植物乳桿菌MXG-68所產(chǎn)細菌素的抑菌特性分析

滿麗莉，向殿軍

1(內(nèi)蒙古民族大學 生命科學學院，內(nèi)蒙古 通遼，028042)2(內(nèi)蒙古民族大學 農(nóng)學院，內(nèi)蒙古 通遼，028042)

食品安全是人類健康的重要保證，食品腐敗變質(zhì)不僅會造成巨大的經(jīng)濟損失，而且會導致嚴重的疾病[1]。鼠傷寒沙門氏菌、單核細胞增生李斯特菌、志賀氏菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌等是引起食品腐敗變質(zhì)和食物中毒的主要原因[2]。新型生物防腐劑-乳酸菌細菌素的應用有利于抑制微生物污染、延長食品貨架期、改善食品質(zhì)量和提升食品安全[3]。但目前商品化的乳酸菌細菌素的數(shù)量極其有限，抑菌譜窄和抑菌特性不穩(wěn)定是影響乳酸菌細菌素應用的主要原因之一，篩選出廣譜且抑菌特性穩(wěn)定的乳酸菌細菌素是亟待解決的問題。

植物乳桿菌作為一種乳酸菌細菌素生產(chǎn)菌株具有許多優(yōu)勢，其來源廣泛，可從牛乳、肉及肉制品、奶酪、面團、發(fā)酵黃瓜、橄欖菜、酸菜、果汁等食物中分離篩選，安全性高[4]。相關報道顯示，某些植物乳桿菌所產(chǎn)的細菌能有效地抑制革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌(包括致病菌和腐敗菌)，同時具有較好的穩(wěn)定性，例如：plantaricin KL-1Y、plantaricin LpU4和plantaricin MG[5-7]。鑒于植物乳桿菌細菌素的廣譜抑菌活性和各種環(huán)境下的穩(wěn)定性，其在食品防腐及食品安全方面具有潛在的應用前景。

本研究以內(nèi)蒙古自治區(qū)的酸馬奶中篩選到的植物乳桿菌所產(chǎn)的細菌素為研究對象，對其抑菌譜、作用方式、分子質(zhì)量及對溫度、pH、有機溶劑、表面活性劑的耐受性進行分析。明確該細菌素的抑菌特性，有利于其作為一種新型的生物防腐劑更好地應用于食品中，為更好地實現(xiàn)細菌素的開發(fā)及應用提供一定的理論依據(jù)和方法參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 供試樣品及模式菌株

植物乳桿菌MXG-68分離于內(nèi)蒙古地區(qū)的酸馬奶中，由實驗室自行保存。指示菌株分別購自中國藥品生物制品檢定所、中國普通微生物菌種保藏管理中心、美國模式培養(yǎng)物研究所及波斯模式培養(yǎng)物研究所。

1.1.2 試劑、培養(yǎng)基及主要儀器設備

培養(yǎng)基，購自英國Oxoid公司；過氧化氫酶，購自美國Sigma公司；Marker，購自寶生物工程(上海)有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

MJ-54A/MJ-78A型STIK滅菌鍋，北京天賜科儀商貿(mào)有限公司；Microfuge16型離心機，美國貝克曼公司；110-801型三量ip67防水原點數(shù)顯卡尺不銹鋼零點電子游標尺，東莞市景有模具五金有限公司；DYY-10C型電泳儀、DYCZ-28A型電泳槽，北京市六一儀器廠；1708195型凝膠成像系統(tǒng)，伯樂(Bio-Rad)公司。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)及發(fā)酵方法

植物乳桿菌MXG-68的培養(yǎng)方法：挑取菌株接種于裝有100 mL MRS培養(yǎng)基(pH 5.8)的250 mL錐形瓶中，37 ℃培養(yǎng)至約109CFU/mL。

植物乳桿菌MXG-68的發(fā)酵方法：將菌液按1%接種于裝有100 mL MRS培養(yǎng)基(pH 5.8)的250 mL錐形瓶中，30 ℃發(fā)酵24 h。

指示菌的培養(yǎng)方法：挑取指示菌接種于裝有100 mL 培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，37 ℃培養(yǎng)至約107CFU/mL。植物乳桿菌、清酒乳桿菌及嗜酸乳桿菌用MRS培養(yǎng)基；乳酸乳球菌用M17培養(yǎng)基；產(chǎn)氣莢膜梭菌及生孢梭菌用RCM培養(yǎng)基；單核細胞增生李斯特氏菌用TSA-YE培養(yǎng)基；糞腸球菌、銅綠假單胞菌及腸炎沙門氏菌用LB培養(yǎng)基；其他指示菌均用NB培養(yǎng)基。

1.2.2 發(fā)酵上清液的制備及抑菌活性的測定

部分純化細菌素的分子質(zhì)量通過SDS-PAGE測定[8]。電泳結(jié)束后，一塊膠用考馬斯亮藍R250染色，染色約20 min后用脫色液振蕩過夜脫色。另一塊膠用無菌水清洗后，覆蓋于含鼠傷寒沙門氏菌ATCC 14028(107CFU/mL)的NB半固體培養(yǎng)基上，于37 ℃培養(yǎng)12 h觀察特異性條帶處是否出現(xiàn)抑菌圈。

1.2.3 植物乳桿菌MXG-68的抑菌譜測定

按照1.2.1、1.2.2中的方法制備發(fā)酵上清液，測定其對29株指示菌的抑菌活性，確定植物乳桿菌MXG-68所產(chǎn)細菌素的抑菌譜。

1.2.4 細菌素的作用方式測定

指示菌蠟樣芽孢桿菌ATCC 11788和鼠傷寒沙門氏菌ATCC 14028分別培養(yǎng)4 h，2株菌的菌液分別分成100 mL的兩等份，一份作為對照，一份加入部分純化的細菌素(質(zhì)量濃度0.5 g/L)，于37 ℃培養(yǎng)14 h， 每隔1 h取樣測定指示菌的活菌數(shù)(CFU/mL)和菌體密度(OD600)，分析細菌素對指示菌的作用方式是殺菌、溶菌，還是抑菌。

1.2.5 細菌素的分子質(zhì)量測定

部分純化細菌素的分子質(zhì)量通過SDS-PAGE測定[8]。出現(xiàn)特異條帶部分的膠體用無菌水清洗后，覆蓋于含鼠傷寒沙門氏菌ATCC 14028(107CFU/mL)的NB半固體培養(yǎng)基上，于37 ℃培養(yǎng)12 h觀察是否出現(xiàn)抑菌圈。

1.2.6 細菌素對溫度、pH、有機溶劑和表面活性劑的耐受性測定

按照1.2.1、1.2.2中的方法制備發(fā)酵上清液，用于細菌素耐受性的研究。5 mL的發(fā)酵上清液分別于60、80、100、121 ℃處理30 min，4、-20 ℃處理30 d，溫度恢復到室溫后測定抑菌活性，以鼠傷寒沙門氏菌ATCC 14028作為指示菌，對照為室溫下未經(jīng)處理的發(fā)酵上清液，確定細菌素的溫度耐受性。

用1 mol/L的HCl或NaOH將發(fā)酵上清液的pH分別調(diào)至1.0～10.0，于37 ℃處理2 h后，將pH重新調(diào)至7.0測定抑菌活性，以鼠傷寒沙門氏菌ATCC 14028作為指示菌，對照為37 ℃處理2 h未調(diào)整pH的發(fā)酵上清液，確定細菌素的pH耐受性。

發(fā)酵上清液分別添加1%(體積分數(shù))的乙醇、甲醇、異丙醇、丙酮、乙酸乙酯、乙腈，1 g/L的Tween-80、Tween-20、Triton X-100及0.1、1.0、5.0 g/L的EDTA，于37 ℃處理2 h后測定抑菌活性，以鼠傷寒沙門氏菌ATCC 14028作為指示菌，對照為37 ℃處理2 h的未添加有機溶劑和表面活性劑的發(fā)酵上清液，確定細菌素對有機溶劑和表面活性劑的耐受性。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析

所有的試驗均重復3次，采用Excel進行標準偏差計算，結(jié)果用平均值±標準偏差來表示。應用SPSS 17.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物乳桿菌MXG-68抑菌譜

大部分植物乳桿菌所產(chǎn)的細菌素只能抑制革蘭氏陽性菌，如plantaricin W、乳桿菌LL441所產(chǎn)的plantaricin C、plantaricin D及plantaricin T，某些植物乳桿菌可產(chǎn)廣譜細菌素[9-10]。植物乳桿菌MXG-68所產(chǎn)的細菌素不但對金黃色葡萄球菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、生孢梭菌、單核細胞增生李斯特氏菌、枯草芽孢桿菌、蠟樣芽胞桿菌、痢疾志賀氏菌、藤黃微球菌等革蘭氏陽性菌具有抑菌作用，而且對大腸桿菌、熒光假單胞菌、惡臭假單胞菌、銅綠假單胞菌、鼠傷寒沙門氏桿菌、腸炎沙門氏菌等革蘭氏陰性菌亦具有抑制作用(表1和圖1)，是一種可抑制常見食品腐敗菌和致病菌的廣譜細菌素。此結(jié)果與MAN、AGALIYA、YU的研究相一致[11-13]。

表1 植物乳桿菌所產(chǎn)細菌素對指示菌的抑菌活性Table 1 The activity of bacteriocins produced by L. plantarum MXG-68 based on indicator strains

注：aNB:營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基; RCM:強化梭菌培養(yǎng)基; TSA-YE:含0.6%酵母膏的胰酪胨大豆瓊脂; MRS:De man-Rogosa-Sharpe medium的縮寫; LB:9Luria-Bertani medium的縮寫；bG+:革蘭氏陽性菌; G-:革蘭氏陰性菌；cATCC:美國模式培養(yǎng)物研究所; PTCC:波斯模式培養(yǎng)物研究所Type Culture Collection; NICPBP:中國藥品生物制品檢定所; CGMCC:中國普通微生物菌種保藏管理中心。“-”表示未檢出。

a-為鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028;b-葡萄球菌ATCC12600; c-枯草芽孢桿菌ATCC6051圖1 植物乳桿菌MXG-68所產(chǎn)細菌素對指示菌的抑菌圈Fig.1 Inhibition zone of bacteriocin produced by Lactobacillus plantarum MXG-68 on indicator strains

2.2 細菌素的作用方式

圖2表明植物乳桿菌MXG-68所產(chǎn)細菌素對蠟樣芽孢桿菌ATCC 11788(革蘭氏陽性菌)和鼠傷寒沙門氏菌ATCC 14028(革蘭氏陰性菌)的作用方式。與對照組相比，加入細菌素后(5～14 h)蠟樣芽孢桿菌和鼠傷寒沙門氏菌的活菌數(shù)顯著降低(P<0.01)。加入細菌素后(5～14 h)蠟樣芽孢桿菌ATCC 11788和鼠傷寒沙門氏菌菌液的OD600變化不明顯(P>0.05)，而對照組菌液的OD600持續(xù)上升。細菌素導致蠟樣芽孢桿菌和鼠傷寒沙門氏菌活菌數(shù)減少，說明細菌素的作用方式是殺菌，而OD600未降低，菌液中總菌數(shù)基本保持不變，說明作用方式不是溶菌。

a-為蠟樣芽孢桿菌ATCC 11788；b-鼠傷寒沙門氏菌ATCC 14028圖2 植物乳桿菌MXG-68所產(chǎn)細菌素對蠟樣芽孢桿菌ATCC 11788和鼠傷寒沙門氏菌ATCC 14028活菌數(shù)及菌體密度的影響Fig.2 Effects of bacteriocin produced by Lactobacillus plantarum MXG-68 on viable cell numbers and cell densities of Bacillus cereus ATCC 11788 and Salmonella Typhimurium ATCC 14028

2.3 細菌素的分子質(zhì)量

SDS-PAGE結(jié)果顯示在約6.5 ku獲得一條清晰的條帶，抑菌試驗表明該條帶對鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028具有抑菌活性(圖3)。植物乳桿菌MXG-68所產(chǎn)細菌素的分子質(zhì)量與GUPTA等的研究結(jié)果相一致[14]，而與KUMAR等(約6 ku)[15]、李景良(約4 ku)[16]和魯淵(約5 ku)[17]的研究結(jié)果不同，植物乳桿菌分子質(zhì)量的差異可能是由于菌株差異所造成的。

圖3 SDS-PAGE分析及抑菌活性檢測Fig.3 Tricine-SDS-PAGE analysis and determination of antibacterial activity注：1-部分純化細菌素的分子質(zhì)量；2-細菌素對鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028的抑菌圈，箭頭表示抑菌圈。

2.4 細菌素的溫度耐受性

食品在加工、運輸、銷售和貯藏過程中，無法避免地會遇到各種高溫和低溫環(huán)境，較好的溫度耐受性是細菌素被廣泛應用于食品中的前提條件之一。由圖4可知，60、80、100、121 ℃處理30 min導致細菌素的抑菌活性有所降低，但影響不顯著(P>0.05)，抑菌活性均保留97.69%以上，結(jié)果表明植物乳桿菌MXG-68所產(chǎn)細菌素具有較高的溫度耐受性，此研究結(jié)果與植物乳桿菌F1所產(chǎn)細菌素相類似[18]。同時，細菌素在冷藏溫度4 ℃和冷凍溫度-20 ℃條件下處理30 d，抑菌活性保留近100%。

圖4 溫度對抑菌活性的影響Fig.4 Effect of temperature on the antibacterial activity

2.5 細菌素的pH耐受性

由圖5可知，細菌素在pH 1～10均表現(xiàn)出抑菌活性，最高抑菌活性出現(xiàn)在pH=6。與對照組相比，當pH=1～2時抑菌活性極顯著性降低(P<0.01)，pH=3或10時抑菌活性顯著性降低(P<0.05)，pH=4～9時對抑菌活性影響不顯著(P>0.05)，但抑菌活性均保留94.55%以上，說明植物乳桿菌MXG-68所產(chǎn)細菌素具有較好的酸堿耐受性。此結(jié)果與以前的部分研究結(jié)果不同，細菌素僅在酸性環(huán)境下有抑菌活性，而在中性和堿性環(huán)境下抑菌活性喪失[19-20]。細菌素的pH耐受性強有助于其在食品加工和進入人體過程中，最大程度地保留其抑菌活性，有利于更好地延長保質(zhì)期及發(fā)揮益生特性。

圖5 不同pH對抑菌活性的影響Fig.5 Effect of different pH vaule on the antibacterial activity

2.6 有機溶劑對細菌素活性的影響

由圖6可知，與對照組相比，乙醇、甲醇、異丙醇、丙酮、乙酸乙酯、乙腈導致植物乳桿菌MXG-68所產(chǎn)細菌素的抑菌活性稍有降低，但影響不顯著(P>0.05)。經(jīng)不同的有機溶劑處理后，抑菌活性保留近100%，具有較好的化學穩(wěn)定性，結(jié)果表明細菌素可在純化的不同階段維持其固有的結(jié)構和功能，有利于細菌素的提取及廣泛應用。

圖6 有機溶劑對抑菌活性的影響Fig.6 Effect of organic solvents on the antibacterial activity

2.7 表面活性劑對細菌素活性的影響

由圖7可知，與對照組相比，Tween-80、Tween-20和Triton X-100對植物乳桿菌MXG-68所產(chǎn)細菌素的抑菌活性基本無影響(P>0.05)。EDTA有利于提高細菌素的抑菌活性，且1 g/L和5 g/L EDTA能顯著提高抑菌活性(P<0.01)，此結(jié)果與黎杰、滕志利的研究結(jié)果相一致[21-22]。對于革蘭氏陰性菌，EDTA增強抑菌活性主要原因在于其可發(fā)揮外膜滲透劑的作用，絡合脂多糖維持其結(jié)構所需的Ca2+，破壞其結(jié)構；而對于革蘭氏陽性菌的抑制作用主要是在于其可與金屬離子螯合[23]。

圖7 表面活性劑對抑菌活性的影響Fig.7 Effect of surfactants on the antibacterial activity

3 結(jié)論

酸馬奶來源的植物乳桿菌MXG-68所產(chǎn)的細菌素以殺菌的方式同時抑制常見的易導致食品腐敗變質(zhì)和食物中毒的微生物，包括革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌，是一種分子質(zhì)量約6 ku的廣譜細菌素，其在高溫、冷藏、冷凍、酸性、中性、堿性條件下均較穩(wěn)定，且有機溶劑及表面活性劑對細菌素的抑菌活性基本無影響，而EDTA有利于提高抑菌活性，說明該細菌素的穩(wěn)定性較高，在應對食品加工、貯藏、運輸、銷售過程中能最大程度地保留抑菌活性，延長食品的貨架期，為更好地實現(xiàn)細菌素的開發(fā)及應用提供一定的理論依據(jù)。隨著轉(zhuǎn)錄組學、基因組學及蛋白組學的不斷發(fā)展，可更加透徹地掌握乳酸菌細菌素合成相關基因、調(diào)控機制及代謝通路，有利于更加有效的應用乳酸菌細菌素。