枯草芽孢桿菌SX3411產(chǎn)羊毛硫細(xì)菌素subtilomycin的 初步鑒定與理化特性分析

李曉然，葉德曉，付鳴佳*，鐘雪晴，肖世平，楊志海

1(江西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，江西 南昌，330022) 2(江西天佳生物工程股份有限公司，江西 南昌，330200)

枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)是自然界中存在較為豐富的一個(gè)類群，并適應(yīng)了自然界的各種環(huán)境變化[1]?？莶菅挎邨U菌已經(jīng)形成了許多的適應(yīng)環(huán)境的機(jī)制，如外源DNA的攝取、生物膜形成和芽孢形成[2-4]。因此，枯草芽孢桿菌可從許多場(chǎng)所和嚴(yán)酷的環(huán)境中分離得到[5-6]。有證據(jù)表明，枯草芽孢桿菌可活躍地生長(zhǎng)在土壤、植物根系和各種有機(jī)體的胃腸道中。特別是對(duì)幾種無(wú)脊椎動(dòng)物和脊椎動(dòng)物(包括人類)腸道中枯草芽孢桿菌研究表明，它可以作為動(dòng)物自然生命周期的一部分在胃腸道定居[5，7-11]。

枯草芽孢桿菌中可以產(chǎn)生多種抗菌物質(zhì)，具有較好的開(kāi)發(fā)利用價(jià)值[12-14]。在枯草芽孢桿菌中產(chǎn)生的翻譯后修飾的抗菌物質(zhì)包括脂肽(lipopeptide)、糖肽(glycopeptide)和羊毛硫細(xì)菌素(lantibiotic)等[15-17]。其中枯草芽孢桿菌中可以合成多種羊毛硫細(xì)菌素(lantibiotics)，羊毛硫細(xì)菌素也可稱為含羊毛硫氨酸的抗生素(lanthionine-containing antibiotics)[18]。羊毛硫細(xì)菌素是在核糖體上合成，并在翻譯后修飾的抗菌肽[19-21]。從枯草芽孢桿菌中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種羊毛硫細(xì)菌素，但這些羊毛硫細(xì)菌素均來(lái)源于不同的菌株。其中枯草菌素(subtilin)就來(lái)源于菌株BacillussubtilisATCC 6633，可形成4個(gè)甲基羊毛硫氨酸[22]。羊毛硫細(xì)菌素Ericin S和Ericin A產(chǎn)生菌均為B.subtilisA1/3菌株，但Ericin S的結(jié)構(gòu)與枯草素的結(jié)構(gòu)非常相似[23]。Entianin來(lái)自B.subtilissubsp. spizizenii DSM 15029T[24]。目前的研究中，已經(jīng)采用更多的先進(jìn)手段來(lái)進(jìn)行羊毛硫細(xì)菌素的發(fā)掘[25]。

羊毛硫細(xì)菌素subtilomycin最初報(bào)道來(lái)源于B.subtilisstrain MMA7，該菌株分離自海綿Haliclonasimulans中[26]，后在B.subtilisBSn5菌株中也發(fā)現(xiàn)有subtilomycin[27]。對(duì)B.subtilisstrain MMA7中subtilomycin基因簇進(jìn)行分析表明，其基因簇主要的subtilomycin合成基因包括subA(subtilomycin結(jié)構(gòu)基因)、subB(羊毛硫氨酸脫水酶(lanthionine dehydratase)基因)、subC(羊毛硫氨酸合成酶(lanthionine synthetase)基因)和subP(絲氨酸蛋白酶(serine protease)基因)；subT為ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[26]。而通過(guò)對(duì)B.subtilisBSn5菌株中subtilomycin基因簇測(cè)序分析表明，其基因簇與B.subtilisstrain MMA7中subtilomycin基因簇基本相同，但確定了一個(gè)穿膜蛋白(transmembrane protein)ApnI對(duì)subtilomycin功能是必須的[27]。我們?cè)谇捌诘难芯恐幸卜蛛x到1株產(chǎn)subtilomycin的枯草芽孢桿菌菌株，并進(jìn)行了相關(guān)的理化特性和分離純化研究。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

從江西省南昌市分離獲得枯草芽孢桿菌SX3411菌株(B.subtilisSX3411)，保藏于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心，菌種保藏號(hào)CGMCC NO.14396。其他指示菌株包括革蘭氏陽(yáng)性菌：豬鏈球菌(Streptococcussuis)、枯草芽孢桿菌(非本篩選菌株)和金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)；革蘭氏陰性菌：嗜水性單胞桿菌(Aeromonashydrophila)、沙門氏桿菌(Salmonellaentericasubsp.)和大腸桿菌(Escherichiacoli.)，均保存于本實(shí)驗(yàn)室。

革蘭氏染色液試劑盒、芽孢染色液試劑盒，北京索萊寶科技有限公司；2×Taq PCR Master Mix，天根生化(北京)科技有限公司；E.Z.N.A. TM Bacterial DNA Kit，OMEGA BIO-TEK；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒，博士德生物工程有限公司；胰蛋白酶、胃蛋白酶，上海藍(lán)季生物有限公司；蛋白酶K,MERCK公司；其他生化試劑為生工生物工程股份有限公司產(chǎn)品，化學(xué)試劑為天津市永大化學(xué)試劑開(kāi)發(fā)中心產(chǎn)品，均為分析純。

1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10.0，酵母提取物5.0， NaCl 5.0，pH 7.2, 加水定容1 L, 121 ℃滅菌20 min，固體培養(yǎng)基每1 L加15.0 g瓊脂粉。

模擬胃消化液(stimulated gastric fluid, SGF)：取稀HCl(HCl 234 mL，加水稀釋至1 000 mL制得)16.4 ml， 加水約800 mL與胃蛋白酶10 g，搖勻后，加水稀釋成1 000 mL[28]。

模擬腸消化液(stimulated intestinal fluid, SIF)：取KH2PO46.8 g，加水500 mL使溶解，用0.1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至6.8；另取胰酶10 g，加水適量使溶解，將兩液混合后，加水稀釋至1 000 mL[28]。

1.3 儀器與設(shè)備

D-37520 Osterode型臺(tái)式高速離心機(jī)，美國(guó)Thermo公司；PTC-200型PCR儀，美國(guó)MJ-Research公司；ZHWY-103B型、ZHWY-2102型恒溫培養(yǎng)振蕩器，上海智城分析儀器制造有限公司；HT-1300-U超凈工作臺(tái)，蘇凈集團(tuán)安泰公司；FE20型pH計(jì)，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；ALO-210.2型電子天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司。

1.4 方法

1.4.1 SX3411菌株的分離

從豬場(chǎng)污泥中得到的菌種樣品，經(jīng)過(guò)高溫處理后，接種到LB固體培養(yǎng)基中，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜。觀察菌落形態(tài)，挑取芽孢桿菌形態(tài)的單克隆菌落，進(jìn)行后續(xù)鑒定。

1.4.2 濾紙片法測(cè)定抑菌活性

每個(gè)培養(yǎng)皿傾入20～30 mL LB固體培養(yǎng)基，凝固后，超凈臺(tái)上吹干冷凝水；涂布100 μL指示菌懸液， 37 ℃培養(yǎng)10 min。2層濾紙片(直徑8 mm)輕輕黏在制備好的抑菌平板上，輕輕按壓一下。取25 μL SX3411菌株的發(fā)酵液緩慢滴到濾紙片上，按照順時(shí)針?lè)较蜻M(jìn)行實(shí)驗(yàn)。加完樣品后，放在4 ℃冰箱4 h以上使發(fā)酵液在瓊脂糖平板上充分?jǐn)U散，然后放置在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h左右，定時(shí)查看抑菌圈出現(xiàn)的情況，做好記錄和測(cè)量抑菌圈直徑。新鮮LB液體培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照。

1.4.3 菌體形態(tài)鑒定

將活化好的枯草芽孢桿菌SX3411劃線接種至固體平板培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行革蘭氏染色、芽孢染色、莢膜染色。使用光學(xué)顯微鏡觀察菌體細(xì)胞個(gè)體形態(tài)。

1.4.4 生理生化鑒定

SX3411菌株的生理生化鑒定參照《伯杰氏菌種鑒定手冊(cè)》進(jìn)行試驗(yàn)[29]。

1.4.5 16S rDNA序列鑒定

E.Z.N.A. TM Bacterial DNA Kit試劑盒抽提SX3411菌株基因組DNA(方法見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書(shū))。用南京金斯瑞生物科技有限公司合成的上下游通用引物27F和1 492R(27F: AGAGTTTGATCCTGGCTCAG; 1492R: GGTTACCTTGTTACGACTT)對(duì)枯草芽孢桿菌基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.4.6 枯草芽孢桿菌菌株SX3411中subtilomycin基因簇的分子生物學(xué)鑒定

根據(jù)NCBI上給出的枯草芽孢桿菌B.subtilisstrain MMA7中subtilomycin基因簇(GenBank序列號(hào)：JX912247.1)中的結(jié)構(gòu)基因SubA、脫水酶基因SubB與環(huán)化酶基因SubC和絲氨酸蛋白酶基因SubP的DNA序列[26]，使用Primer 5.0和Oligo 6.0軟件分別設(shè)計(jì)SubA、SubB、SubC、SubP基因的引物(表1)；引物送至南京金斯瑞生物科技有限責(zé)任公司合成。根據(jù)不同的鑒定DNA序列長(zhǎng)短，進(jìn)行相應(yīng)的PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增后得到的DNA送南京金斯瑞生物科技公司測(cè)序。

1.4.7 菌株SX3411發(fā)酵產(chǎn)物的抗菌譜

分別取菌株SX3411在37 ℃培養(yǎng)了24 h的發(fā)酵液，10 000 r/min離心15 min，棄菌體取上清液，即得到抗菌物質(zhì)粗提液。分別用指示菌懸液涂布平板，按濾紙片法測(cè)定抑菌活性，測(cè)定SX3411的發(fā)酵液對(duì)不同指示菌的抑菌活性。

表1 檢測(cè)subtilomycin基因簇的PCR引物Table 1 Primers used for PCR detection of subtilomycin cluster

1.4.8 菌株SX3411生長(zhǎng)曲線與抑菌活性的關(guān)系

接種新鮮的SX3411菌株，37 ℃搖床200 r/min振蕩培養(yǎng)，每隔2 h取1次發(fā)酵液在紫外分光光度計(jì)上測(cè)OD600值，記錄結(jié)果。同時(shí)將所取的發(fā)酵液10 000 r/min 離心15 min，取上清液用于抑菌活性檢測(cè)。以金黃色葡萄球菌為指示菌，濾紙片法檢測(cè)各時(shí)間取樣的抑菌效果。

1.4.9 菌株SX3411發(fā)酵所產(chǎn)抑菌物質(zhì)熱穩(wěn)定性

取37 ℃發(fā)酵培養(yǎng)24 h的SX3411菌株發(fā)酵液，分別在40、60、80和100 ℃下水浴處理30 min和1 h，以未處理的發(fā)酵液為陽(yáng)性對(duì)照，滅菌新鮮的LB液體培養(yǎng)基為陰性對(duì)照，以金黃色葡萄球菌為指示菌株，檢測(cè)不同溫度對(duì)SX3411菌株發(fā)酵液抑菌活性的影響。

1.4.10 菌株SX3411發(fā)酵所產(chǎn)抑菌物質(zhì)酸堿穩(wěn)定性

取37 ℃發(fā)酵培養(yǎng)24 h的SX3411菌株發(fā)酵液，分別用0.1 mol/L HCl溶液和0.1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至2、4、5、7、8、9、10和11，以不做處理的菌株發(fā)酵液作陽(yáng)性對(duì)照，新鮮LB液體培養(yǎng)基為陰性對(duì)照，室溫下處理1 h。以金黃色葡萄球菌為指示菌株，檢測(cè)不同pH處理下發(fā)酵液的抑菌活性。

1.4.11 超濾法粗提subtilomycin及其抑菌活性

將枯草芽孢桿菌SX3411在37 ℃發(fā)酵培養(yǎng)24 h，其發(fā)酵液10 000 r/min離心15 min，棄菌體取上清液。取500 μL菌株SX3411發(fā)酵液于3 kDa超濾管中(美國(guó)Millipore公司產(chǎn)品)，10 000 r/min離心10 min，收集管中的濾過(guò)液進(jìn)行抑菌活性檢測(cè)。超濾管內(nèi)截留液繼續(xù)加入50 mmo1/L PBS(pH 7.4)緩沖液，10 000 r/min 離心10 min，重復(fù)該步驟3次。隨后將超濾得到截留液進(jìn)行抑菌活性檢測(cè)。同時(shí)采用15% SDS-PAGE電泳(凝膠配制見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書(shū)，電泳方法略)檢測(cè)超濾得到的截留液。

1.4.12 硫酸銨沉淀初步純化菌株SX3411發(fā)酵液中subtilomycin

將枯草芽孢桿菌SX3411在37 ℃發(fā)酵培養(yǎng)24 h的發(fā)酵液10 000 r/min離心20 min取上清液。其中加(NH4)2SO4分別至20%、30%、40%、50%、60%和70%飽和度，置4 ℃下過(guò)夜。高速冷凍離心機(jī)在10 000 r/min， 4 ℃下離心20 min。每40 mL發(fā)酵液所得沉淀用2 mL濃度為50 mmo1/L PBS(pH 7.4)緩沖液懸浮。以金黃色葡萄球菌為指示菌，檢測(cè)不同飽和度(NH4)2SO4沉淀所得初步純化subtilomycin的抑菌活性。

1.4.13 初步純化subtilomycin的溫度穩(wěn)定性

用30%硫酸銨飽和度初步純化的subtilomycin，分別在40、60、80和100 ℃下各處理30 min和1 h，以未處理的初步純化subtilomycin作陽(yáng)性對(duì)照，滅菌的PBS為陰性對(duì)照，以金黃色葡萄球菌為指示菌株，檢測(cè)不同溫度處理對(duì)subtilomycin抑菌活性的影響。

1.4.14 初步純化subtilomycin對(duì)蛋白酶K、模擬胃液和模擬腸液的穩(wěn)定性

初步純化的subtilomycin分別用0.5 g/L蛋白酶K、模擬胃液、模擬腸液消化處理，分別處理15和30 min。 用模擬胃液和模擬腸液為陰性對(duì)照，以金黃色葡萄球菌為指示菌株，檢測(cè)不同蛋白酶處理下初步純化subtilomycin的抑菌活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 抑菌菌株的篩選

從取得的樣品中獲得芽孢桿菌菌落形態(tài)特征的菌株，用濾紙片擴(kuò)散法檢測(cè)獲得的發(fā)酵液，從中篩選得到具有明顯抑菌圈的菌株。經(jīng)篩選比較，挑選1株抑菌效果較好的菌株(圖1)，命名為SX3411菌株。

2.2 菌株SX3411的形態(tài)

用活化好的SX3411菌種使用接種環(huán)劃線接種于LB固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)1～2 d后觀察菌落形態(tài)呈現(xiàn)芽孢桿菌特征形態(tài)。菌體進(jìn)行革蘭氏染色、芽孢染色和莢膜染色，1 000×油鏡下觀察，菌株SX3411菌體革蘭氏染色為陽(yáng)性反應(yīng)，菌體呈桿狀(圖2-A)。芽孢染色(圖2-B)和莢膜染色(圖2-C)均呈陽(yáng)性。

圖1 篩選菌株SX3411的抑菌效果Fig.1 Bacteriostatic efficacy of screened strain SX3411注：指示菌為金黃色葡萄球菌。

A-革蘭氏染色；B-芽孢染色；C-莢膜染色圖2 菌株SX3411菌體形態(tài)Fig.2 Morphology of strain SX3411

2.3 菌株鑒定

2.3.1 生理生化鑒定

菌株SX3411在5 ℃下基本不生長(zhǎng)，20 ℃下生長(zhǎng)較緩慢，30～50 ℃下菌株生長(zhǎng)良好，50 ℃下生長(zhǎng)8 h即可看到菌落產(chǎn)生，表明為耐高溫生長(zhǎng)菌株。不同酸堿度檢測(cè)表明，該菌株在pH 6～9時(shí)菌株生長(zhǎng)較好；最適生長(zhǎng)pH值在6～9。在NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%～5%的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)較好；丙二酸利用實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示陰性；檸檬酸鹽利用實(shí)驗(yàn)呈陽(yáng)性；接觸酶實(shí)驗(yàn)表現(xiàn)陽(yáng)性；蔗糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)可產(chǎn)酸，呈陽(yáng)性；葡萄糖氧化發(fā)酵實(shí)驗(yàn)表明菌株SX3411發(fā)酵產(chǎn)酸但不產(chǎn)氣；淀粉水解實(shí)驗(yàn)呈陽(yáng)性；MR反應(yīng)呈陰性；V-P反應(yīng)陽(yáng)性；SX3411菌株穿刺接種，可導(dǎo)致明膠液化；菌株SX3411不能利用乙醇，乙醇氧化呈陰性；菌株可以利用乙酸產(chǎn)生碳酸，在平板中生成CaCO3，乙酸氧化呈陽(yáng)性。根據(jù)《伯杰氏菌株鑒定手冊(cè)》可以初步確定菌株SX3411為枯草芽孢桿菌[29]。

2.3.2 菌株SX3411的16S rDNA序列鑒定

提取菌株SX3411基因組DNA，以細(xì)菌特異的16S rDNA引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可得到大小為1 500 bp左右DNA(圖3-A)，測(cè)序后得到GenBank序列號(hào)為KY848340.1。通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中已知菌株的16S rDNA序列進(jìn)行比對(duì)分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)(圖3-B)，菌株SX3411與枯草芽孢桿菌(B.subtilis)具有較高的同源性，達(dá)到99%，可以確定菌株SX3411為枯草芽孢桿菌。

A-PCR擴(kuò)增；B-系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)圖3 菌株SX3411 16S rDNA的PCR擴(kuò)增和系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)Fig.3 PCR analysis and phylogenetic tree of strain SX3411 16S rDNA

2.4 菌株SX3411中subtilomycin基因簇的分子生物學(xué)鑒定

根據(jù)subtilomycin基因簇(GenBank序列號(hào)JX912247.1)的相關(guān)基因序列設(shè)計(jì)引物，分別以枯草芽孢桿菌SX3411中的基因組DNA為模版進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果獲得了subA(圖4-A)、subB(圖4-B)、subC(圖4-C)、subP(圖4-C)、subP-subB(圖4-D)、subP-subB-subC(圖4-E)和subB-subC(圖4-E)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。擴(kuò)增產(chǎn)物分別送DNA測(cè)序公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行比對(duì)，其序列與subtilomycin基因簇序列完全相同[26]。由此表明，在枯草芽孢桿菌SX3411中存在可以合成subtilomycin的基因簇。

A-subA基因的PCR擴(kuò)增；B-subB基因的PCR擴(kuò)增；C-subC和subP基因的PCR擴(kuò)增；D-subP-subB基因的PCR擴(kuò)增；E-subP-subB-subC和subB-subC基因的PCR擴(kuò)增圖4 Subtilomycin基因簇相關(guān)基因的PCR擴(kuò)增Fig.4 PCR amplification of subtilomycin cluster related genes

2.5 菌株SX3411發(fā)酵產(chǎn)物的抗菌譜

SX3411菌株的發(fā)酵液對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌具有強(qiáng)抑菌活性，其中對(duì)金黃色葡萄球菌和豬鏈球菌的抑菌效果最明顯，對(duì)枯草芽孢桿菌(非篩選菌株)也具有抑菌作用，但對(duì)于SX3411菌株本身不具有抑菌效果，這可能跟SX3411菌株本身會(huì)產(chǎn)生免疫蛋白有關(guān)。在檢測(cè)的革蘭氏陰性細(xì)菌中，只對(duì)嗜水氣單胞桿菌有抑菌活性，對(duì)大腸桿菌和沙門氏菌無(wú)抑菌活性(表2)。

表2 枯草芽孢桿菌SX3411發(fā)酵液對(duì)供試菌種的抑制作用Table 2 Antimicrobial spectrum of bacteriostatic substances produced by B. subtilis SX3411

注：“+++”，抑菌圈完全透明；“++”，抑菌圈清晰；“+”，抑菌圈可見(jiàn)；“-”，無(wú)抑菌圈。

2.6 菌株SX3411發(fā)酵產(chǎn)物的生長(zhǎng)曲線與抑菌物質(zhì)的分泌關(guān)系

將培養(yǎng)好枯草芽孢桿菌SX3411的種子液(OD600約為1)，按2%的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，每隔2 h測(cè)定菌液OD600值，以未接種的發(fā)酵培養(yǎng)基為空白對(duì)照，檢測(cè)SX3411菌株的生長(zhǎng)情況(圖5-A)。結(jié)果表明，0～2 h為生長(zhǎng)停滯期，菌體數(shù)量較少，2～20 h為對(duì)數(shù)期，菌體生長(zhǎng)迅速，呈指數(shù)增長(zhǎng)，20～34 h為穩(wěn)定期，菌體數(shù)量比較穩(wěn)定，34 h后為衰退期，菌體因?yàn)闋I(yíng)養(yǎng)條件和代謝物的影響，活性開(kāi)始衰減(圖5-A)。根據(jù)菌株的生長(zhǎng)曲線可以掌握枯草芽孢桿菌SX3411的生長(zhǎng)代謝規(guī)律，從而調(diào)控其生長(zhǎng)條件，為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。

枯草芽孢桿菌SX3411的發(fā)酵液具有抑菌作用，發(fā)酵產(chǎn)物分為初級(jí)代謝產(chǎn)物和次級(jí)代謝產(chǎn)物，發(fā)酵時(shí)間對(duì)枯草芽孢桿菌SX3411抑菌物質(zhì)的分泌具有關(guān)聯(lián)(圖5-B)。抑菌物質(zhì)隨著菌株的生長(zhǎng)而分泌，并隨著發(fā)酵時(shí)間而慢慢積累，到8 h達(dá)到一定的抑菌效果，在20～38 h抑菌活性比較穩(wěn)定，40 h后其抗菌活性出現(xiàn)了下降(圖5-B)?？梢酝茰y(cè)枯草芽孢桿菌SX3411所產(chǎn)的抑菌物質(zhì)，尤其是subtilomycin盡管是翻譯后的修飾，但也是枯草芽孢桿菌SX3411的初級(jí)代謝產(chǎn)物，抑菌物質(zhì)的產(chǎn)生與其生長(zhǎng)相關(guān)。

A-生長(zhǎng)曲線；B-抑菌活性圖5 枯草芽孢桿菌SX3411生長(zhǎng)曲線及其抑菌物質(zhì)抑菌活性隨時(shí)間的變化Fig.5 Growth curve of B. subtilis SX3411 and changes of antimicrobial activity of its antimicrobial substances with time

2.7 菌株SX3411抑菌物質(zhì)的熱穩(wěn)定性

菌株SX3411發(fā)酵液的抑菌活性隨著溫度的升高而降低，且在100 ℃時(shí)，發(fā)酵液失去抑菌活性；發(fā)酵液在40～60 ℃處理下對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑在12～15 mm，與未處理的原始發(fā)酵液相差不大，此期間的發(fā)酵液抑菌活性相對(duì)穩(wěn)定；發(fā)酵液在80 ℃處理下，仍然具有抑菌活性(圖6)。由此可知，SX3411菌株發(fā)酵液中抑菌物質(zhì)具有較好的熱穩(wěn)定性。這與確認(rèn)的發(fā)酵液中主要的抑菌物質(zhì)為羊毛硫細(xì)菌素subtilomycin有關(guān)，因subtilomycin是熱穩(wěn)定的環(huán)肽類物質(zhì)。

圖6 枯草芽孢桿菌SX3411發(fā)酵產(chǎn)物中抑菌物質(zhì)的熱穩(wěn)定性Fig.6 Thermal stability of bacteriostatic substances in fermentation products of B. subtilis SX3411

2.8 菌株SX3411發(fā)酵產(chǎn)物的酸堿穩(wěn)定性

菌株SX3411發(fā)酵液抑菌活性成分在pH 5～9比較穩(wěn)定，發(fā)酵液在pH 5～9處理后對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑均在12.0～13.0 mm，與未處理的發(fā)酵液相差不大；且此菌株發(fā)酵液在pH值為2和11處理下，對(duì)金黃色葡萄球菌仍有抑制作用，而pH值為12時(shí)，活性降低或失去抑菌活性(圖7)。由此可見(jiàn)，SX3411菌株發(fā)酵液的抑菌活性在中性及弱堿性條件下較穩(wěn)定，對(duì)酸的耐受性高于對(duì)強(qiáng)堿的耐受性。

圖7 枯草芽孢桿菌SX3411發(fā)酵產(chǎn)物中抑菌物質(zhì)的酸堿穩(wěn)定性Fig.7 pH stability of bacteriostatic substances in fermentation products of B. subtilis SX3411

2.9 超濾法粗提subtilomycin及其抑菌活性

與發(fā)酵液相比較(圖8-Aa)，使用3 kDa超濾管進(jìn)行超濾后，截留液保存了較好的抑菌活性，可以看到明顯的抑菌圈(圖8-Ab)，而濾過(guò)液基本沒(méi)有抑菌活性，無(wú)抑菌圈產(chǎn)生(圖8-Ac)。由此表明，枯草芽孢桿菌SX3411發(fā)酵液的抑菌活性主要體現(xiàn)在多肽類物質(zhì)上，小分子物質(zhì)基本沒(méi)有抑菌活性。截留液經(jīng)過(guò)SDS-PAGE電泳以后，可以看到在4 kDa左右有條帶(圖8-B2)，初步認(rèn)為是subtilomycin。發(fā)酵液原液(圖8-B1)和濾過(guò)液(圖8-B3)經(jīng)過(guò)SDS-PAGE電泳未見(jiàn)明顯條帶。綜合分析，在枯草芽孢桿菌SX3411的發(fā)酵液中，抗菌物質(zhì)主要是subtilomycin。因此，在后續(xù)研究中可以以抑菌能力的大小來(lái)判斷枯草芽孢桿菌SX3411的發(fā)酵液中產(chǎn)subtilomycin的量。

A-抑菌活性；B-SDS-PAGE分析圖8 枯草芽孢桿菌SX3411發(fā)酵液超濾后的抑菌活性和SDS-PAGE分析Fig.8 Antimicrobial activity and SDS-PAGE analysis of B. subtilis SX3411 fermentation liquor after ultrafiltration注：Aa為發(fā)酵液原液的抑菌活性，Ab為截留液的抑菌活性，Ac為濾過(guò)液的抑菌活性。

2.10 硫酸銨沉淀初步純化菌株SX3411發(fā)酵液中的subtilomycin

枯草芽孢桿菌SX3411經(jīng)過(guò)(NH4)2SO4沉淀后，其中20%、30%和40%(NH4)2SO4沉淀物有較好的抑菌效果，以30%的沉淀物抑菌效果最好，而50%、60%和70%的硫酸銨沉淀物抑菌效果不好(圖9-A和9-B)。這樣的結(jié)果與所報(bào)道的20%(NH4)2SO4沉淀得到subtilomycin接近一致[16]。

對(duì)這6個(gè)濃度的(NH4)2SO4沉淀物進(jìn)行SDS-PAGE分析(圖10)，結(jié)果表明，在20%、30%和40%的硫酸銨沉淀中，可以見(jiàn)到4 kDa左右的電泳帶，其中以30%的量最多且雜質(zhì)較少(圖10-A)。而在50%、60%和70%的(NH4)2SO4沉淀中可以見(jiàn)到較多的雜電泳帶。將20%、30%和40%(NH4)2SO4沉淀進(jìn)一步超濾以后再進(jìn)行電泳，結(jié)果30%和20%的沉淀物電泳以后仍可見(jiàn)到較好的4 kDa電泳帶，且含雜質(zhì)也較少。由于subtilomycin是由硫醚鍵形成帶有4個(gè)環(huán)的環(huán)肽，且含堿性氨基酸比例較高，為陽(yáng)離子肽[16]，因此電泳條帶并不像普通蛋白質(zhì)電泳帶那樣規(guī)整。

A-抑菌圈直徑；B-抑菌效果圖9 枯草芽孢桿菌SX3411發(fā)酵液(NH4)2SO4沉淀物的抑菌效果Fig.9 Antibacterial effect of ammonium sulfate precipitates from B. subtilis SX3411 fermentation broth注：指示菌為金黃色葡萄球菌。

A-硫酸銨沉淀；B-超濾后SDS-PAGE圖圖10 枯草芽孢桿菌SX3411發(fā)酵液硫酸銨沉淀及其超濾后的SDS-PAGE分析Fig.10 SDS-PAGE analysis of ammonium sulfate precipitation and retaining solution of ultrafiltration after ammonium sulfate precipitation for B. subtilis SX3411 fermentation broth

2.11 初步純化subtilomycin的溫度穩(wěn)定性

將30%(NH4)2SO4沉淀和超濾初步純化的subtilomycin 分別在不同溫度下處理不同時(shí)間，以未處理的30%(NH4)2SO4沉淀和超濾初步純化的subtilomycin作陽(yáng)性對(duì)照，滅菌的PBS溶液作陰性對(duì)照，檢測(cè)抑菌效果的變化(圖11)。結(jié)果表明，與未處理初步純化的subtilomycin相比，初步純化的subtilomycin在40～ 80 ℃處理后抑菌活性改變不大；100 ℃處理30 min， 活性下降較少，處理1 h后，抑菌活性才有一定下降，說(shuō)明枯草芽孢桿菌SX3411分泌的subtilomycin具有較好的溫度耐受性(圖11)。

圖11 枯草芽孢桿菌SX3411粗提subtilomycin的溫度穩(wěn)定性Fig.11 Temperature stability of subtilomycin extracted from B. subtilis SX3411

2.12 初步純化的subtilomycin對(duì)蛋白酶K、模擬胃液和腸液穩(wěn)定性

以未處理的30%(NH4)2SO4沉淀和超濾初步純化的subtilomycin為陽(yáng)性對(duì)照，蛋白酶K、模擬胃液和模擬腸液為陰性對(duì)照，將30%硫酸銨沉淀和超濾初步純化的subtilomycin樣品用蛋白酶K、模擬胃液和模擬腸液分別處理15及30 min，對(duì)其檢測(cè)抑菌活性的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，蛋白酶K、模擬腸液處理后的初步純化的subtilomycin失去抑菌活性；模擬胃液處理15和30 min后的初步純化的subtilomycin仍然具有抑菌活性，與未處理的初步純化的subtilomycin相比變化不大(圖12)。

圖12 枯草芽孢桿菌SX3411的 subtilomycin對(duì)蛋白酶K、模擬胃液和模擬腸液的穩(wěn)定性Fig.12 Stability of subtilomycin from B. subtilis SX3411 to protease K, simulated gastric fluid and simulated intestinal fluid注：0-未處理的subtilomycin，1-模擬胃液，2-模擬胃液處理subtilomycin 15 min，3-模擬胃液處理subtilomycin 30 min，4-模擬腸液，5-模擬腸液處理subtilomycin 15 min，6-模擬腸液處理subtilomycin 30 min，7-蛋白酶K，8-蛋白酶K處理subtilomycin 15 min，9-蛋白酶K處理subtilomycin 30 min。

3 結(jié)論

從江西省南昌市分離獲得了1株細(xì)菌SX3411，經(jīng)過(guò)形態(tài)鑒定、生理生化鑒定和分子生物學(xué)鑒定，確定該菌株為枯草芽孢桿菌。根據(jù)NCBI中羊毛硫細(xì)菌素subtilomycin的基因簇序列(GenBank序列號(hào)：JX912247.1)中的結(jié)構(gòu)基因SubA、脫水酶基因SubB與環(huán)化酶基因SubC和絲氨酸蛋白酶基因SubP的DNA序列，設(shè)計(jì)引物對(duì)枯草芽孢桿菌SX3411中合成subtilomycin的結(jié)構(gòu)基因和修飾酶基因進(jìn)行了PCR的擴(kuò)增和測(cè)序分析，結(jié)果證明了枯草芽孢桿菌中存在subtilomycin的基因簇，表明該菌株可以合成羊毛硫細(xì)菌素subtilomycin。

對(duì)枯草芽孢桿菌SX3411發(fā)酵液中的抑菌物質(zhì)進(jìn)行了生理生化和生物活性方面的研究?？莶菅挎邨U菌SX3411發(fā)酵液對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌金黃色葡萄球菌、豬鏈球菌和枯草芽孢桿菌具有明顯抑菌作用，而對(duì)革蘭氏陰性菌的抑菌作用相對(duì)較弱，檢測(cè)菌種中對(duì)嗜水氣單胞桿菌有一定抑菌效果，對(duì)其他菌無(wú)效果。研究表明，枯草芽孢桿菌SX3411發(fā)酵液產(chǎn)抑菌物質(zhì)與其菌體生長(zhǎng)有密切關(guān)系，且該類抑菌活性物質(zhì)具有很好的耐高溫和耐酸堿的能力，其中在80 ℃處理仍保持有較好的抑菌活性，在pH 2～11有抑菌活性，在pH 5～9抑菌活性比較穩(wěn)定。

采用超濾和硫酸銨沉淀的方法對(duì)枯草芽孢桿菌SX3411中的subtilomycin進(jìn)行了初步純化。在用3 kDa超濾管超濾時(shí)，經(jīng)過(guò)SDS-PAGE電泳可以見(jiàn)到數(shù)量較多的4 kDa左右的subtilomycin存在。采用硫酸銨分步沉淀的方法，20%、30%和40%飽和度的硫酸銨沉淀可以將subtilomycin沉淀下來(lái)，其中以30%硫酸銨沉淀效果較好，獲得的subtilomycin也比較純。30%硫酸銨沉淀和超濾初步純化的subtilomycin有非常好的抵抗高溫的作用，對(duì)模擬胃液有較好的抵抗作用，但對(duì)蛋白酶K和模擬腸液的抵抗能力較弱。這些結(jié)果表明，羊毛硫細(xì)菌素subtilomycin比較適合工業(yè)化生產(chǎn)，且可以用于調(diào)節(jié)胃部的有害菌群?？莶菅挎邨U菌SX3411也可以做為益生菌進(jìn)行開(kāi)發(fā)利用。