不同發(fā)酵條件對柱狀田頭菇菌絲產(chǎn)胞外多糖的影響

鄭曉雅，殷偉偉，張 松，蘭 瑛

（1.華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510631；2.深圳市匯尚科科技有限公司，廣東 深圳 518055）

【研究意義】食用菌多糖是由10個以上的單糖以糖苷鍵連接而成的天然高分子聚合物，可從食藥用真菌子實(shí)體、菌絲體、發(fā)酵液中分離得到，是一種具有多種功能的活性多糖［1-3］。柱狀田頭菇（Agrocybe aegerita）又稱為茶薪菇，隸屬真菌門擔(dān)子菌綱糞銹傘科田菇屬［4-5］，是集多糖、氨基酸、菌蛋白等多種營養(yǎng)物質(zhì)及保健食療于一身的食用菌，其蓋嫩柄脆、口感鮮美，可用于烹制各類佳肴，營養(yǎng)成分高，屬高檔食用菌類。柱狀田頭菇還具有極高的藥用價值［6-7］，有研究表明，柱狀田頭菇因含有蛋白質(zhì)、多糖、維生素、生物堿等成分，具有多種重要的生理功能，如抑菌［8］、抗腫瘤［9-10］、抗氧化及延緩衰老［11-12］。其中，多糖是柱狀田頭菇中最重要的活性成分之一，具有抗氧化、減少肝損傷及提高免疫活性等作用［13-14］。由于食藥用菌的固體培養(yǎng)耗時長，從子實(shí)體中提取多糖周期較長且較難實(shí)現(xiàn)連續(xù)化生產(chǎn)。而液體發(fā)酵生產(chǎn)周期短，可連續(xù)生產(chǎn)，且在發(fā)酵液中產(chǎn)生多糖、多肽等多種生理活性物質(zhì)，類似于子實(shí)體的營養(yǎng)成分。因此，利用液體發(fā)酵法生產(chǎn)提取制備柱狀田頭菇多糖是實(shí)現(xiàn)其工業(yè)化生產(chǎn)的重要途徑和方法。【前人研究進(jìn)展】目前對柱狀田頭菇的液體發(fā)酵研究主要集中于對其菌絲體生物量的研究。劉明等［15］以菌絲體生物量為指標(biāo)，篩選到適合茶樹菇液體培養(yǎng)的培養(yǎng)基為豆粕粉0.4%、葡萄糖2%、MgSO40.1%、KH2PO40.1%，最適培養(yǎng)溫度為26 ℃，適宜起始pH值為6.5；劉敏等［16］以菌絲體為指標(biāo)，得到最適宜的培養(yǎng)基配方為葡萄糖3.0%、豆餅粉1.0%、酵母膏 0.2%、MgSO4·7H2O 0.1%、KH2PO40.10%， 培養(yǎng)條件為起始pH 6～7、培養(yǎng)溫度25～28 ℃、搖床轉(zhuǎn)速150～180 r/min。【本研究切入點(diǎn)】目前對柱狀田頭菇液體培養(yǎng)產(chǎn)胞外多糖條件的優(yōu)化研究較少，且已有研究中所用豆餅粉等培養(yǎng)基成分較為復(fù)雜，無法保證從發(fā)酵液中提取的胞外多糖純度?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本文研究了柱狀田頭菇液體發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳、氮源及其濃度以及發(fā)酵條件對柱狀田頭菇產(chǎn)胞外多糖的影響，并根據(jù)胞外多糖產(chǎn)量優(yōu)化得到適宜的發(fā)酵條件，旨在提高柱狀田頭菇的胞外多糖產(chǎn)量，為柱狀田頭菇進(jìn)一步的開發(fā)利用及其多糖工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試菌株：柱狀田頭菇菌株，由華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院提供。

培養(yǎng)基配方：（1）平板菌種培養(yǎng)基配方：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，蛋白胨1 g，（NH4）2SO42 g，MgSO4·7H2O 1 g，KH2PO41 g，瓊脂20g，加水定容至1 000 mL，pH值調(diào)至6.5。（2）液體發(fā)酵的基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方：葡萄糖20 g，硝酸鈉2 g，KH2PO41.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，F(xiàn)eCl30.2 g，ZnCl20.1 g，MnSO40.1 g，維生素B10.1 g，Na2HPO41 g，CaCl20.01g，營養(yǎng)液20 mL，加水定容至1 000 mL，pH值調(diào)至6.5。其營養(yǎng)液配方：CaCl21.00 g，AlK（SO4）20.01 g，CuSO40.01 g，Na2MoO4·2H2O 0.01 g，H3BO30.01 g，加水定容至1 000 mL。

儀器設(shè)備：AB204-N電子分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；TH-A3560C高壓滅菌鍋（造鑫企業(yè)有限公司）；ZHJH-1109超凈工作臺（上海智城分析儀器制造有限公司）；雙層大容量全溫度恒溫培養(yǎng)振蕩器（上海智城分析儀器制造有限公司）；SHZ-D（III）循環(huán)水真空泵（鞏義市英峪予華儀器廠）；RE-52D旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海市青浦滬西儀器廠）；UV1700紫外-可見光分光儀（日本島津公司）；H.H.S水浴鍋（上海浦東榮豐科學(xué)儀器公司）；DL-101-2烘箱（天津市申環(huán)實(shí)驗(yàn)電爐有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

按基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方，轉(zhuǎn)速為180 r/min，培養(yǎng)時間為8 d，進(jìn)行以下培養(yǎng)條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

1.2.1 液體發(fā)酵適宜起始pH值篩選 將液體培養(yǎng)基配方用1 mol/L HCl或1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)起始pH 值為 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，研究不同起始pH值對產(chǎn)胞外多糖的影響。

1.2.2 液體發(fā)酵適宜碳源篩選 用篩選出的起始pH值，分別采用葡萄糖、甘露醇、乳糖、可溶性淀粉、果糖和蔗糖代替基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的碳源，使培養(yǎng)基中碳元素含量為600 mmol/L，觀察不同碳源對產(chǎn)胞外多糖的影響。

1.2.3 液體發(fā)酵適宜氮源篩選 用篩選出的起始pH值和碳源，以蛋白胨、NaNO2、NH4NO3、（NH4）2SO4、尿素、L-甲硫氨酸和L-谷氨酰胺代替基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的氮源，使培養(yǎng)基中氮元素含量為20 mmol/L，觀察不同氮源對產(chǎn)胞外多糖的影響，篩選出培養(yǎng)基的最適氮源。

1.2.4 液體發(fā)酵適宜碳源濃度篩選 用篩選出的起始pH值、碳源、氮源，分別設(shè)定碳源濃度為1、5、20、40、100 g/L，探究不同濃度碳源對產(chǎn)胞外多糖的影響。

1.2.5 液體發(fā)酵適宜氮源濃度篩選 用篩選出的起始pH值、碳源及濃度、氮源，分別設(shè)定氮源濃度為0.1、0.5、2、5、20 g/L，探究不同濃度氮源對產(chǎn)胞外多糖的影響。

1.2.6 液體發(fā)酵適宜轉(zhuǎn)速篩選 用篩選出的起始pH值和碳、氮源及其濃度，分別將搖床轉(zhuǎn)速設(shè)置為100、150、180、200、250 r/min，觀察不同轉(zhuǎn)速對產(chǎn)胞外多糖的影響，篩選出液體發(fā)酵的適宜轉(zhuǎn)速。

1.2.7 液體發(fā)酵適宜培養(yǎng)時間篩選 用篩選出的起始pH值、碳氮源及其濃度、轉(zhuǎn)速，進(jìn)行不同培養(yǎng)時間的選擇試驗(yàn)，從試驗(yàn)第4天開始取樣測定發(fā)酵液中胞外多糖產(chǎn)量，每隔2 d取樣測定1次，試驗(yàn)持續(xù)16 d，觀察不同發(fā)酵時間對產(chǎn)胞外多糖的影響，篩選出液體發(fā)酵的最適培養(yǎng)時間。

上述試驗(yàn)均按培養(yǎng)基配方制備培養(yǎng)液，將100 mL培養(yǎng)液裝入250 mL三角瓶，除了含有甲硫氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺的培養(yǎng)基采用微孔濾膜及針頭式過濾器過濾除菌外，其余培養(yǎng)基高壓滅菌（121℃）35 min備用。將菌株轉(zhuǎn)接于平板培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿內(nèi)，制成平板菌種，用同一打孔器（直徑為4 mm）在平板菌種的同一半徑上打孔，將等量菌栓接入培養(yǎng)基，置于ZHWY-2102型振蕩培養(yǎng)箱，在26 ℃、轉(zhuǎn)速180 r/min下避光恒溫振蕩培養(yǎng)。采用隨機(jī)分組設(shè)計(jì)，3次重復(fù)。

1.3 測定指標(biāo)及方法

多糖產(chǎn)量測定：發(fā)酵液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮后去蛋白、脫色、醇沉、透析及冷凍干燥，得到胞外多糖。采用苯酚-硫酸法［17］測定總糖含量，計(jì)算其相對于葡萄糖的換算因子f：

f=m/ρ0D0

式中，m為多糖質(zhì)量（μg），ρ0為多糖液中葡萄糖的質(zhì)量濃度，D0為多糖的稀釋因數(shù)［18］。

多糖產(chǎn)量=ρ×D×f

式中，ρ為樣品溶液中葡萄糖含量，D為樣品溶液的稀釋倍數(shù)，f為換算因子。

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，采用Duncan法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同起始pH值對柱狀田頭菇菌絲產(chǎn)胞外多糖的影響

發(fā)酵液起始pH值的變化直接影響食用菌菌絲體細(xì)胞內(nèi)pH值的變化，間接影響到細(xì)胞內(nèi)酶的活性，pH值過高或過低都會對某些酶的活性起到抑制作用，從而使菌絲代謝減緩，影響菌絲生長，進(jìn)而影響菌絲產(chǎn)胞外多糖。一般認(rèn)為，pH值對酶活性的影響是通過細(xì)胞內(nèi)H+或OH-影響酶蛋白的電荷和解離度，而改變酶的結(jié)構(gòu)和功能來實(shí)現(xiàn)的［19］。不同起始pH值對柱狀田頭菇菌絲產(chǎn)胞外多糖的影響見圖1，柱狀田頭菇在pH值4.0～10.0范圍內(nèi)均可生長，且在該范圍內(nèi)均可產(chǎn)生胞外多糖，含量總體都比較平穩(wěn)，其中pH值7.0時，胞外多糖產(chǎn)量最高、平均產(chǎn)量達(dá)0.7244 g/L，故可將柱狀田頭菇液體發(fā)酵起始pH值選定為7.0。

圖1 不同起始pH值對柱狀田頭菇菌絲產(chǎn)胞外多糖的影響Fig.1 Effects of different initial pH values on the extracellular polysaccharides produced by mycelia of Agrocybe aegerita

2.2 不同碳源對柱狀田頭菇菌絲產(chǎn)胞外多糖的影響

碳源是微生物生長繁殖所需的營養(yǎng)物質(zhì)，在細(xì)胞中起著重要作用。碳源主要用于供應(yīng)菌株生命活動所需要的能量，構(gòu)成菌體細(xì)胞及代謝產(chǎn)物，是食藥用菌液體培養(yǎng)的主要營養(yǎng)成分［20］。不同碳源對柱狀田頭菇菌絲產(chǎn)胞外多糖的影響見圖2，柱狀田頭菇在含6種不同碳源的培養(yǎng)基中都能生長并分泌胞外多糖，說明柱狀田頭菇菌絲可利用多種碳源。以可溶性淀粉為碳源時胞外多糖產(chǎn)量最高、達(dá)1.395 g/L，極顯著高于其他碳源；以甘露醇為碳源時多糖產(chǎn)量較低、僅為0.117 g/L。因此，柱狀田頭菇菌絲合成和分泌胞外多糖的適宜碳源是可溶性淀粉。

圖2 不同碳源對柱狀田頭菇菌絲產(chǎn)胞外多糖的影響Fig.2 Effects of different carbon sources on the extracellular polysaccharide produced by mycelia of Agrocybe aegerita

2.3 不同氮源對柱狀田頭菇菌絲產(chǎn)胞外多糖的影響

氮源主要用于構(gòu)成菌體細(xì)胞物質(zhì)和含氮代謝物，也是食藥用菌液體培養(yǎng)的主要營養(yǎng)成分［21］。不同氮源對柱狀田頭菇菌絲產(chǎn)胞外多糖的影響見圖3，從圖3可以看出，有機(jī)氮源和無機(jī)氮源均可被柱狀田頭菇菌絲體吸收、利用進(jìn)而產(chǎn)胞外多糖。以L-谷氨酰胺作為氮源時柱狀田頭菇液體發(fā)酵產(chǎn)胞外多糖最高、達(dá)1.018 g/L，其次是硝酸銨、亞硝酸鈉和蛋白胨，三者之間無顯著差異。

圖3 不同氮源對柱狀田頭菇產(chǎn)胞外多糖的影響Fig.3 Effects of different nitrogen sources on the extracellular polysaccharide produced by mycelia of Agrocybe aegerita

2.4 不同濃度可溶性淀粉對柱狀田頭菇菌絲產(chǎn)胞外多糖的影響

碳源濃度影響著菌絲體生長的速度和胞外多糖的產(chǎn)量，不同濃度可溶性淀粉對柱狀田頭菇菌絲產(chǎn)胞外多糖的影響見圖4。圖4顯示，在1～40 g/L濃度范圍內(nèi)，隨著可溶性淀粉濃度的增加，胞外多糖產(chǎn)量逐漸增加，可溶性淀粉濃度達(dá)到40 g/L時胞外多糖產(chǎn)量最大、為1.183 g/L。但是，胞外多糖產(chǎn)量在可溶性淀粉濃度為20 g/L和40 g/L時差異不顯著。當(dāng)?shù)矸蹪舛雀哂?0 g/L時，隨著濃度升高，胞外多糖產(chǎn)量下降。因此，淀粉濃度對柱狀田頭菇的胞外多糖產(chǎn)量影響較大，當(dāng)濃度較低時胞外多糖產(chǎn)量較低，濃度過高則會抑制菌絲體生長進(jìn)而影響胞外多糖的產(chǎn)生。因此，可將柱狀田頭菇液體發(fā)酵的可溶性淀粉濃度調(diào)控在20～40 g/L之間。

圖4 不同濃度可溶性淀粉對柱狀田頭菇菌絲產(chǎn)胞外多糖的影響Fig.4 Effect of different concentrations of soluble starch on the extracellular polysaccharide produced by mycelia of Agrocybe aegerita

2.5 不同濃度L-谷氨酰胺對柱狀田頭菇菌絲產(chǎn)胞外多糖的影響

不同濃度L-谷氨酰胺對柱狀田頭菇菌絲產(chǎn)胞外多糖的影響見圖5，在2 g/L濃度范圍內(nèi)，隨著氮源濃度的提高，胞外多糖產(chǎn)量逐漸增加。當(dāng)?shù)礉舛葹? g/L時，胞外多糖產(chǎn)量達(dá)最高、為1.360 g/L，極顯著高于其他濃度處理；當(dāng)?shù)礉舛却笥? g/L時，胞外多糖產(chǎn)量隨氮源濃度的升高反而下降。因此，2 g/L為柱狀田頭菇液體發(fā)酵時L-谷氨酰胺的適宜濃度。

圖5 不同濃度L-谷氨酰胺對柱狀田頭菇菌絲產(chǎn)胞外多糖的影響Fig.5 Effects of different concentrations of L-Glutamine on the extracellular polysaccharide produced by mycelia of Agrocybe aegerita

2.6 不同轉(zhuǎn)速對柱狀田頭菇菌絲產(chǎn)胞外多糖的影響

搖床轉(zhuǎn)速與發(fā)酵液中的溶氧水平密切相關(guān)，限制著菌絲的生長、長勢、營養(yǎng)物質(zhì)利用率、營養(yǎng)成分轉(zhuǎn)化等，轉(zhuǎn)速過高和過低都不利于菌絲體發(fā)酵產(chǎn)糖［22］。不同轉(zhuǎn)速對柱狀田頭菇菌絲產(chǎn)胞外多糖的影響見圖6，圖6顯示，當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速為100 r/min時，胞外多糖產(chǎn)量較低；隨著搖床轉(zhuǎn)速升高至180 r/min時，胞外多糖產(chǎn)量達(dá)到最大值、為0.804 g/L，與其他轉(zhuǎn)速處理的胞外多糖產(chǎn)量相比達(dá)到極顯著差異；當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速大于180 r/min時，胞外多糖產(chǎn)量急劇下降。因此，柱狀田頭菇液體發(fā)酵的適宜轉(zhuǎn)速是180 r/min。

圖6 不同轉(zhuǎn)速對柱狀田頭菇產(chǎn)胞外多糖的影響Fig.6 Effects of different shaking speed on the extracellular polysaccharide produced by myceliaof Agrocybe aegerita

2.7 不同發(fā)酵時間對柱狀田頭菇菌絲產(chǎn)胞外多糖的影響

圖7 不同發(fā)酵時間對柱狀田頭菇菌絲產(chǎn)胞外多糖的影響Fig.7 Effects of different culture time on the extracellular polysaccharides produced by mycelia of Agrocybe aegerita

由圖7可知，胞外多糖在4～8 d內(nèi)分泌緩慢，隨著菌絲的不斷生長而大量合成并分泌多糖，培養(yǎng)到第12天時胞外多糖產(chǎn)量最高，與在其他培養(yǎng)時間處理的胞外多糖產(chǎn)量差異極顯著，而后隨著培養(yǎng)時間的延長，胞外多糖產(chǎn)量下降。因此，柱狀田頭菇菌絲體液體發(fā)酵產(chǎn)胞外多糖適宜的培養(yǎng)時間為12 d。

3 討論

在食用菌的液體培養(yǎng)中，pH值是重要的影響因素之一。劉敏等［16］以菌絲體為檢測指標(biāo)對茶樹菇液體發(fā)酵條件進(jìn)行探究，得到其液體發(fā)酵最適初始pH值為6.0～7.0。陳少英［23］以多糖產(chǎn)量為指標(biāo)，得到茶樹菇液體發(fā)酵最適pH值為5.6，而鄧超等［24］的研究結(jié)果則是保持pH值為自然狀態(tài)。本研究發(fā)現(xiàn)柱狀田頭菇液體培養(yǎng)產(chǎn)胞外多糖的最適起始pH值為7.0，從結(jié)果可知柱狀田頭菇可在中性及偏微酸的環(huán)境下生長，且培養(yǎng)基成分的不同可能影響起始pH值的確定。

前人對桑黃、樟芝等真菌進(jìn)行液體培養(yǎng)基條件的研究表明，碳源分別為蔗糖和葡萄糖、氮源分別為氯化銨和酵母浸粉時，胞外多糖產(chǎn)量最高，并發(fā)現(xiàn)不同種類真菌對碳源、氮源的要求不同［25-26］。陳少英和鄧超等探究了茶樹菇液體發(fā)酵產(chǎn)胞外多糖的碳氮源條件，得出最適碳源為小麥粉和玉米粉、最適氮源為酵母浸膏和酵母粉［23-24］。本研究中，柱狀田頭菇在多種碳源中均可生長并分泌多糖，說明其可利用多種碳源，其中以可溶性淀粉為碳源時胞外多糖產(chǎn)量最高，其次分別為蔗糖、葡萄糖、乳糖和果糖，且均沒有顯著差異。對于氮源來說，本試驗(yàn)中以L-谷氨酰胺為氮源時胞外多糖產(chǎn)量最高，其次是硝酸銨、蛋白胨和亞硝酸鈉。本研究結(jié)果與前人研究結(jié)果有較大不同，造成差異的原因可能是前人研究選擇的碳氮源均為純天然來源的有機(jī)碳源和氮源，成分較為復(fù)雜，可能會對從發(fā)酵液中提取的胞外多糖產(chǎn)量產(chǎn)生干擾；而本試驗(yàn)中均選擇結(jié)構(gòu)確定的化合物作為碳氮源，導(dǎo)致結(jié)果存在一定差異。

此外，在食用菌液體發(fā)酵過程中，營養(yǎng)物質(zhì)濃度過低不能滿足菌絲生長的需要，濃度過高則會抑制菌絲生長［27］，因此培養(yǎng)基C/N是一個很重要的參考指標(biāo)，而適宜的碳源和氮源物質(zhì)更容易被菌絲分解利用［28］。在適宜的碳氮比條件下，適宜的碳源物質(zhì)和氮源物質(zhì)可使菌絲生長良好，影響真菌多糖和脂類的產(chǎn)生和合成［29］。陳群等［30］結(jié)果表明，C/N為60時，柱狀田頭菇菌絲體多糖產(chǎn)量最高，而鄧超等［24］研究表明C/N約為6.7時柱狀田頭菇的多糖產(chǎn)量最高，陳少英［23］結(jié)果更低、C/N為2∶1。本研究通過對柱狀田頭菇碳源、氮源濃度的探究，選定C/N在10∶1～20∶1之間，產(chǎn)多糖較多。這與前人研究結(jié)果不同且差異很大，可能是與碳、氮源的濃度和種類有關(guān)，利用不同來源的碳源及氮源時，其最適濃度也會不一樣。

溶氧是發(fā)酵中的另一個重要因素，通過調(diào)整搖床轉(zhuǎn)速來控制溶氧量［31］，為菌絲體生長創(chuàng)造適宜環(huán)境，可提高胞外多糖的產(chǎn)量。有研究表明，搖床轉(zhuǎn)速為150 r/min時多糖產(chǎn)量最高［23-24］。劉敏等［16］研究表明，搖床轉(zhuǎn)速為150～180 r/min時，茶樹菇菌絲體生長最好。本研究中轉(zhuǎn)速為180 r/min時菌絲生長最好、胞外多糖產(chǎn)量最高，說明搖床轉(zhuǎn)速可能是通過影響菌絲球的生長來影響胞外多糖產(chǎn)量。此外，液體發(fā)酵周期一般為5～10 d，在此周期內(nèi)菌絲球生長直徑良好、密度高，有利于菌絲產(chǎn)胞外多糖。李炳功等［32］研究發(fā)現(xiàn)液體發(fā)酵灰樹花14 d時多糖產(chǎn)量最高，王儲炎等［33］研究發(fā)現(xiàn)液體培養(yǎng)黑芝菌6 d時胞外多糖產(chǎn)量最高，本研究中培養(yǎng)時間為12 d時柱狀田頭菇胞外多糖產(chǎn)量較高，說明不同菌種之間培養(yǎng)時間存在較大差異。

4 結(jié)論

本研究確定了柱狀田頭菇的適宜碳源是可溶性淀粉，其適宜濃度為20～40 g/L；適宜氮源是L-谷氨酰胺，濃度為2 g/L；最適起始pH值為7.0，搖床轉(zhuǎn)速為180 r/min，于26 ℃下培養(yǎng)12 d。在該發(fā)酵條件下，柱狀田頭菇的胞外多糖產(chǎn)量較高、為1.08 g/L，其中多糖含量為71.73%、蛋白質(zhì)含量為8.62%。研究結(jié)果為利用液體發(fā)酵工業(yè)化生產(chǎn)柱狀田頭菇多糖提供了理論依據(jù)。