1 000 mL。兩種培養(yǎng)基均經(jīng)過(guò)高壓蒸汽滅菌30 min后使用。

1.1.3 主要設(shè)備 分析天平、超凈工作臺(tái)、電熱鼓風(fēng)干燥箱、光學(xué)顯微鏡、可見(jiàn)分光光度計(jì)、酶標(biāo)儀、高壓蒸汽滅菌鍋、高速冷凍離心機(jī)，pH酸度計(jì)、恒溫?fù)u床、打孔器、培養(yǎng)皿、冰箱、電磁爐。

1.2 細(xì)菌鑒定

1.2.1 形態(tài)觀察 將生物有機(jī)肥樣品進(jìn)行梯度稀釋后涂布到平板培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)48 h，得到4種菌落，將其編號(hào)為CZ1、CZ2、CZ3、CZ4。挑取單個(gè)菌落進(jìn)行純化，然后采用平板劃線法觀察單個(gè)菌落形態(tài)［12］。菌體形態(tài)觀察采用革蘭氏染色法，參照文獻(xiàn)［13］的步驟。

1.2.2 分子生物學(xué)鑒定 DNA提取參照文獻(xiàn)［14］的步驟。PCR擴(kuò)增：以提取出來(lái)的細(xì)菌基因組DNA為模板，采用引物R-F(AGAGTTTGATCCTGGCTCAG）和R-R（TACGGCTACCTTGTTACGACGACTT）進(jìn)行特異性擴(kuò)增。引物購(gòu)買(mǎi)于武漢擎科測(cè)序公司，所用的50 μL PCR反應(yīng)體系包括：基因組DNA 2 μL；引物R-F（10 μmol/L）2 μL；引物R-R（10 μmol/L）2 μL；TaqDNA 聚合酶 25 μL；加 H2O 至 50 μL。

PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性30s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸2 min。PCR完成后將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)［15］。

PCR產(chǎn)物鑒定：將電泳檢測(cè)后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，獲得16SrDNA基因序列，測(cè)序結(jié)果在美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（National Center of Biotechnology Information, NCBI）進(jìn)行分析比對(duì)，根據(jù)同源序列搜索結(jié)果，導(dǎo)出相關(guān)菌株的16SrDNA基因序列，與實(shí)驗(yàn)菌株一起用MEGA7構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)［16］。

1.3 拮抗試驗(yàn)

研究菌種間的拮抗關(guān)系采用菌餅法［17］，具體操作步驟如下：用接種環(huán)分別制作上述4種菌懸液，然后用移液管分別吸取0.5 mL于相應(yīng)的固體培養(yǎng)基上并用涂布器涂抹均勻，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d，然后用1 cm的打孔器在已培養(yǎng)2 d的4種培養(yǎng)基上制取多塊菌餅，然后將該菌餅放置在剛涂布有另一種菌的平板上，放置3塊，并在培養(yǎng)基上放一塊無(wú)菌餅塊作對(duì)照［18］。試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 各菌種間拮抗實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Experimental design of antagonism among various strains

1.4 液體菌劑構(gòu)建

將牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基的初始pH調(diào)節(jié)為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，并將4種菌按1∶1∶1∶1的比例分別接種于不同pH的液體培養(yǎng)基中，置于37℃恒溫培養(yǎng)振蕩器中培養(yǎng)48 h，然后通過(guò)稀釋涂布平板法測(cè)定有效活菌數(shù)。選擇菌種長(zhǎng)勢(shì)較好的pH值作為該混合菌種的最適pH值［19］。

圖1 各菌種菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology of various stains

圖2 各菌種菌體形態(tài)Fig.2 Morphology of various stains

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌鑒定

2.1.1 形態(tài)觀察 通過(guò)平板劃線法觀察到單個(gè)的菌落，其形態(tài)特征如下：CZ1，菌落粗糙，不透明，粘著，擴(kuò)展，邊緣粗糙；CZ2，菌落表面粗糙，不透明，污白色或微黃色，邊緣整齊；CZ3，菌落呈白色或微黃色，表面光滑，邊緣整齊；CZ4，菌落凸起，微白色，濕潤(rùn)，邊緣整齊，菌落背面為黃色（圖1）。

菌體形態(tài)通過(guò)革蘭氏染色法以及顯微鏡觀察，結(jié)果見(jiàn)圖2。在油鏡下觀察到的菌體形態(tài)特征如下：CZ1，有芽孢，無(wú)莢膜，不成鏈能運(yùn)動(dòng)，革蘭氏染色呈紫色，細(xì)胞直徑為0.6～0.9 μm×1.0～1.5 μm；CZ2，有芽孢，無(wú)莢膜，周生鞭毛，能運(yùn)動(dòng)，革蘭氏染色呈紫色，細(xì)胞直徑為0.7～0.8 μm×2～3 μm；CZ3，有芽孢，菌體末端圓，單個(gè)或呈短鏈排列，革蘭氏染色呈紫色，細(xì)胞直徑為 1.2～1.5 μm×2.0～4.0 μm；CZ4，無(wú)芽孢，菌體形態(tài)呈直或彎的桿狀單個(gè)、成對(duì)或呈鏈狀排列，革蘭氏染色呈紫色，細(xì)胞直徑為0.9～1.2 μm×3.0～8.0 μm。鏡檢發(fā)現(xiàn)4種細(xì)菌的顏色都為紫色，說(shuō)明4種菌均為革蘭氏陽(yáng)性菌。

2.1.2 分子生物學(xué)鑒定 通過(guò)16SrDNA基因序列同源性比對(duì)，構(gòu)建4種細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)見(jiàn)圖3。從圖3可以看出，CZ1與地衣芽孢桿菌屬（B.licheniformis）同源性達(dá)100%，CZ2與枯草芽孢桿菌屬（B.subtilis）同源性達(dá)100%，CZ3與巨大芽孢桿菌屬（B.megaterium）同源性達(dá)100%，CZ4與植物乳桿菌屬（L.plantarum）同源性達(dá)100%。因此可以確定CZ1為地衣芽孢桿菌，CZ2為枯草芽孢桿菌，CZ3為巨大芽孢桿菌，CZ4為植物乳桿菌。

圖3 4種菌的16SrDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree for 16SrDNA sequences of four species of bacteria

2.2 各菌種間的拮抗作用

試驗(yàn)采用C值表示抑菌作用的大小，C值是指抑菌圈直徑與菌餅直徑的比值，地衣芽孢桿菌對(duì)枯草芽孢桿菌和植物乳桿菌有拮抗作用，它們的C值分別為1.18和1.15；枯草芽孢桿菌對(duì)巨大芽孢桿菌和植物乳桿菌有拮抗作用，它們的C值分別為1.12和1.19；巨大芽孢桿菌和植物乳桿菌對(duì)其他菌種均無(wú)拮抗作用。

由圖4可知，地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和植物乳桿菌均用同一種培養(yǎng)基培養(yǎng)，對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)需求基本一致，但由于試驗(yàn)中地衣芽孢桿菌已先在培養(yǎng)基培養(yǎng)2 d，因此數(shù)量上會(huì)有一定的優(yōu)勢(shì)，在營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和生存空間等的競(jìng)爭(zhēng)上會(huì)占據(jù)一定的優(yōu)勢(shì)，從而對(duì)枯草芽孢桿菌和植物乳桿菌產(chǎn)生一定的抑制作用；同樣的，枯草芽孢桿菌已先在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)2 d，因此枯草芽孢桿菌的數(shù)量會(huì)比巨大芽孢桿菌和植物乳桿菌多一些，在營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、生長(zhǎng)空間等的競(jìng)爭(zhēng)中取得一定的優(yōu)勢(shì)，從而對(duì)巨大芽孢桿菌和枯草植物乳桿菌的生長(zhǎng)產(chǎn)生一定的抑制效果，而且對(duì)于植物乳桿菌而言，枯草芽孢桿菌對(duì)其抑制作用較大，可能是因?yàn)榭莶菅挎邨U菌的代謝產(chǎn)物對(duì)植物乳桿菌的生長(zhǎng)產(chǎn)生一定的抑制作用；其他菌種之間均無(wú)拮抗作用，因?yàn)镃值均為1，它們可以共同生長(zhǎng)。

圖4 各菌種拮抗試驗(yàn)結(jié)果Fig.4 Result of antagonistic test of various strains

2.3 液體菌劑的構(gòu)建

2.3.1 pH對(duì)混合菌種生長(zhǎng)的影響 按地衣芽孢桿菌∶枯草芽孢桿菌∶巨大芽孢桿菌∶植物乳桿菌=1∶1∶1∶1的比例混合接種在不同pH的液體培養(yǎng)基中，用稀釋涂布平板法測(cè)定有效活菌數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表2。從表2可以看出，當(dāng)培養(yǎng)基pH為7.0時(shí)，各菌種均生長(zhǎng)良好，有效活菌數(shù)比其他pH下明顯要多，說(shuō)明該混合菌劑的最適pH為7.0。因此，使用牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，將pH調(diào)至7.0，從而得到一種高效的液體菌劑。

表2 不同pH液體培養(yǎng)基中的有效活菌數(shù)（×108個(gè)/mL）Table 2 Number of effective living bacteria in liquid media with different pH (×108 cell/ mL)

3 討論

生物有機(jī)肥為當(dāng)下較熱門(mén)的問(wèn)題，搞清楚其中的菌種刻不容緩。本試驗(yàn)經(jīng)過(guò)菌體、菌落、分子手段三方面的鑒定，力求能做到精確，在清楚其中菌種類(lèi)型之后，考慮到可以配置液體菌劑，且這種菌劑比固體生物有機(jī)肥有益生菌數(shù)量多、效力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，通過(guò)拮抗實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各菌種之間的共存關(guān)系，表明這4種菌之間均無(wú)拮抗作用，可以共同生長(zhǎng)，這為構(gòu)建液體菌劑提供了一個(gè)極好的理論基礎(chǔ)。液體菌劑要求菌種數(shù)量要足夠多，同時(shí)也需要各菌種較均衡，不能一枝獨(dú)秀，由于這4種菌都屬于細(xì)菌，因此選擇牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基作為實(shí)驗(yàn)環(huán)境。影響液體菌劑構(gòu)建的因素包括pH、營(yíng)養(yǎng)成分、菌種初始比例等，本試驗(yàn)中牛肉膏蛋白胨的成分是一致的，而不同菌種的最適pH不同，混合培養(yǎng)時(shí)的最適pH更加值得探究，因此pH是最主要的一個(gè)影響因素，在牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中添加其他營(yíng)養(yǎng)成分對(duì)混合微生物生長(zhǎng)的影響會(huì)在今后的試驗(yàn)中加以研究。通過(guò)菌餅法證實(shí)沒(méi)有拮抗，因此采用地衣芽孢桿菌∶枯草芽孢桿菌∶巨大芽孢桿菌∶植物乳桿菌=1∶1∶1∶1的比例進(jìn)行最適pH的測(cè)定。對(duì)各菌懸液進(jìn)行吸光度測(cè)試，保證初始菌種數(shù)量基本一致，避免因某種菌數(shù)量過(guò)多而影響其他菌生長(zhǎng)發(fā)育。生物有機(jī)肥的具體作用機(jī)制目前尚未明朗，可以肯定其具有巨大的發(fā)展前景，應(yīng)更深入其作用機(jī)理研究，完善科研手段和科研設(shè)備，增加微生物肥料的種類(lèi)，更大限度提高農(nóng)作物產(chǎn)量。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)從生物有機(jī)肥中分離出4種菌，經(jīng)鑒定分別為地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌和植物乳桿菌。通過(guò)菌餅法和平板涂布法對(duì)各菌種之間的拮抗作用以及培養(yǎng)條件進(jìn)行研究，表明這4種菌之間均無(wú)拮抗作用，雖然地衣芽孢桿菌對(duì)枯草芽孢桿菌和植物乳桿菌有拮抗作用（C值分別為1.18和1.15），枯草芽孢桿菌對(duì)巨大芽孢桿菌和植物乳桿菌也有拮抗作用（C值分別為1.12和1.19），但C值均小于1.2，因此將它們之間的拮抗忽略不計(jì)，因?yàn)榫炆系木雅囵B(yǎng)生長(zhǎng)了2 d，在數(shù)量上有一定的優(yōu)勢(shì)，會(huì)由于數(shù)量的差異而產(chǎn)生一定的抑菌作用，所以忽略不計(jì)。巨大芽孢桿菌和植物乳桿菌對(duì)其他菌種均無(wú)拮抗作用。

由于這4種菌之間均無(wú)拮抗作用，將地衣芽孢桿菌∶枯草芽孢桿菌∶巨大芽孢桿菌∶植物乳桿菌按1∶1∶1∶1添加到不同pH的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，并用稀釋涂布平板法測(cè)定有效活菌數(shù)，最終得到最適pH為7.0，即使用牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，將pH調(diào)至7.0時(shí)各菌種都能很好的的生長(zhǎng)，由此可得到一種高效的液體菌劑。