超聲造影定量分析評(píng)價(jià)膿毒血癥兔致急性腎損傷腎功能狀態(tài)的研究

孫己晶 ，張兆光 ，陳學(xué)勛 ，王翠花 ，馬桂鳳 ，趙榮榮 ，羅倩 ，郭民

1.濰坊醫(yī)學(xué)院，山東濰坊 261000；2.濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，山東濰坊 261041

膿毒血癥是感染引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征，嚴(yán)重者可引起膿毒癥休克，甚至多器官功能衰竭。急性腎衰竭是危重癥患者常見的并發(fā)癥，其病死率高于其他原因引起的急性腎衰竭。因此，早期識(shí)別急性腎損傷，盡早干預(yù)可明顯降低其死亡率。該文旨在探討超聲造影技術(shù)在急性腎損傷早期腎功能評(píng)價(jià)中的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 儀器

iU22彩色多普勒超聲顯像儀，超聲造影劑Sono Vue,自動(dòng)生化分析儀，ELISA試劑盒。

1.2 動(dòng)物模型制備

健康新西蘭白兔20只，雄、雌各10只，體重1.5～2.5 kg，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，手術(shù)組采用CLP復(fù)制膿毒血癥AKI模型，即用10%水合氯醛0.3 mL/100 g腹腔麻醉，無菌條件下沿腹中線切開長(zhǎng)約2 cm，分離、結(jié)扎盲腸，在盲端腸壁用12號(hào)針穿刺2次，留置1條長(zhǎng)1 cm寬2 mm、兩頭貫穿盲腸的橡皮片，擠出少許糞便，將盲腸還納，逐層縫合腹壁，編號(hào)，清醒后轉(zhuǎn)入代謝籠內(nèi)自由進(jìn)水、進(jìn)食。術(shù)畢補(bǔ)充生理鹽水3 mL/100 g，術(shù)后自由飲水，并給予抗生素及相應(yīng)支持治療。28只存活超過12 h。

1.3 留取標(biāo)本

從術(shù)后腹壁縫合結(jié)束開始計(jì)時(shí)，分別于0、2、4、6、12 h為觀察點(diǎn)，下腔靜脈抽血5 mL，離心（3 000 r/min）15 min，取血清于-20℃保存，采用生化分析儀待測(cè)Scr、BUN；膀胱分離，膀胱穿刺收集尿標(biāo)本于-20℃保存，采用 ELISA 法待測(cè) KIM-1、IL-8、NGAL；后隨機(jī)處死一只兔子，取左腎切開置于10%多聚甲醛中固定，石蠟包埋，HE染色，光鏡下×200下取3個(gè)視野觀察腎臟病理變化。

1.4 超聲造影檢查方式

經(jīng)兔耳緣靜脈注入超聲造影劑混懸液，每次劑量為0.2 mL，隨后注入2 mL生理鹽水。同時(shí)啟動(dòng)圖像采集，觀察140S內(nèi)腎實(shí)質(zhì)回聲變化,用隨機(jī)定量分析軟件對(duì)感興趣區(qū)域進(jìn)行動(dòng)態(tài)分析研究，檢查結(jié)束后，在機(jī)曲線擬和,獲得腎灌注時(shí)間-密度曲線及一系列灌注參數(shù)，使用DICOM格式記錄各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的數(shù)據(jù)。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法

使用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，行t檢驗(yàn)，對(duì)所有連續(xù)變量進(jìn)行分布正態(tài)性檢驗(yàn)，組間比較SNK-q檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兔腎功能的變化

CLP 術(shù)后 6 h，膿毒血癥兔尿 KIM-L、NGAL、IL-18均于6 h開始顯著升高，12 h更高，均顯著高于建模前（P＜0.05）。 建模后 12 h，膿毒血癥兔 Scr、Urea 的濃度顯著升高，均明顯著高于建模前（P＜0.05）。

2.2 兔腎臟病理改變

HE染色光鏡下，建模前腎小球、腎小管結(jié)構(gòu)正常；模型組6 h開始出現(xiàn)炎性損傷，以12 h為著，表現(xiàn)為彌漫性單核-巨核細(xì)胞浸潤，組織間隙水腫，腎小管上皮細(xì)胞空泡變性、腫脹、脫落，甚至出現(xiàn)裸膜，部分腎小管腔閉塞，腎小管腔代償擴(kuò)張，管型形成。

表1 建模前及建模后不同時(shí)間點(diǎn)腎功能指標(biāo)的變化情況（±s）

表1 建模前及建模后不同時(shí)間點(diǎn)腎功能指標(biāo)的變化情況（±s）

注:與建模前同側(cè)腎臟比較，aP<0.05。

指標(biāo)0 h 2 h 4 h 6 h 12 h Scr（μmol/L）Urea（mmol/L）KIM-1（ng/L）NGAL（μg/mL）IL-18（pg/mL）50.2±7.8 3.35±1.72 1.19±0.14 0.56±0.11 58.32±18.53 65.31±10.82 5.22±3.01 1.21±0.07 0.73±0.39 62.64±20.41 70.42±13.25 8.25±4.01 1.41±0.16 1.10±0.76 70.46±21.45 72.38±10.8 9.02±5.01（2.54±0.77）a（2.40±0.99）a（96.95±23.47）a（102.18±14.91）a（13.54±3.11）a（3.92±0.23）a（3.19±0.87）a（117.61±38.0）a

表2 建模前后各時(shí)間點(diǎn)腎皮質(zhì)各項(xiàng)灌注參數(shù)比較（±s）

表2 建模前后各時(shí)間點(diǎn)腎皮質(zhì)各項(xiàng)灌注參數(shù)比較（±s）

注：與建模前同側(cè)腎臟比較，aP<0.05，bP<0.01。

指標(biāo) 部位0 h 2 h 4 h AUC（dB·s）TTP（t/s）DPI（dB）A（dB·s）α（dB·s）左腎右腎左腎右腎左腎右腎左腎右腎左腎右腎135.6±68.4 129.5±64.8 6.3±3.7 6.2±3.5 6.1±3.5 5.9±3.8 3.2±1.5 3.1±1.8 0.19±0.15 0.17±0.14 169.2±78.4 172.6±76.7 8.3±5.6 8.5±4.9 5.9±4.2 5.8±4.0 3.0±1.5 2.9±1.3 0.14±0.18 0.15±0.15（279.2±55.5）a（277.6±58.4）a（10.5±4.9）a（11.1±6.3）a 5.5±3.2 5.6±3.5（2.2±1.5）a（2.4±1.6）a（0.09±0.03）a（0.09±0.02）a 6 h 12 h（289.2±62.3）a（269.7±68.5）a（13.5±5.7）a（13.8±5.3）a（4.3±3.0）a（4.1±3.3）a（2.0±1.4）a（2.1±1.7）a（0.06±0.04）a（0.07±0.05）a（309.2±78.8）b（310.7±80.4）b（16.7±7.6）b（15.9±7.1）b（4.0±3.2）a（4.0±3.5）a（1.8±0.8）b（1.9±0.7）b（0.04±0.02）b（0.04±0.02）b

2.3 腎皮質(zhì)灌注實(shí)時(shí)觀察及參數(shù)分析

團(tuán)注超聲造影劑后，觀察到腎臟由腎動(dòng)脈、腎皮質(zhì)、腎髓質(zhì)的順序依次明顯增強(qiáng)，隨后逐漸消退。建模后4 h左右腎的腎皮質(zhì)AUC較建模前顯著增大 （P<0.05），TTP 較建模前顯著延長(zhǎng) （P<0.05），α、A 均顯著低于建模前（P<0.05），6、12 h 更著（P＜0.01），DPI于建模后6、12 h顯著低于建模前（P<0.05），而兩腎各時(shí)間點(diǎn)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討論

膿毒血癥時(shí)，腎臟內(nèi)皮細(xì)胞不僅被激活，產(chǎn)生炎癥因子，同時(shí)也是炎癥因子首要攻擊的靶細(xì)胞之一，從而導(dǎo)致腎臟灌注減少，造成腎臟損傷[1-2]。因此，及早發(fā)現(xiàn)并防治膿毒血癥并發(fā)急性腎損傷，保護(hù)腎功能意義重大。

目前對(duì)于AKI的功能檢測(cè)，通常采用Scr、BUN來評(píng)價(jià)[3]，但臨床上，GFR下降到正常的1/3時(shí)，Scr開始上升；GFR下降到正常的50%以下時(shí)，BUN開始上升[4]。一旦疾病診斷成立時(shí)，腎功能往往已到了不可挽回的地步，而且Scr、BUN受年齡、性別、藥物、肌肉代謝及操作方法等多因素影響，因此，并不是AKI早期評(píng)價(jià)腎功能最理想的方法。腎臟組織活檢是確定腎臟病理改變的唯一方法，但其屬有創(chuàng)性檢查，具有一定的風(fēng)險(xiǎn)，且患者依從性較差。通過復(fù)習(xí)相關(guān)文獻(xiàn)，篩選出可能在膿毒血癥致AKI早期發(fā)生特異性改變的尿液的生物學(xué)標(biāo)記物，如 NGAL、KIM-1、IL-8，測(cè)定這些生物學(xué)標(biāo)記物在膿毒血癥發(fā)生后的水平，可早期發(fā)現(xiàn)腎功能的損害，與傳統(tǒng)意義的血肌酐、尿素氮相比，是更早期的敏感指標(biāo)，但這些標(biāo)記物同樣受限于尿標(biāo)本的采集和檢驗(yàn)的局限性。該實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：CLP術(shù)后，膿毒血癥兔尿KIM-L、NGAL、IL-18均于6 h開始顯著升高，12 h更高，均顯著高于建模前，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。 建模后 12 h，膿毒血癥兔 Scr、Urea 的濃度顯著升高，均明顯著高于建模前，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。 表 1 可見，KIM-L、NGAL、IL-18 是較 Scr、Urea更能早期反映腎功能狀態(tài)的指標(biāo)。

超聲造影作為一種全新血流成像模式，更敏感、精確地顯示急性腎損傷早期腎臟血流灌注狀態(tài)的改變，尤其是對(duì)微小血管可提供更敏感、真實(shí)的血流信息，為臨床早期診斷急性腎損傷提供了新途徑[5]。腎皮質(zhì)灌注的實(shí)時(shí)觀察及灌注參數(shù)分析：經(jīng)肘靜脈團(tuán)注超聲造影劑后，可以觀察到沿腎動(dòng)脈、腎皮質(zhì)、腎髓質(zhì)顯影依次明顯增強(qiáng)，隨后逐漸消退。隨著腎臟病情不斷進(jìn)展，各超聲造影灌注參數(shù)值在不同時(shí)期均發(fā)生顯著變化。Dong等[6]、Wang等[7]的研究同樣表明超聲造影技術(shù)通過TIC曲線各灌注參數(shù)的變化來監(jiān)測(cè)患者腎功能狀態(tài)的改變。如表2所示：建模后4 h左右腎的腎皮質(zhì)曲線下面積 （279.2±55.5）dB·s 較建模前（135.6±68.4）dB·s 顯著增大 （P<0.05）， 達(dá)峰時(shí)間（10.5±4.9）t/s 較建模前 （6.3±3.7）t/s 顯著延長(zhǎng) （P<0.05），另外，下降斜率（α）、上升斜率（A）均顯著低于建模前（P<0.05），6、12 h 更為顯著（P<0.01），達(dá)峰絕對(duì)值（DPI）于建模后 6 h、12 h 顯著低于建模前（P<0.05），而兩腎各時(shí)間點(diǎn)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0.05）。通過對(duì)腎皮質(zhì)血流灌注的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，超聲造影技術(shù)能夠準(zhǔn)確顯示膿毒血癥兔急性腎損傷早期血流動(dòng)力學(xué)變化，于4 h后就發(fā)生顯著改變。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在兔AKI早期，超聲造影灌注參數(shù)值較血肌酐、尿素氮更敏感、精確，與毛世杰[8]等研究結(jié)果一致，且早于較敏感的尿KIM-L、NGAL、IL-18，而且隨著腎功能的下降，測(cè)定參數(shù)也隨之變化。

該研究建立比較完善的膿毒血癥腎功能損害的動(dòng)物模型，應(yīng)用超聲造影定量分析技術(shù)對(duì)動(dòng)物腎臟的血流灌注、腎功能狀態(tài)進(jìn)行分析，為臨床早期判斷膿毒血癥腎功能狀況提供一種新的手段。同時(shí)，可以作為AKI保守治療有效的監(jiān)測(cè)工具和手段[9]。