春雷霉素高產(chǎn)菌株選育及其工業(yè)生產(chǎn)應用

田 露, 王 亮,, 閔建紅, 祁晨娟, 張志敏, 龔國利*

(1.陜西科技大學 食品與生物工程學院, 陜西 西安 710021； 2.陜西麥可羅生物科技有限公司， 陜西 渭南 714000； 3.陜西省微生物研究所, 陜西 西安 710043)

0 引言

春雷霉素(Kasugamycin)又名春日霉素、加收米、加瑞農(nóng)等，是由春日鏈霉菌(Streptomyceskasugaensis)所產(chǎn)生的一種氨基糖苷類抗生素.春雷霉素作為農(nóng)用殺菌劑，被廣泛應用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，不僅具有較好的防治植物疾病的效果[1,2]，并且對人畜無毒害作用，無污染和無殘留符合現(xiàn)代環(huán)保要求，是目前最具推廣前景的綠色農(nóng)藥之一，也是當前農(nóng)作物病蟲害防治中具有廣闊發(fā)展前景的農(nóng)藥之一.

春雷霉素的結(jié)構(gòu)由春雷胺(Kasugamine)、D-肌醇(D-inositol)和二碳側(cè)鏈(Two-carbon side chain)共三部分組成，如圖1所示.

(a)二碳側(cè)鏈 (b)春雷胺 (c)D-肌醇圖1 春雷霉素的化學結(jié)構(gòu)

傳統(tǒng)育種中，春雷霉素產(chǎn)生菌通常采用紫外線照射法進行誘變育種[3].Genome shuffling技術(shù)是利用基因洗牌技術(shù)在全基因組水平上的拓展，采用遞歸原生質(zhì)體融合的方法來模擬基因組洗牌技術(shù)中的PCR熱循環(huán).可以對不同突變表型的若干個菌株的全基因組進行隨機的重組，從而選育出具有良好生產(chǎn)性能、遺傳特征具有較大改進的雜交菌株的方法.例如,Zhang等[4]利用基因組洗牌育種的方法提高弗氏鏈霉菌的泰樂菌素的產(chǎn)量；龔國利等[5,6]通過基因組洗牌技術(shù)選育埃博霉素B高產(chǎn)菌株，使得纖維堆囊菌的埃博霉素B產(chǎn)量提高了35.1倍.

本文以從不同發(fā)酵罐批分離篩選到5株遺傳多樣性的春雷霉素生產(chǎn)菌株作為出發(fā)菌株，通過基因組洗牌技術(shù)選育出高產(chǎn)春雷霉素的重組菌株.

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

從不同發(fā)酵罐批分離篩選到5株春雷霉素產(chǎn)生菌S 17-128，S 17-261，S 18-050，S 18-051，S 18-081，其春雷霉素的產(chǎn)量分別為14 007，14 738，14 520，14 551和14 048 mg/L，這5個菌株作為Genome shuffling育種的出發(fā)菌株，工業(yè)生產(chǎn)菌KB2010 S 17-182由陜西麥可羅生物科技有限公司提供.菌株培養(yǎng)在小金色鏈霉菌固體平板上，菌體細胞懸浮在40%甘油溶液中低溫冰箱保存.

指示菌：灰梨孢菌DLB2015由陜西麥可羅生物科技有限公司提供.

1.1.2 培養(yǎng)基

(1)斜面培養(yǎng)基及分離培養(yǎng)基：葡萄糖(AR) 1.0%、蛋白胨(BR) 0.3%、黃豆餅粉(IR) 1.0%、NaCl(AR) 0.5%、CaCO3(AR) 0.3%、瓊脂2%，蒸餾水配制，消前pH7.2～7.4.

(2)搖瓶種子培養(yǎng)基：玉米油2%、豆餅粉5%、卵磷脂0.2%、磷酸氫二鉀0.5%、硫酸鎂0.05%、氯化鈉0.2%，pH自然.

(3)搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米油2%、卵磷脂0.5%、豆餅粉5%、磷酸氫二鉀0.2%、硫酸鎂0.1%、氯化鈉0.3%，pH自然.

(4)種子罐培養(yǎng)基：玉米油2%、豆餅粉5%、卵磷脂0.2%、磷酸氫二鉀0.3%、硫酸鎂0.05%、氯化鈉0.2%，pH自然.

(5)發(fā)酵罐培養(yǎng)基：豆油2%、豆餅粉6%、卵磷脂0.5%、硫酸銨0.01%、磷酸氫二鈉0.1%、磷酸二氫鉀0.3%、硫酸鎂0.01%、氯化鈉0.2%，pH自然.

1.1.3 溶液

(1)TPM液： 0.001 mol/L K2HPO4-KH2PO4，0.008 mol/L硫酸鎂，0.01 mol/LTris-HCl，pH7.6，滅菌備用.

(2)Tris緩沖液：0.067 mol/L，pH8.0，滅菌備用.

(3)EDTA溶液：稱取5 g EDTA于90 mL水中溶解，調(diào)節(jié)pH至8.0，然后定容至100 mL，滅菌備用.

(4)MMM緩沖液：0.02 mol/L馬來酸，0.3 mol/L甘露醇，0.02 mol/L氯化鎂，pH6.5，滅菌備用.

1.1.4 主要試劑

Lyticase(10 U/μL)溶菌酶，購自上海翊圣生物科技有限公司.

1.1.5 搖瓶，種子罐和發(fā)酵罐等的培養(yǎng)條件

(1)搖瓶培養(yǎng)條件：培養(yǎng)液30 mL/300 mL廣口三角瓶，培養(yǎng)溫度28 ℃；轉(zhuǎn)速220 rpm；培養(yǎng)周期30～36 h.

(2)種子罐培養(yǎng)條件：培養(yǎng)溫度28 ℃；通氣量1∶1 VVM；攪拌轉(zhuǎn)速300 rpm；培養(yǎng)周期24～28 h；接種量1%.

(3)發(fā)酵罐培養(yǎng)條件：培養(yǎng)溫度28 ℃；通氣量1∶0.7 VVM；攪拌轉(zhuǎn)速150 rpm；發(fā)酵周期192～210 h；接種量10%.

1.1.6 儀器

MQ D-0.4型壓力蒸汽滅菌器(邢臺醫(yī)療器械廠)，OLYMPUS CX31RTSF顯微鏡(日本Olympus公司)，YT-CZ-ZN超凈工作臺(北京亞泰科隆有限公司)，MBR-304DR血液保存箱(深圳市凱銘杰儀器設備有限公司)，HY-5回旋多用振蕩器(金壇市華峰儀器有限公司)，HW·SY21-KP4電子恒溫水浴鍋(北京市長風儀表儀器廠)，LC-10Avp液相色譜儀(島津儀器(蘇州)有限公司)，LRH-1500F生化培養(yǎng)箱(上海一恒科學儀器有限公司)，無菌96孔板(賽默飛世爾科技(中國)有限公司).

1.2 方法

1.2.1 出發(fā)菌株的分離與純化

無菌操作取不同發(fā)酵罐批發(fā)酵190 h的發(fā)酵液，在無菌室超凈工作臺內(nèi)將無污染的發(fā)酵液劃線在分離培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)9～11 d后取出平板，在無菌室超凈工作臺內(nèi)挑取草帽型灰色菌落，轉(zhuǎn)接后進行劃線分離，直至挑取到單個菌落，其孢子生長豐滿，呈灰白色至粉灰色，基內(nèi)菌絲及分泌的可溶性色素為淡黃色.然后挑取單菌落作為種子菌進行液體培養(yǎng)2～3 d，離心收集菌體.

1.2.2 原生質(zhì)體的制備和再生

收集出發(fā)菌株，調(diào)整其濃度為1×106cell/mL， MMM緩沖液懸浮，加入10 U/μL的溶壁酶液，28 ℃，30 min進行酶解，離心收集原生質(zhì)體，MMM緩沖液重懸離心后繼續(xù)用MMM緩沖液懸浮備用.取酶解完全的原生質(zhì)體懸液0.5 mL，適量MMM緩沖液稀釋后于斜面培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)直至觀察到單菌落[5].

1.2.3 原生質(zhì)體的融合方法

本研究采用滅活原生質(zhì)體融合，提高了基因組洗牌育種的效率.

紫外線滅活：在無菌室超凈工作臺內(nèi)，把懸浮的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)到Φ9 cm的無菌平皿內(nèi)，于30 W的紫外燈下，分別照射20 s、40 s、60 s、80 s和100 s進行紫外滅活，經(jīng)再生培養(yǎng)檢查滅活效果.

加熱滅活：把懸浮的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)到無菌試管中分別置于不同溫度水浴(40、50和60 ℃)，熱滅火處理1 min、3 min、5 min和7 min，然后利用再生培養(yǎng)檢查其滅活的效果.

取1 mL濃度為1×108cell/mL不同滅活的出發(fā)菌株懸液混合，離心收集，棄上清液后用MMM緩沖液懸浮.隨后加入2 mL 40%的PEG-MMM，28 ℃ 15 min.離心MMM洗滌，MMM重懸，利用雙層培養(yǎng)法再生，28 ℃培養(yǎng)9～11 d.融合率通過融合子和滅活親本的再生情況進行計算.

首先選取的PEG濃度為10%、20%、30%和40%，反應時間為10 min，得到最佳濃度后，設置5 min、10 min、15和20 min不同對反應時間進行實驗.

融合率a=[(b-c)/d]×100%，式中a為原生質(zhì)體融合率；b為融合再生的菌落數(shù)目；c為滅活親本再生的菌落數(shù)目；d為親本再生的菌落數(shù)目.

1.2.4 基因組shuffling

將滅活后的原生質(zhì)體在合適條件下進行隨機融合，通過雙層平板培養(yǎng)法再生后，平板上的再生菌落為F1代的融合菌群[7]；然后將其作為出發(fā)菌株，滅活后再融合，再生，反復重復5輪融合再生后得到F2代融合菌群，然后反復5輪融合再生.獲得的最終菌群對其篩選和檢測，從而獲得到高產(chǎn)春雷霉素菌株[8,9].其中對照組為加入的溶菌酶用無菌水代替，其他實驗步驟一致.

1.2.5 高產(chǎn)重組菌株的初篩

本實驗通過高通量篩選法進行篩選，首先在96孔板中的孔中加入200μL滅菌的固體發(fā)酵培養(yǎng)基，平行接種誘變菌株于兩塊96孔板(a板和b板).然后再a板的孔加入適量的灰梨孢菌，28 ℃培養(yǎng)9～11 d，然后用微板光譜儀進行檢測，選取透光度較大的菌株作為目標菌株.b板于20 ℃下培養(yǎng)4 d后，保藏于4 ℃冰箱待用.等a板培養(yǎng)結(jié)束后，從b板上取出相應的菌株進行檢測.

1.2.6 高效液相色譜的復篩

將初篩獲得的高產(chǎn)重組子通過液體搖瓶擴大培養(yǎng)40 h，然后按照1∶50的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基.發(fā)酵體系：300 mL三角瓶裝發(fā)酵培養(yǎng)基50 mL，28 ℃，220 r/min培養(yǎng)144 h.144 h發(fā)酵液用草酸調(diào)pH3.0，5 000 r/min離心10 min，收集上清液待用.然后上清液采用HPLC(島津高效液相色譜系統(tǒng))進行定性和定量測定.

色譜柱：150×3.9 mm(id)不銹鋼色譜柱，ODS，粒徑5μm；

流動相：4.0 g十二烷基硫酸鈉溶于純水中，加200 mL乙腈，定容至1 L，用磷酸調(diào)pH2.55，過濾超聲后備用.

流速：1.0 mL/min;

檢測波長：紫外檢測儀，波長為210 nm；

柱溫：25～35 ℃；

進樣量：5μL.

本實驗的春雷霉素標準品購買于sigma公司.

1.2.7 重組菌株的遺傳穩(wěn)定性測定

獲得的高產(chǎn)春雷霉素菌株進行傳代培養(yǎng)5次后，進一步利用發(fā)酵篩選，篩選得到春雷霉素產(chǎn)量高并且遺傳穩(wěn)定性好的重組菌株，然后保藏菌種.

1.2.8 春雷霉素的效價測定方法

(1)標準溶液配制

稱取標樣0.05 g(精確至0.000 2 g)置于50 mL容量瓶中，用流動相溶解，稀釋至刻度，搖勻.

(2)試樣溶液的配制

稱取約含春雷霉素0.05 g的試樣(精確至0.000 2 g)置于50 mL容量瓶中，用流動相溶解，稀釋至刻度，搖勻，并用0.45μm濾膜過濾，備用.

(3)測定

在上述條件下，待儀器穩(wěn)定后，連續(xù)注入數(shù)針標準溶液，計算各針響應值的重復性，待相鄰兩針的響應值變化小于1.5%時，按照標樣溶液、試樣溶液、試樣溶液、標樣溶液的順序進行測定.

(4)計算

將測得的兩針試樣溶液以及試樣前后兩針標樣溶液中春雷霉素的峰面積分別進行平均，試樣中春雷霉素的質(zhì)量分數(shù) (%)，按式(1)計算:

(1)

式(1)中：A1-標樣溶液中，春雷霉素峰面積平均值；A2-試樣溶液中，春雷霉素峰面積平均值；m1-春雷霉素標樣的質(zhì)量，g；m2-試樣的質(zhì)量，g；ω1-標樣中春雷霉素的質(zhì)量分數(shù)，%.

表1 制備條件對原生質(zhì)體制備率的影響情況

2 結(jié)果與討論

2.1 獲得出發(fā)菌株

將不同批次的發(fā)酵罐中篩選到的具有遺傳多樣性的菌株作為出發(fā)菌株，利用小金色鏈霉菌(S.microaureus)分離平板篩選到了到5株遺傳差異大的菌株，分別為S 17-128，S 17-261，S 18-050，S 18-051，S 18-081，這5株菌株作為Genome shuffling的出發(fā)菌株.產(chǎn)量最高的菌株S 17-261的春雷霉素產(chǎn)量為14 738 mg/L，見圖2所示.

圖2 出發(fā)菌株春雷霉素產(chǎn)量

2.2 原生質(zhì)體的制備與再生

基因組shuffling過程中的關(guān)鍵步驟在于原生質(zhì)體制備與再生，本實驗中首先確定了制備和再生的培養(yǎng)基的種類、方法和滲透壓穩(wěn)定劑.另外酶解的溫度、時間和酶解前預處理的因素見表1所示.結(jié)果表明，在制備原生質(zhì)體時，EDTA預處理細胞可以提高細胞壁酶解的效率.通過實驗結(jié)果，本文最終選擇的滲透壓穩(wěn)定劑為0.3 mol/L的甘露醇，EDTA預處理10 min，酶解時間30 min，原生質(zhì)體再生采用自然擴展法.

2.3 優(yōu)化原生質(zhì)體融合的條件

本研究通過加熱和紫外照射兩種滅活方法，來確定原生質(zhì)體的雙親菌株的滅活條件.從圖3可以看出，隨著溫度和紫外的滅活時間延長，原生質(zhì)體存活的數(shù)量呈現(xiàn)降低趨勢，當滅活率達到99%以上后，繼續(xù)滅活所需要時間成倍增長.因此，本研究確定了滅活率達到100%的滅活條件,即加熱滅活：50 ℃，10 min；紫外滅活：30 W，235.7 nm，30 cm，2 min.

原生質(zhì)體融合時融合率受PEG的聚合度、濃度、反應時間以及溫度影響見表2所示.實驗結(jié)果表明，當PEG6000濃度為40%時，融合率隨著反應時間增加而呈現(xiàn)遞增，但當達到一定的值后，融合率不再隨融合時間增加而提高；并且反應時間過長融合子的再生率也會受到影響.在融合過程中的反應溫度對融合率也會造成一定的影響，溫度過低和過高都會降低融合率，本實驗結(jié)果顯示26 ℃的反應溫度融合率最高.

(a)溫度滅活曲線

(b)紫外滅活曲線圖3 溫度和紫外滅活曲線

PEG聚合度濃度/(M/V%)反應時間/min溫度/℃融合率/%60002020268060003015262060004052610600040102650600040152680600050152640600040152060600040152050600040153040400040153040800040153060

2.4 基因組shuffling選育高產(chǎn)春雷霉素的菌株

為了獲得高產(chǎn)春雷霉素菌株，在原生質(zhì)體融合過程中，每次融合結(jié)束后選取100個再生單菌落測定其透光度，選取其中具有高透光度的10株菌株進一步發(fā)酵培養(yǎng)，然后定量檢測.在經(jīng)過基因組shuffling后，本研究觀察了1580株的誘變?nèi)诤暇涞纳L狀況見表3所示，并且獲得了透光度超過19%的10株融合菌，其余1 570株融合菌的平均透光度(光線波長420 nm)為13.2%，出發(fā)菌株的平均透光度(光線波長420 nm)為8.7%.獲得的10株高透光度的融合菌株通過搖瓶發(fā)酵后，利用HPLC對其進行定性和定量分析檢測.最后，本研究篩選得到了3株春雷霉素高產(chǎn)菌株，產(chǎn)量分別為17 320 mg/L、18 882 mg/L和19 823 mg/L見表4所示.而對照組春雷霉素的產(chǎn)量無明顯變化，從而證實了基因組shuffling育種能有效篩選出春雷霉素高產(chǎn)的菌株.

表3 親本和誘變菌株在96孔板上的生長情況

表4 高產(chǎn)春雷霉素菌株接種培養(yǎng)不同代數(shù)的產(chǎn)量情況

2.5 重組菌株的遺傳穩(wěn)定性測定

把獲得的3株高產(chǎn)春雷霉素的菌株進行連續(xù)傳代培養(yǎng)5次，然后通過發(fā)酵培養(yǎng)基進行發(fā)酵培養(yǎng)，觀察菌株的顏色、生長速度等特征，發(fā)現(xiàn)均沒有明顯變化.進一步通過HPLC進行檢測，發(fā)現(xiàn)菌株產(chǎn)生春雷霉素的產(chǎn)量沒有明顯變化，見表4所示.實驗結(jié)果說明篩選到的重組高產(chǎn)菌株的性狀穩(wěn)定.

2.6 生產(chǎn)罐上發(fā)酵結(jié)果

將篩選獲得的高產(chǎn)菌株 K2018S F5-06和工業(yè)生產(chǎn)菌K2010 S 17-182在30噸發(fā)酵罐上實驗各4批，放罐后的發(fā)酵結(jié)果顯示，新菌株平均效價為19 608 mg/L，工業(yè)生產(chǎn)菌株平均放罐效價為 14 305 mg/L.因此，新菌種效價提高37.1%(5 303 mg/L)，見表5所示.對8批罐上的發(fā)酵液效價做趨勢圖對比，見圖4(a)所示.

從罐上發(fā)酵動態(tài)趨勢圖對比，顯然新菌株K2018S F5-06不論起步效價還是整個罐批發(fā)酵效價增加幅度及增長趨勢均明顯高于生產(chǎn)菌株K2010 S 17-182.顯微鏡觀察菌株生長染色涂片可見，前期新菌株菌體均勻、粗壯、舒展不結(jié)團，著色能力強，表明菌體嗜堿性強，代謝旺盛.43 h菌絲體斷裂均勻同步，菌體轉(zhuǎn)入產(chǎn)春雷霉素旺盛期，至211 h才出現(xiàn)膨大的空泡，見圖4(b)所示.新菌株30噸發(fā)酵罐上發(fā)酵總體表現(xiàn)出起步效價高，生產(chǎn)期效價增長快，菌體衰老晚的優(yōu)勢，正好滿足工業(yè)化生產(chǎn)需要.

表5 在30噸發(fā)酵罐K2018S F5-06與K2010 S 17-182發(fā)酵結(jié)果

(a)發(fā)酵罐中春雷霉素效價趨勢變化圖

(b)K2018S F5-06發(fā)酵各階段菌絲形態(tài)圖4 發(fā)酵罐中春雷霉素效價趨勢

3 結(jié)論

本研究利用基因組洗牌育種技術(shù)改良春雷霉素生產(chǎn)菌，成功選育出了3株產(chǎn)量較穩(wěn)定的高產(chǎn)春雷霉素菌株.春雷霉素的發(fā)酵效價提高到19 608 mg/L，提高了37.1%.選育菌株在30噸發(fā)酵罐中發(fā)酵后，表現(xiàn)出起步效價高，生產(chǎn)期效價增幅快，而菌體的衰老晚等優(yōu)勢.傳統(tǒng)誘變育種往往只能是1至幾個基因發(fā)生突變，生產(chǎn)菌株經(jīng)過多年的誘變育種后往往產(chǎn)生疲勞效應，通過傳統(tǒng)育種方法很難大幅度提高產(chǎn)品的產(chǎn)量；而基因組洗牌育種技術(shù)是在若干個親本菌株的全基因組水平上同時進行重組，可以將不同程度變異的遺傳信息整合到1個細胞株中，從而實現(xiàn)菌株良好遺傳信息的集中，使得菌株合成目標產(chǎn)物的產(chǎn)量提高，生產(chǎn)性能可以大幅度改良.因此，基因組洗牌育種技術(shù)較傳統(tǒng)誘變育種對菌株改良的速度更快，并且可以加速工業(yè)生產(chǎn)菌株向人們預期的方向的進化[10,11].