微生物還原法合成納米硒益生菌的篩選及其培養(yǎng)條件優(yōu)化

王麗紅， 楊 輝， 毛建麗， 耿懿璠， 蘇 文， 賀 博

(1.陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院， 陜西 西安 710021; 2.安康市富硒產(chǎn)品研發(fā)中心 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部富硒產(chǎn)品開發(fā)與質(zhì)量控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 陜西 安康 725000 )

0 引言

硒(Se)是一種對生物系統(tǒng)有廣泛影響的重要微量元素，包括抗氧化、抗癌、抗病毒和促進(jìn)生長繁殖等生物學(xué)效應(yīng)[1].缺硒可導(dǎo)致心血管疾病、癌癥、大骨節(jié)病、病毒感染性疾病的發(fā)生[2-4].目前人體補(bǔ)硒的形式主要為傳統(tǒng)的無機(jī)硒、有機(jī)硒.無機(jī)硒一般安全性低，每日服用超過800μg就會引起中毒，生物利用率低.有機(jī)硒是目前主要的補(bǔ)硒形式，有機(jī)硒比無機(jī)硒有較高的生物活性，但價(jià)格高，資源匱乏.急性毒性實(shí)驗(yàn)研究[5]發(fā)現(xiàn)LD50值對無機(jī)硒(亞硒酸鹽)為15.72 mg/kg body weight，而納米硒則為112.98 mg/kg body weight，說明納米硒具有低毒高效的活性優(yōu)勢，作為一種高活性、高安全的補(bǔ)硒產(chǎn)品將成為替代其他形式硒營養(yǎng)制劑或藥劑的最佳選擇.納米硒的合成有化學(xué)法與生物轉(zhuǎn)化法，生物法轉(zhuǎn)化合成的納米硒呈規(guī)則的球狀，且穩(wěn)定性好，不易轉(zhuǎn)化成褐色或黑色的單質(zhì)硒,因而性能優(yōu)于化學(xué)合成的納米硒[6].目前發(fā)現(xiàn)許多微生物如蠟樣芽胞桿菌(BacillusCereus)[7]、假單胞菌(Pseudomonas alcaliphila)[8,9]、地衣芽孢桿菌(BacillusLicheniformis)[10]、干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)[11],枝狀動膠菌(Zooglearamigera)[12]、沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)[9]、大腸桿菌(Escherichiacoli)[13]等能將亞硒酸或硒酸鹽還原成紅色納米單質(zhì)硒.

益生菌是一類能夠通過促進(jìn)腸道菌群平衡，對宿主發(fā)揮有益作用的活的微生物.近年來的研究發(fā)現(xiàn)，越來越多的疾病與腸道菌群失調(diào)相關(guān).調(diào)節(jié)腸道菌群平衡對許多疾病的治療有重要意義，從而使益生菌在胃腸道疾病、肥胖與代謝紊亂相關(guān)疾病、抑郁癥的防治等許多方面得到廣泛應(yīng)用[14].劉紅芳等[15]篩選出中1株乳酸菌，亞硒酸鈉還原效率為46.79%，并應(yīng)用于小鼠生長繁殖及抗氧化研究.本實(shí)驗(yàn)擬從實(shí)驗(yàn)室保存的10株益生菌中篩選能將亞硒酸鈉還原為納米硒的高轉(zhuǎn)化率菌株，10株益生菌種類包括鼠李糖乳桿菌、雙歧桿菌、嗜熱鏈球菌、嗜酸乳桿菌、保加利亞乳桿菌、植物乳桿菌，均為人體腸道中的重要菌群，具有重要的生理功能.采用益生菌轉(zhuǎn)化合成納米硒將益生菌的保健功效和納米的補(bǔ)硒相結(jié)合，后期可制備成高活性納米硒益生菌復(fù)合發(fā)酵菌粉，應(yīng)用于富硒益生菌發(fā)酵產(chǎn)品的開發(fā).

1 材料和方法

1.1 菌種

陜西科技大學(xué)實(shí)驗(yàn)室分離保藏的10種益生菌，包括1#-鼠李糖乳桿菌(Rhamnoselactobacillus)、2#-雙歧桿菌(Bifidobacterium)、3#-嗜熱鏈球菌S2(Thermophilicstreptococcus)、4#-嗜酸乳桿菌 LA5(Lactobacillusacidophilus)、5#-保加利亞乳桿菌L9(Bulgarianlactobacillus)、6#-植物乳桿菌L6(Plantlactobacillus)、7#-保加利亞乳桿菌L13、8#-嗜酸乳桿菌LA3、9#-嗜熱鏈球菌S13、10#-植物乳桿菌L3.

1.2 培養(yǎng)基和試劑

MRS肉湯和MRS培養(yǎng)基購于北京奧博星生物技術(shù)有限公司，亞硒酸鈉山東西亞試劑有限公司，溴化氫、3，3-二氨基聯(lián)苯胺、甲苯、甲酸、乙二胺四乙酸二鈉均為分析純.

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

恒溫培養(yǎng)箱(重慶試驗(yàn)儀器設(shè)備廠)，紫外-分光光度計(jì)(上海光譜儀器有限公司)，高速冷凍離心機(jī)(湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司)，冷凍干燥機(jī)(上海比朗儀器制造有限公司),高分辨場發(fā)射掃描電鏡(美國FEI),X光衍射儀(德國布魯克公司).

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 菌株篩選

將保藏菌種接種MRS肉湯培養(yǎng)基連續(xù)活化3次后，以1%的接種量，接種于亞硒酸鈉終濃度為1 g/L的MRS液體培養(yǎng)基，37 ℃厭氧培養(yǎng)72 h.以亞硒酸鈉還原率及發(fā)酵醪液紅色納米硒的顏色為指標(biāo)，篩選亞硒酸鈉還原率高、發(fā)酵液紅色物質(zhì)生成量多的益生菌.將MRS中亞硒酸鈉終濃度調(diào)整為3 g/L，重復(fù)以上操作，篩選耐受亞硒酸鈉能力強(qiáng)、還原率高的菌株.然后將還原率較高的益生菌在含3 g/L亞酸鈉的固體MRS平板上再劃線培養(yǎng)，挑取紅色單菌落，重復(fù)液體發(fā)酵、固體平板純化3次以保證獲得純化的菌株.

1.4.2 X光衍射儀(XRD)和場發(fā)射高分辨掃描電鏡(SEM)納米硒表征

將嗜酸乳桿菌LA5接種于亞硒酸鈉終濃度為的3 g/L的MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)72 h得到納米硒益生菌發(fā)酵醪液，高速冷凍離心機(jī)離心10 min(10 000 r/min,4 ℃)，棄上清液收取沉淀，再用無菌水洗滌三次離心得濕菌粉，在-20 ℃下預(yù)凍2 h后凍干24 h，進(jìn)行XRD測定和SEM觀察.

1.4.3 亞硒酸鈉濃度對菌體生長和亞硒酸鈉還原率的影響

將嗜酸乳桿菌LA5以1%接種量接種于含有不同濃度亞硒酸鈉(4 g/L、6 g/L、8 g/L、10 g/L、12 g/L)的MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)72 h，每個(gè)處理三個(gè)重復(fù).觀察菌體生長情況、亞硒酸鈉還原率及發(fā)酵液顏色.

1.4.4 發(fā)酵時(shí)間對納米硒形成及亞硒酸鈉還原率的影響

將嗜酸乳桿菌LA5以1%接種量接種于亞硒酸鈉濃度為6 g/L的MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)，觀察菌體在不同培養(yǎng)時(shí)間(12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h)亞硒酸鈉還原率及發(fā)酵液顏色變化.

1.4.5 培養(yǎng)溫度對納米硒形成及亞硒酸鈉還原率的影響

將嗜酸乳桿菌以1%接種量接種于亞硒酸鈉濃度為6 g/L的MRS液體培養(yǎng)基中，不同的溫度下(28 ℃、31 ℃、34 ℃、37 ℃、40 ℃)厭氧培養(yǎng)48 h，觀察菌體生長、亞硒酸鈉還原率及發(fā)酵液顏色變化.

1.4.6 pH對納米硒形成及亞硒酸鈉還原率的影響

將嗜酸乳桿菌以1%接種量接種于亞硒酸鈉濃度為6 g/L的MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h，研究不同在pH(4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0)的培養(yǎng)基中，菌體生長、亞硒酸鈉還原率及發(fā)酵液顏色變化，確定最適合pH.

1.4.7 數(shù)據(jù)測定與處理

硒酸鈉含量測定采用分光光度法測定[16].

采用LSD法對各處理間的差異進(jìn)行多重比較.

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株篩選

在微生物生長繁殖過程中中加入亞硒酸鈉，低濃度可為菌體提供所需的硒元素，滿足菌體生長，高濃度的硒鹽會影響到培養(yǎng)液的電極電位、細(xì)胞膜的通透性和滲透壓，從而對菌體的生長產(chǎn)生負(fù)面的影響.自然界中不同菌種對亞硒酸鈉的耐受和轉(zhuǎn)化形成納米硒的能力不同，采用微生物培養(yǎng)轉(zhuǎn)化合成納米硒需對菌體的亞硒酸鈉耐受性進(jìn)行考察，或者對菌株進(jìn)行亞硒酸鹽的耐受性馴化，從而篩選出高活力菌株.本研究將實(shí)驗(yàn)室保存的10種益生菌接種于亞硒酸鈉終濃度為1 g/LMRS發(fā)酵72 h后，觀察發(fā)酵醪液顏色和亞硒酸鈉還原率結(jié)果如表1所示.

表1 1 g/L亞硒酸鈉濃度下益生菌發(fā)酵醪液顏色及亞硒酸鈉的還原率

從表1可以看出，在亞硒酸鈉濃度較低時(shí)，益生菌普遍能夠轉(zhuǎn)化亞硒酸鈉形成紅色的納米硒顆粒，但不同菌種還原能力有較大差異，其中嗜熱鏈球菌S2(3#)、嗜酸乳桿菌LA5(4#)、嗜酸乳桿菌LA3(8#)對亞硒酸鈉的還原能力較強(qiáng)，紅色納米硒形成較多.說明嗜酸乳桿菌有較強(qiáng)轉(zhuǎn)化能力，可能跟菌體內(nèi)所含的亞硒酸鈉還原酶活力較高相關(guān).

進(jìn)一步將這三種菌接種于亞硒酸鈉終濃度為3 g/LMRS液體發(fā)酵72 h后，結(jié)果如表2所示.

許多益生菌能耐受低濃度的亞硒酸鈉并還原亞硒酸鹽形成納米硒，但隨著亞硒酸鈉濃度的升高，硒對菌體的毒性增強(qiáng)，最終抑制菌體生長，影響納米硒的轉(zhuǎn)化率.當(dāng)提高亞硒酸鈉到3 g/L后，嗜酸乳桿菌轉(zhuǎn)化能力仍然較強(qiáng)，形成的紅色納米顆粒較多.其中嗜酸乳桿菌LA5菌體的亞硒酸鈉還原率最高94.2%，形成的紅色納米硒最多.發(fā)酵液放置4 ℃冰箱溫下2周后，醪液依然呈紅色，表明嗜酸乳桿菌LA5轉(zhuǎn)化的納米硒非常穩(wěn)定，不容易轉(zhuǎn)變成其他硒形式.

表2 3 g/L亞硒酸鈉濃度下益生菌發(fā)酵醪液顏色及亞硒酸鈉的還原率

2.2 X光衍射儀(XRD)測試結(jié)果

將嗜酸乳桿菌LA5納米硒凍干后制備的納米硒粉末進(jìn)行XRD光譜分析，結(jié)果如圖1所示.由圖1可知，嗜酸乳桿菌轉(zhuǎn)化形成的納米硒為無定形態(tài),無明顯的結(jié)晶衍射峰，無定形態(tài)納米硒反應(yīng)活性高于晶體形態(tài)，有利于后期產(chǎn)品的開發(fā).

圖1 納米硒凍干粉XRD圖譜

2.3 高分辨場發(fā)射掃描電鏡(SEM)

將嗜酸乳桿菌LA5納米硒凍干后制備的納米硒粉末進(jìn)行SEM光譜分析，結(jié)果如圖2和圖3所示.

圖2 嗜酸乳桿菌LA5制備納米硒凍干粉的SEM圖(200 000×)

圖3 嗜酸乳桿菌LA5制備的納米高倍SEM圖(500 000×)

從圖2可以看出，在菌體周圍分散著大量納米硒顆粒，顆粒呈規(guī)則的球形.圖3中對較大的納米顆粒測定直徑，可見嗜酸乳桿菌LA5轉(zhuǎn)化形成的納米硒直徑約80～150 nm，王華麗[17]研究發(fā)現(xiàn)，納米硒粒徑在200 nm以內(nèi)才具有生物學(xué)效應(yīng).本實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)化的嗜酸乳桿菌LA5納米硒顆粒更小，為后續(xù)研究納米硒益生菌在體內(nèi)生物活性奠定基礎(chǔ).

2.4 亞硒酸鈉濃度對菌體生長和亞硒酸鈉還原率的影響

正如2.1中的分析，亞硒酸鈉加入培養(yǎng)基中，將會對菌株生長產(chǎn)生正負(fù)兩方面的作用，因此，需要在不影響菌體生長的情況確定合成納米硒適宜亞硒酸鈉濃度.將嗜酸乳桿菌LA5接種于不同濃度亞硒酸鈉濃度的培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)72 h，觀察菌體的生長情況，亞硒酸濃度對其還原率的影響如圖4所示.

圖4 亞硒酸鈉濃度對其還原率的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，亞硒酸鈉濃度對嗜酸乳桿菌LA5有較大影響.隨著濃度增加發(fā)酵液中形成的紅色納米硒顆粒逐漸增多，6 g/L、8 g/L時(shí)，紅色物質(zhì)最多，但當(dāng)超過10 g/L，菌體生長緩慢，紅色物質(zhì)減少，亞硒酸鈉濃度為12 g/L時(shí)，發(fā)酵液較澄清，說明菌體生長受到明顯抑制，形成紅色納米硒很少.綜合考慮亞硒酸鈉的利用率與嗜酸乳桿菌LA5菌體活力，10 g/L亞硒酸鈉濃度轉(zhuǎn)化的納米硒最多，但是當(dāng)濃度提高到8 g/L時(shí)，亞硒酸鈉還原率開始下降，說明此時(shí)菌體生長受到了抑制，為了利于后期納米硒益生菌發(fā)酵菌粉制備時(shí)菌體有較高的活力，確定6 g/L亞硒酸鈉濃度為最佳濃度，本研究后續(xù)的合成條件優(yōu)化發(fā)現(xiàn)，在最適宜條件下亞硒酸鈉還原率在此濃度下也能達(dá)到90%左右.

2.5 發(fā)酵時(shí)間對納米硒形成及亞硒酸鈉還原率的影響

在微生物法合成納米硒的過程中，微生物中酶或酶的還原性代謝產(chǎn)物起著重要作用，從而將亞硒酸鈉還原形成納米硒，還原性酶可在菌體生長過程中形成，也可以在進(jìn)入穩(wěn)定期后產(chǎn)生，研究不同發(fā)酵時(shí)間納米硒的形成變化將有助于確定菌體生長和還原性酶的合成關(guān)系.將嗜酸乳桿菌LA5接種于亞硒酸鈉濃度為6 g/L的MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)，觀察菌體在不同培養(yǎng)時(shí)期發(fā)酵液顏色變化及亞硒酸鈉還原率，菌體發(fā)酵時(shí)間對亞硒酸鈉還原率的影響如圖5所示.

圖5 發(fā)酵時(shí)間對亞硒酸鈉還原率的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)嗜酸乳桿菌LA5生長和納米硒合成相偶聯(lián)，隨著菌體生長納米硒合成，說明菌體在生長繁殖過程可能產(chǎn)生的某種酶將亞硒酸鈉轉(zhuǎn)化成納米硒顆粒，當(dāng)菌體進(jìn)入穩(wěn)定期后，紅色納米硒增加緩慢.發(fā)酵48 h時(shí)發(fā)酵液中紅色納米硒增加最多，還原率較高82.1%，發(fā)酵48 h后，還原率的增加較慢，菌體生長進(jìn)入了穩(wěn)定期，因此確定48 h是菌體生長和還原亞硒酸鈉的最適發(fā)酵周期.

2.6 培養(yǎng)溫度對納米硒形成及亞硒酸鈉還原率的影響

溫度是影響一切化學(xué)反應(yīng)的重要因素，溫度不僅影響菌體的生長，更對代謝產(chǎn)物的形成產(chǎn)生較大影響，因此，通過考察溫度對納米硒合成的影響確定最佳溫度.將嗜酸乳桿菌LA5接種于亞硒酸鈉濃度為6 g/L的MRS液體培養(yǎng)基中，不同的溫度下厭氧培養(yǎng)48 h.圖6給出了溫度對亞硒酸鈉還原率的影響.

圖6 培養(yǎng)溫度對亞硒酸還原率的影響

結(jié)果表明，溫度對菌體生長和亞硒酸鈉的還原率有一定影響，隨著溫度升高，轉(zhuǎn)化率升高，當(dāng)溫度為37 ℃時(shí)還原率最高，此時(shí)菌體生長速度最快，發(fā)酵液紅色納米硒積累較多，進(jìn)一步說明菌體最適的生長溫度和亞硒酸鈉的轉(zhuǎn)化溫度基本一致.因此確定為適溫度為37 ℃.

2.7 pH對納米硒形成及亞硒酸鈉還原率的影響

pH影響菌體細(xì)胞膜的帶電狀況和通透性，在亞硒酸根還原為單質(zhì)硒的反應(yīng)中，氫離子參與了反應(yīng)過程，因此pH對菌體生長和亞硒酸等氧化電位產(chǎn)生明顯的影響，進(jìn)一步影響亞硒酸鈉被還原速度和還原率，因而需要考察pH對還原率的影響.將嗜酸乳桿菌LA5接種于亞硒酸鈉濃度為6 g/L的MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h，在不同pH下觀察菌體生長、發(fā)酵液顏色變化，圖7顯示了pH對亞硒酸鈉還原率的影響.

圖7 pH對亞硒酸還原率的影響

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)pH 在酸性范圍4.5～7之間時(shí)，菌體均能進(jìn)行正常生長，并能還原亞硒酸鈉形成納米硒.當(dāng)pH為6.5時(shí)，菌體生長良好，產(chǎn)生的紅色物質(zhì)最多，亞硒酸鈉還原率達(dá)到89.8%.該結(jié)果說明,嗜酸乳桿菌LA5在pH為6.5生長良好，并能對亞硒酸鈉進(jìn)行快速還原，因此，6.5確定為最佳pH.

3 結(jié)論

(1)益生菌普遍能耐受一定亞硒酸鈉，并能將亞硒酸鈉還原成紅色納米硒.在供試的實(shí)驗(yàn)室10株益生菌中嗜酸乳桿菌LA5還原亞硒酸鈉的能力最強(qiáng).XRD和SEM分析表明所形成的納米硒為無定形態(tài)，呈規(guī)則的球形，直徑約80～150 nm.

(2)亞硒酸鈉濃度、培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)溫度、pH是影響納米硒形成的重要因素，通過對嗜酸乳桿菌LA5轉(zhuǎn)化納米硒條件進(jìn)行優(yōu)化，確定亞硒酸鈉加量6 g/L，培養(yǎng)時(shí)間為48 h，溫度為37 ℃，pH為6.5為形成納米硒的適宜條件，在此條件下亞硒酸鈉還原率可達(dá)到89.8%.

采用嗜酸乳桿菌LA5轉(zhuǎn)化合成納米硒，發(fā)酵周期短，納米硒轉(zhuǎn)化率高，所形成的納米硒益生菌同時(shí)具有益生菌保健功效和納米硒的最佳補(bǔ)硒形式，并可制備成高活性納米硒益生菌復(fù)合發(fā)酵菌粉，應(yīng)用于富硒益生菌產(chǎn)品的開發(fā).這類產(chǎn)品不僅富含易于人體腸道的益生菌、礦物質(zhì)、維生素、膳食纖維，更增添了納米硒雙重營養(yǎng)保健功能，并將為人類健康水平的提高做出貢獻(xiàn).