Flotillin-1在結(jié)腸癌中表達的初步研究

張暢 ，張佩云 ，鞠九妹 ，楊鎮(zhèn)旗 ，方錦玲 ，鐘鳳梅 ，方賢磊 ，謝柳

1.湖南醫(yī)藥學(xué)院醫(yī)學(xué)院，湖南懷化 418000；2.湖南醫(yī)藥學(xué)院第一附屬醫(yī)院病理科，湖南懷化 418000

結(jié)腸癌（colorectal cancer）是常見的消化系統(tǒng)的惡性腫瘤，僅次于胃癌和食管癌[1]。在我國，因惡性腫瘤死亡原因中，男性排在第五位，女性排在第6位，且近20年間發(fā)病率逐漸上升，男女比例約為2∶1[2]。其病因可能涉及環(huán)境因素、化學(xué)致癌物作用及基因的遺傳和表觀遺傳學(xué)變異等多個因素。

Flotillins/Reggies家族最早發(fā)現(xiàn)于金魚視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞中，是一類高度保守并廣泛表達的蛋白，在果蠅和人等多種生物中存在，有兩個成員，分別為Flotillin-1（Flot1）和 Flotillin-2（Flot2）[3]。Flotillins蛋白主要定位于細胞膜胞質(zhì)側(cè)，同時廣泛存在于多個細胞器內(nèi)，不含跨膜結(jié)構(gòu)域，通過豆蔻酰化和多個位點的棕櫚?；c細胞膜內(nèi)側(cè)相連[4]。Flotillins蛋白是細胞膜的重要組成部分，存在于細胞膜的脂筏結(jié)構(gòu)上，參與跨膜物質(zhì)轉(zhuǎn)運、軸突再生、淋巴細胞分化和維持脂筏及細胞粘附等多種生理功能[5-6]。大量的研究發(fā)現(xiàn)Flotillins作為脂筏上的支架蛋白，參與多種信號通路的調(diào)節(jié)，且在多種腫瘤中高表達。曹傳林等[7]收集了2015年5月手術(shù)的16例新鮮胃癌及癌旁組織標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)Flot1在RNA和蛋白水平均表達上調(diào)；2007年1月—2008年6月手術(shù)的187例石蠟標(biāo)本，F(xiàn)lot1也表達上調(diào)，且與腫瘤浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期有關(guān)[7]。Ou YX等[8]總結(jié)了包括2 473各病例的13項研究結(jié)果，發(fā)現(xiàn)Flot1在各種實體腫瘤中表達與腫瘤的進展和患者的預(yù)后相關(guān)。Yang Q等[9]則發(fā)現(xiàn)細胞骨架蛋白4.1N可以通過抑制Flot1/β-catenin/Wnt信號通路抑制非小細胞肺癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

從該院病例中選取結(jié)腸癌病例34例，非腫瘤性結(jié)腸疾病病例14例手術(shù)標(biāo)本，該研究經(jīng)過湖南醫(yī)藥學(xué)院第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，患者或家屬知情同意。其中男性33例，女性15例，平均年齡55.7歲（44～78歲）。根據(jù)術(shù)后病理診斷及是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，分為非腫瘤組14例，結(jié)腸癌無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組21例（簡稱非轉(zhuǎn)移組），結(jié)腸癌發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組13例（簡稱轉(zhuǎn)移組）。所有標(biāo)本經(jīng)10%福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片，制成4 μm厚切片備染。

1.2 免疫組化染色

應(yīng)用免疫組化SP法進行檢測，所采用的試劑Flotillin-1多克隆抗體購自proteintech公司、枸櫞酸鹽抗原修復(fù)液（pH6.0）、DAB顯色液及PBS緩沖液均購自邁新公司。每個組織切片，經(jīng)脫蠟、枸櫞酸鹽抗原修復(fù)液熱修復(fù)，過氧化氫、牛奶封閉后滴加一抗（1∶200）4℃過夜。 復(fù)溫后滴加二抗，37℃孵育 30 min，滴加HRP標(biāo)記的鏈霉素卵白素工作液，37℃孵育3 min，最后DAB顯色，蘇木精復(fù)染，中性樹脂封片。

1.3 結(jié)果判定

每張切片隨機選取10個40×10倍視野，每個視野計數(shù)100個腺上皮細胞，取平均值。Flotillin-1主要位于細胞膜和細胞質(zhì)，呈棕黃色。陽性細胞比例=0%，1%～5%，6%～15%，＞15%，分別為“-，+，++，+++”。 結(jié)果統(tǒng)計時，以“-”和“+”為低表達，“++”和“+++”為高表達。

1.4 統(tǒng)計方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)處理。計數(shù)資料[n（%）] 采用 χ2檢驗和 Fisher確切概率法。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Flotillin-1在結(jié)腸癌病例中高表達

在34例結(jié)腸癌組織中，F(xiàn)lotillin-1的陽性高表達率為58.8%（20/34）。在14例非腫瘤性結(jié)腸疾病標(biāo)本中，F(xiàn)lotillin-1 的陽性高表達率為 14.3%（2/14）。Flotillin-1主要表達在結(jié)腸腺癌細胞的細胞膜和細胞質(zhì)中，呈淺黃色或棕黃色（圖1）。統(tǒng)計分析Flotillin-1在結(jié)腸癌和非結(jié)腸癌標(biāo)本中的表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）（表 1）。

2.2 Flotillin-1與結(jié)腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)

圖1 結(jié)腸癌與非結(jié)腸癌標(biāo)本中Flot1表達

表1 結(jié)腸癌與非結(jié)腸癌中Flot1表達

在34例結(jié)腸癌組織中，分為非轉(zhuǎn)移組21例和轉(zhuǎn)移組13例。其中非轉(zhuǎn)移組中，F(xiàn)lotillin-1在癌組織中陽性高表達率為38.1%（8/21）（圖2），淋巴結(jié)中陽性高表達率為0.0%（0/21）；轉(zhuǎn)移組中，F(xiàn)lotillin-1在癌組織中陽性高表達率為92.3%（12/13），淋巴結(jié)（轉(zhuǎn)移癌巢）中陽性高表達率為76.9%（10/13）（圖3）。采用Fisher確切概率法檢驗分析Flotillin-1在發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌和未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌標(biāo)本中的表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）（表2,3）。

圖2 轉(zhuǎn)移組與未轉(zhuǎn)移組癌組織中Flot1表達

表2 轉(zhuǎn)移組與非轉(zhuǎn)移組癌組織中Flot1表達

圖3 轉(zhuǎn)移組與未轉(zhuǎn)移組淋巴結(jié)中Flot1表達

表3 轉(zhuǎn)移組與非轉(zhuǎn)移組淋巴結(jié)中Flot1表達

3 討論

結(jié)腸癌由于早期癥狀不明顯，起病隱匿，多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)是已經(jīng)是中晚期，部分甚至已經(jīng)出現(xiàn)遠處轉(zhuǎn)移，喪失了手術(shù)治療的最佳時期，導(dǎo)致患者的預(yù)后較差。因此，需要對結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移的具體機制進行深入的研究并探究其具體機制，尋找有效的靶向藥物作用位點。

該文結(jié)腸癌組織中Flotillin-1高表達的陽性率為 58.8%，顯著高于非結(jié)腸癌病例的 14.3%（χ2=7.923，P<0.05），表明Flot1在結(jié)腸癌組織中與正常結(jié)腸上皮中表達有顯著差異，提示了Flotillin-1在結(jié)腸癌患者中高表達，可能與結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展存在相關(guān)性。同時，該文還比較了發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌病例和未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌病例的癌組織和淋巴結(jié)中Flotillin-1的表達，發(fā)現(xiàn)在發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌病例中，F(xiàn)lotillin-1在癌組織中的高表達率為92.3%，淋巴結(jié)（轉(zhuǎn)移癌巢）中高表達率為76.9%，在非轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌組織中高表達率為38.1%，淋巴結(jié)中無表達，經(jīng)Fisher確切概率法統(tǒng)計兩組數(shù)據(jù)均有明顯差異。提示Flotillin-1與結(jié)腸癌的淋巴道轉(zhuǎn)移有相關(guān)性。而在其他惡性腫瘤中，也發(fā)現(xiàn)Flotillin-1存在高表達并與轉(zhuǎn)移相關(guān)。Li J等[10]發(fā)現(xiàn)Flotillin-1在多種上皮性腫瘤中表達升高，其中惡性腫瘤81.48%表達上調(diào)，交界性腫瘤也有50%。Guo AY等的研究則提示Flotillin-1在肺腺癌高表達并在肺腺癌的發(fā)生、發(fā)展中有重要作用，干擾Flot1的表達可以明顯抑制肺腺癌細胞向惡性表型發(fā)展[11]。Li Y等[12]則發(fā)現(xiàn)Flotillin-1在乳腺癌細胞系MCF-7中與AdipoR1相互作用共同介導(dǎo)癌細胞的遷移。上述學(xué)者的研究及該文的研究均提示Flot1在各型腫瘤，尤其是惡性腫瘤中表達升高，并與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和轉(zhuǎn)歸密切相關(guān)。

綜上所述，F(xiàn)lotillin-1在結(jié)腸癌中高表達并與結(jié)腸癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，可以將其作為反映結(jié)腸癌病情嚴(yán)重程度的指標(biāo)，未來也有潛力作為靶向治療結(jié)腸癌的靶標(biāo)之一。