普洱熟茶化學成分研究進展

孟憲鈺，付亞軒，李明超，徐天瑞，郝倩

(昆明理工大學 生命科學與技術學院，云南省高校靶點藥物篩選與利用重點實驗室，云南 昆明，650500)

植物中存在可以預防或治療各種疾病的活性成分，截至目前，F(xiàn)DA已經(jīng)批準上市了兩個植物藥。其中一個是2006年得到批準上市的處方藥物Veregen (sinecatechins; polyphenon E 10%)，其主成分為一種以兒茶素混合物為主的綠茶提取物，用于局部(外部)治療由人乳頭瘤病毒(human papilloma virus, HPV) 引起的生殖器疣，由于其高清除率和低復發(fā)率得到了廣泛應用。這是近50年來，F(xiàn)DA根據(jù)1962年藥品修正條例首個批準上市的植物藥。

茶作為最受歡迎的飲品之一，其生物活性和保健功效已被廣泛研究[1]。茶根據(jù)其制作工藝的不同，可分為綠茶(不發(fā)酵)，烏龍茶(半發(fā)酵)，紅茶(氧化酶完全發(fā)酵)和黑茶(微生物后發(fā)酵)。與綠茶，烏龍茶和紅茶不同，黑茶是一種獨特的微生物發(fā)酵茶，其僅在中國和日本生產(chǎn)[2]。普洱熟茶作為云南特有名茶，具有降血脂，減肥，抗氧化，抗癌，清除自由基以及抗病毒等藥理活性，是最具代表性的黑茶。微生物發(fā)酵對普洱熟茶的形成起著至關重要的作用，這是茶葉中化學成分發(fā)生復雜轉化的結果。而目前對普洱熟茶和其他黑茶化學成分的研究成果甚少。隨著普洱熟茶受關注度日益提升，其保健功效成為近年來茶科學領域的熱門話題。普洱熟茶因其特有的發(fā)酵方式產(chǎn)生了一系列特征成分即A環(huán)加成兒茶素類成分。本文對近年來國內(nèi)外普洱熟茶中化學成分特別是A環(huán)加成兒茶素類及其轉化過程的研究進行了綜述，為普洱熟茶的進一步研究提供基礎和依據(jù)。

1 普洱熟茶的后發(fā)酵過程

普洱茶為山茶科山茶屬植物，是以云南特產(chǎn)的大葉種茶的曬青毛茶為原料經(jīng)微生物發(fā)酵加工而成的，分為普洱生茶(即曬青毛茶)和普洱熟茶兩大類。普洱熟茶渥堆發(fā)酵是微生物代謝與高溫高濕條件下的天然氧化和細胞外酶活性相結合的過程。茶葉中的粗纖維、蛋白質(zhì)、茶多酚和果膠等在微生物分泌的胞外酶和濕熱條件的協(xié)調(diào)作用下，發(fā)生了氧化、聚合、降解、分解等一系列反應，形成了普洱茶陳醇微澀的獨特口感[3]。

傳統(tǒng)的普洱熟茶通常是根據(jù)經(jīng)驗發(fā)酵制造的，這極大地影響了茶葉的品質(zhì)保證和現(xiàn)代發(fā)酵技術的應用。馮玲然等[4]發(fā)現(xiàn)，普洱熟茶香氣的形成主要與蛋白酶產(chǎn)生菌有關，而湯色主要受多酚氧化酶產(chǎn)生菌的影響；蛋白酶產(chǎn)生菌、多酚氧化酶產(chǎn)生菌、果膠酶產(chǎn)生菌和纖維素酶產(chǎn)生菌在不同程度上促進了普洱茶滋味的形成。ZHANG等[5]發(fā)現(xiàn)，嗜熱真菌在普洱茶渥堆發(fā)酵中起重要作用，其中Rasamsoniaemersonii、Rhizomucorpusillus、Aspergillusfumigatus和Aspergillusniger為渥堆發(fā)酵過程中的優(yōu)勢嗜熱菌種。

2 普洱熟茶化學成分

普洱熟茶因其特殊的發(fā)酵工藝，使其具有獨特的風味，化學成分也產(chǎn)生了巨大的變化，主要類型總結如下：

2.1 普洱熟茶中特征性成分

2.1.1 簡單兒茶素類

大量研究表明，普洱熟茶中簡單兒茶素類單體含量遠低于在綠茶、烏龍茶和紅茶中的含量[6-7]。綠茶和紅茶中主要含有沒食子兒茶素(gallocatechin, GC, 1)、表沒食子兒茶素-3-O-沒食子酸酯(epigallocatechin gallate, EGCG, 2)和表兒茶素-3-O-沒食子酸酯(epicatechin gallate, ECg, 3)[8](圖1)。

圖1 普通兒茶素類化學成分Fig.1 Chemical components of common catechins.

而普洱熟茶中主要為沒食子兒茶素(GC, 1)和表兒茶素(epicatechin, EC, 4)[6-8]，并推測普洱熟茶中GC的含量相對增加，EC、EGCG和ECG的含量相對降低，可能是生茶在后發(fā)酵過程中從EGCG到表沒食子兒茶素(epigallocatechin, EGC, 5)再到GC的生物轉化而形成的[9]。多項研究證實了茶葉中以簡單兒茶素為主的黃烷-3-醇類化合物具有較強的抗氧化活性[10-11]，并發(fā)現(xiàn)其清除1,1-二苯基-2-苦基肼(1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl, DPPH)自由基活性主要來自于其苯環(huán)上的鄰位酚羥基，酚羥基越多活性越強，此外，兒茶素形成的酯由于能提供更多活潑氫，所以活性更強[12]。ZHAO等[13]在分子水平上解釋了簡單兒茶素類化合物的減肥、抗糖尿病及抗癌作用，即通過在人體各組織中激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase, AMPK)信號通路從而產(chǎn)生相關活性。YI等[14]發(fā)現(xiàn)其可通過酮體生成/ SIRT3途徑改善高脂飲食誘導的早期腎損傷。

2.1.2 特征兒茶素類

東方等和ZHOU等[15-16]從普洱熟茶中分離鑒定了2種新的8位取代的黃烷-3-醇類兒茶素并命名為普洱茶素A (6)和B (7)，以及2種已知的金雞納型多酚，表兒茶素-[8,7-e]-4α-(4-羥基苯)-3,4-二氫-2(3H)-吡喃酮(epicatechin-[7,8-bc]-4R-(4-hydroxyphenyl)-dihydro-2(3H)-pyranone)(8)和金雞納素Ib (9)。屠鵬飛等[17]從普洱熟茶中分離得到了8種8-N- 乙基-2-吡咯烷酮取代的黃烷-3-醇，普洱茶素I-Ⅷ (10-17)，并驗證了普洱茶素I-IV對于由過氧化氫誘導的人類微血管內(nèi)皮細胞(human micro-vascular endothelial cell, HMEC)損傷具有潛在的保護作用。TIAN等[18]從普洱熟茶正丁醇可溶部分分離鑒定了4種新的黃烷-3-醇衍生物，分別為8-羧甲基-(+)-兒茶素(18)，8-羧甲基-(+)-兒茶素甲酯(19)，6-羧甲基-(+)-兒茶素(20)和6-羧基-(-)-沒食子兒茶素(21) (圖2)。

圖2 特征兒茶素類化學成分Fig.2 Chemical components of characteristic catechins

2.1.3 茶褐素類

茶褐素(theabrownins，TBs)是普洱熟茶中主要的生物活性物質(zhì)之一，是一類分子差異極大，結構復雜的高聚合物，由多酚類、茶黃素、茶紅素進一步氧化、聚合轉化而成[19]。可溶于水，但不溶于乙酸乙酯、正丁醇等有機溶劑。TB被認為是形成普洱熟茶獨特的色澤和口感的重要成分，也是評價普洱熟茶質(zhì)量的重要參數(shù)。XIE等[20]研究發(fā)現(xiàn)普洱熟茶茶葉干重中茶黃素(theaflavins, TFs)，茶紅素(thearubigins， TRs)和茶褐素(TBs)的含量分別在0.16%～0.29%，0%～0.99%和8.33%～13.65%。

在普洱熟茶研究初期，認為其所含TB與紅茶類似[6]，但CP-Py-GC / MS分析結果顯示，普洱熟茶與紅茶的化學成分差異較大[21]，隨后通過CP-MAS NMR和CP-GC/MS對普洱熟茶TB進行結構分析，發(fā)現(xiàn)其是一類性質(zhì)類似于紅茶TR的高聚物，其功能性基團為羥基、羧基、氨基以及甲基等基團，具有酚類物質(zhì)特性，推斷茶褐素酸水解去除其中蛋白質(zhì)和多糖后的黑色沉淀物部分結構如圖3所示[22]，目前普洱熟茶中TB的化學結構及其聚合方式仍不明確。大量藥理活性研究表明TB具有抗氧化，減肥[23]，降血糖[24]及抗癌[25]活性，除此之外，岳隨娟等[25]發(fā)現(xiàn)其具有調(diào)整腸道菌群的作用。龔加順等[26]通過小鼠游泳實驗證明TB能顯著提高抗疲勞能力(圖3)。

圖3 不溶性黑色沉淀物的化學組成Fig.3 Complex candidate compounds from the insoluble black precipitate identified from thetheabrownins pyrolysis products

2.2 其他類型成分

普洱熟茶中除主要含有兒茶素類與茶褐素類成分外，還含有黃酮及其苷類、簡單酚酸類、生物堿、他汀類和酰胺類化合物等。

2.2.1 黃酮及其苷類

從普洱熟茶中分離得到的黃酮及黃酮苷類成分主要為槲皮素(22)、山奈酚(23)、楊梅素(24)[27]、木犀草素(25)、3,4,5-三羥基-7-甲氧基黃酮(26)、3,4,7-三羥基-5-甲氧基黃酮(27)、槲皮素-3-O-葡萄糖苷(28)、山奈酚-3-O-蕓香糖苷(29)、 3,4-二羥基-5-甲氧基黃酮-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(30)[15,28-29]等。普洱熟茶中的黃酮主要以糖苷形式存在，其黃酮苷含量遠低于普洱生茶，自由基清除活性也明顯降低[30](圖4)。

2.2.2 簡單酚酸類

普洱熟茶中含有大量的酚酸類成分，如沒食子酸(31)，2,5-二羥基苯甲酸(32)[27]，2-羥基苯甲酸(33)，4-羥基苯甲酸(34)，3,4-二羥基苯甲酸(35)，1,3-苯二酚(36)，4-甲基-1,2-苯二酚(37)，1,2,4-苯三醇(38)[15]和甲氧基酚類(39-43)等[7,31-33]。其中沒食子酸是普洱熟茶中最重要的酚酸類之一，具有顯著的生物活性，是誘導凋亡細胞死亡的促氧化劑。甲氧基酚類化合物作為普洱熟茶中的一個重要成分，也是普洱熟茶特殊香氣形成的關鍵化合物之一[34]，研究發(fā)現(xiàn)該類成分由沒食子酸經(jīng)微生物酶[35-36]和/或熱降解[7,33]而產(chǎn)生。值得注意的是，這些化合物可以在微生物影響下進一步發(fā)生化學轉化，形成新的化合物(圖4)。

2.2.3 生物堿

與其他茶相似，普洱熟茶中的主要生物堿是咖啡因(44)，可可堿(45)和茶堿(46)。2007年折改梅等[37]從普洱熟茶中分離出了8-氧化咖啡因(47)和嘧啶生物堿，如脫氧胸苷(48)，胸腺嘧啶(49)和尿嘧啶(50)，二者均被認為是普洱熟茶的新特征成分。2014年，TIAN等[18]在普洱熟茶中發(fā)現(xiàn)了咖啡因的前體7-甲基黃嘌呤(51)，其在不同生產(chǎn)工藝的茶中普遍存在[38](圖4)。

2.2.4 奎寧酸衍生物

TIAN等[18]在普洱熟茶中發(fā)現(xiàn)了3-O-聚?；鼘幩?52)和3-O-咖啡酰奎寧酸(53) 兩種奎寧酸衍生物。這類化合物主要有抗氧化、抗病毒、抗炎、抗血小板聚集及保肝等活性(圖4)。

2.2.5 他汀類

HWANG等[39]首次在普洱熟茶中發(fā)現(xiàn)洛伐他汀(54)，該成分是普洱熟茶中唯一的他汀，可以防治動脈粥樣硬化和冠心病(圖4)。

2.2.6 氨基酸

普洱熟茶中氨基酸含量低于白茶和綠茶，其氨基酸類成分主要以茶氨酸(55)、絲氨酸(56)和脯氨酸(57)為主，其中茶氨酸含量最高[40]。自然陳化的普洱茶比微生物發(fā)酵的茶氨酸含量高[41](圖4)。

2.2.7 酰胺類化合物及其他

普洱熟茶中還含有2,2′,6,6′-四羥基聯(lián)苯(58)[16]，異檸檬烯醇(59)[12]，葉綠素，類胡蘿卜素[32]以及新型酰胺化合物N-(3,4-二羥基苯甲?；?-3,4-二氫苯甲酰胺(60)[28]等(圖4)。

圖4 其他化學成分Fig.4 Other chemical components.

3 普洱熟茶化學成分在后發(fā)酵過程中的轉化

普洱茶在其后發(fā)酵過程中，微生物產(chǎn)生的細胞外酶如鞣酸酶在化學催化反應中發(fā)揮重要作用，促進關鍵化學成分的轉化。其中，普洱熟茶中兒茶素含量比曬青茶低，使其茶湯的苦、澀程度大幅降低。這是由于在后發(fā)酵過程中兒茶素經(jīng)一系列氧化、縮合、降解的化學過程，形成了TF、TR、TB等一系列化合物。沒食子酸(31)、咖啡因(39)的含量升高，二者含量的變化不僅與微生物的生長和繁殖有關，也受茶葉化學組成影響[42]，如沒食子酸(31)含量的增加一方面可能來源于其在高溫高濕條件下由兒茶素沒食子酸酯轉化而成[9,43]，另一方面可能由于微生物的參與單寧類成分被水解而得來。此外，普洱熟茶中楊梅素(24)，槲皮素(22)和山奈酚(23)含量較曬青茶大幅降低。總黃酮苷的含量也明顯降低[44]，而類黃酮含量大大增加[45]。研究發(fā)現(xiàn)，利用桿菌狀鏈霉菌(Streptomycesbacillaris)或變灰鏈霉菌(Streptomycescinereus)短時間發(fā)酵茶葉能夠增加他汀類(47)的含量[46]，這是在曬青茶中很難檢測到的物質(zhì)。上述主要化學成分的變化促成了從曬青茶濃重的苦味到普洱熟茶陳香醇厚口感的轉變(圖4)。

從普洱熟茶茶葉香氣成分來看，其醇類，醛類和酯類物質(zhì)含量顯著增加，推測其可能是由某些微生物分解糖和蛋白質(zhì)產(chǎn)生[47]。這種轉變促使普洱熟茶產(chǎn)生香氣品質(zhì)的變化，形成特有的陳香。圖5為發(fā)酵后化學成分可能的轉化途徑。

圖5 化學成分在后發(fā)酵過程中的轉化Fig.5 Transformation of chemical constituents during the post-fermentation process

4 總結與展望

普洱熟茶具有降血脂，減肥，抗衰老，抗腫瘤以及抗病毒等功效，由于其成分復雜，結構多變，活性成分尚不明確，通過了解其化學成分，理解其促健康作用才是最為合理、科學的。到目前為止，僅發(fā)現(xiàn)普洱熟茶水提物具有抑制人乳腺癌細胞系MDA-MB-231增殖的作用[48]，普洱熟茶中含有與EGCG相同減肥作用的成分[28,45]，以及一些多酚、沒食子酸組分表現(xiàn)出比EGCG更好的抗氧化活性[49]。然而，這些組分均為混合物，其功能性成分尚不明確。因此，對普洱熟茶化學成分的進一步研究至關重要，只有明確其關鍵的活性成分，才能為普洱熟茶更好的開發(fā)和利用提供理論依據(jù)。